地黃中益母草苷對食管癌細胞增殖抑制作用的研究

田平平，潘 穎，施 維，劉 佳，于春雷*

（1.安徽醫(yī)學高等?？茖W校，安徽合肥 230601；2.川北醫(yī)學院，四川南充 637000）

食管癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，目前尚無有效的治療方法，發(fā)病呈逐年上升趨勢[1]。在我國90%以上食管癌病例為鱗狀細胞癌亞型，少數(shù)為腺癌亞型，且絕大多數(shù)食管癌患者確診時已處于癌癥中晚期[2]。目前，食管癌的治療手段主要有包括手術、放射治療和化療等，然而上述治療措施的臨床療效有限[3]。食管癌復發(fā)患者一般會對曾用化療藥物表現(xiàn)出一定程度的耐藥性，因此，研發(fā)新型高效低毒的食管癌治療藥物是改善當前食管癌治療困境的一種有效途徑。

當前，有關新型天然抗腫瘤藥物的開發(fā)越來越受到關注[4]。地黃（Rehmannia glutinosa）是玄參科多年生草本植物，有悠久的藥用歷史。近年來隨著提取分離技術的革新，對于地黃的藥用價值認識更加透徹[5]。益母草苷（Ajugol）是一種環(huán)烯醚糖苷化合物，能從地黃中分離提取，已被證明是多種中藥的有效成分[6]，已被證實具有護肝、清熱涼血、抗菌功效[7]。該次研究中，采用不同濃度的Ajugol 在體外作用于食管癌TE-1 細胞、Eca-109 和KYSE-150 細胞，通過CCK-8 試劑盒檢測Ajugol 對食管癌細胞生長抑制作用。為了進一步探究其抑制細胞增殖作用機制，筆者采用流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率，確定Ajugol 是否通過促進細胞凋亡，影響細胞周期來誘導食管癌細胞死亡，以期為地黃在食管癌的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人食管癌細胞TE-1、Eca-109、KYSE-150 均購于中國科學院細胞庫。

Ajugol 試劑購于成都瑞芬思生物技術有限公司，用DMSO（購于上海生物工程技術有限公司），溶解分裝后-80℃保存。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素及鏈霉素雙抗均購自Hyclone 公司。CCK-8 試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA 裂解液（強）、細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

熒光倒置顯微鏡（CKX41）為Olympus 公司產(chǎn)品，Spectramax190 酶標儀為Molecular Devices 公司產(chǎn)品，流式細胞儀為BD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)。將TE-1、Eca-109、KYSE-150 細胞培養(yǎng)在加有10%胎牛血清及雙抗（青霉素及鏈霉素）的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，置于37℃，含5% CO2且箱底有無菌去離子水的恒溫培養(yǎng)箱中。所有細胞相關操作均在無菌操作臺內進行。

1.2.2 CCK-8 比色法。將生長狀態(tài)良好的TE-1、Eca-109、KYSE-150 細胞，按3×104/mL的密度接種在96 孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，用不同濃度的Ajugo（100、25、6.25、1.56、0.39 μM）處理細胞；以未經(jīng)任何藥物處理的TE-1、Eca-109、KYSE-150 細胞作為空白對照組（Ajugo 0 μM）：以體積分數(shù)為0.6% DMSO 處理TE-1、Eca-109、KYSE-150細胞作為對照組，每組均設置3 個復孔。將孔板放入培養(yǎng)箱內藥物作用48 h 后取出，在每孔內加入CCK-8 溶液10 μL，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)1 h。取出孔板，使用酶標儀測定各孔吸光度OD 值，波長選擇490 nm。用相關軟件計算細胞生長的存活率：細胞存活率（%）=（試驗組OD值-空白組OD 值）/（試照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測Ajugol 對細胞凋亡的影響。當10 cm培養(yǎng)皿中的Eca-109 細胞生長融合度為80%時，收集并消化細胞，將大概1×106細胞接種到六孔板中，接種24 h后給予不同處理，試驗組加入不同濃度的Ajugol（0、2、4、8 μM），以DMSO 為空白對照，處理結束后將6 孔板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h 后吸掉舊的培

