多指標(biāo)-響應(yīng)面法優(yōu)選山茱萸酒制工藝*

黃 莉，楊 磊，李玉星，肖望重，于 慧，戴 冰

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南交通工程學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，具補(bǔ)益肝腎、澀精固脫功效[1]。縱觀歷代文獻(xiàn)，山茱萸的炮制方法主要有陰干、打碎、去核、炒、酒制（酒炒、酒蒸、酒燉、酒浸）、鹽炒、熬、雄羊油炙等，其中酒萸肉在臨床較為常用，酒制后其滋陰補(bǔ)腎作用增強(qiáng)[2]。其中所含苷類(lèi)成分（莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷等）是其增強(qiáng)機(jī)體免疫，補(bǔ)益肝腎的主要藥效成分[3]。

傳統(tǒng)的酒萸肉炮制方法為取山萸肉用20%黃酒拌勻，置于適宜容器內(nèi)，密閉，隔水加熱，燉至酒被吸盡，色變黑潤(rùn)，取出干燥即可，一般情況下山萸肉的悶潤(rùn)時(shí)間為2 h，蒸制時(shí)間為4 h[4]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的炮制品有山萸肉和酒萸肉，且規(guī)定酒萸肉的炮制為每100 kg待炮制品，用黃酒10～20 kg。然而，目前已開(kāi)展的酒萸肉炮制工藝研究多集