養(yǎng)基，加入0.25%胰酶消化細胞，然后收集細胞懸液于離心管內，1 000 rpm，5 min，去掉上清液，以PBS 液洗滌，再次離心，反復操作2 次。用PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)，取5 萬～10 萬重懸的細胞，1 000 rpm，5 min，棄掉上清液，加入195 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻之后，再加入10 μL 碘化丙啶染色液，室溫（20℃～25℃）避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，上機（BD FACScaliber）檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測Ajugol 對細胞周期的影響。取對數(shù)生長期的Eca-109 細胞，將大概1×106細胞接種到六孔板中，接種24 h 后給予不同處理，實驗組加入不同濃度的Ajugol（0、2、4 μM），以DMSO 為空白對照，將6 孔板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，消化收集細胞于離心管中，低溫4℃，300 rpm 離心5 min，去上清液，加入2 mL PBS 重懸細胞，低溫4℃，300 rpm 離心5 min。細胞固定：去上清液，加入1 mL PBS 重懸細胞，移液器吹打均勻后，輕柔渦旋的同時緩慢加入3 mL 無水乙醇（預冷至-20℃），4℃固定2 h，離心10 min，棄去乙醇。加入5 mL PBS 洗滌細胞，低溫4℃，300 rpm 離心10 min，棄去上清液，殘留約50 μL 左右的PBS，加入0.5 mL RNaseA 溶液（PBS，200 μg/mL RNaseA）重懸細胞，在37℃放置5～10 min以去除RNA。加入0.5 mL PI 染色液（PBS，100 μg/mL PI），避光37℃孵育15 min，過濾后置冰上，避光，上機（BD FACScaliber）檢測。

2 結果與分析

2.1 Ajugol 抑制食管癌細胞的增殖

用不同濃度的Ajugol（0.39、1.56、6.25、25、100 μM）處理TE-1、KYSE-150、Eca-109 細胞48 h 后，采用CCK8 法檢測。結合表1、2 及圖1 可以看出：在體外試驗中，Ajugol對3 種食管癌細胞均有抑制作用，當藥物濃度從低濃度至高濃度，生存率呈降低趨勢，其抑制作用呈濃度依賴型。

圖1 不同濃度Ajugol 對食管癌細胞增殖作用的劑量-效應曲線

表1 CCK-8 法檢測不同Ajugol 濃度作用于食管癌細胞的OD 值

2.2 Ajugol 對食管癌細胞凋亡具有促進作用

不同濃度（0、2、4、8 μM）Ajugol 作用于Eca-109 細胞48 h 后，由圖2 可見細胞均有不同程度的凋亡，且隨著藥物的濃度從低到高細胞的凋亡率增加，表明細胞的凋亡率與藥物濃度成正相關。Eca-109 細胞各組的凋亡率分別為（3.82±1.31）%、（8.64±1.82）%、（24.28±4.35）%、（70.34±3.85）%，見圖2。

圖2 不同濃度Ajugol 對Eca-109 細胞凋亡率變化的影響

2.3 Ajugol 使食管癌細胞周期被阻滯在G2/M 期

不同濃度Ajugol（0、2 和4 μM）作用于食管癌細胞48 h 后，結果如圖3，F(xiàn)ACS 結果顯示細胞周期G1，S 期的細胞隨著藥物濃度的升高，細胞數(shù)目出現(xiàn)減少的趨勢，即與藥物濃度呈負相關，而G2 期細胞隨著藥物濃度的升高，其細胞數(shù)目呈現(xiàn)增加的趨勢，表明細胞增殖周期被阻滯在G2/M 期。描述各細胞周期的具體比例變化如表3所示。

表3 Eca-109 細胞周期中各期所占比例 %

圖3 不同濃度Ajugol 對Eca-109 細胞周期的影響

表2 CCK-8 檢測不同濃度Ajugol 對食管癌細胞生存率的影響 %

3 討論

食管癌（EC）是癌癥發(fā)病率世界排名第7、致死率排名第6的一種消化道癌癥，由于飲食習慣、環(huán)境因素、應激等因素，每年都有更多的人被診斷為食管癌[8]。該次研究發(fā)現(xiàn)Ajugol 在體外對食管癌細胞增殖抑制作用呈濃度依賴型。生物體內各種細胞組織通過凋亡與增值來維持體內的平衡，一旦平衡被打破就會導致身體出現(xiàn)很多疾病比如腫瘤癌癥等[9]，而抗腫瘤藥物可以使細胞出現(xiàn)程序性死亡從而達到治療腫瘤的效果[10]。該次研究證明Ajugol 作用于食管癌細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡且與藥物濃度成正相關，并讓癌細胞增殖周期被阻滯在G2/M 期。綜上所述，Ajugol 表現(xiàn)出較好的抗腫瘤細胞活性。

該次研究加強了人們對傳統(tǒng)中藥抗癌的認識，如研究已發(fā)現(xiàn)地黃可以提高宮頸癌、乳腺癌患者免疫調節(jié)機制[11-12]，而地黃中可大量提取Ajugol，為地黃作為抗食管癌的新型藥物提供理論依據(jù)。后續(xù)研究可進一步對Ajugol體內抗癌活性及作用機制探索，并可結合臨床放射治療和化療技術，探討中西醫(yī)結合新療法，這將為天然植物來源的抗癌藥物研發(fā)提供新的方向。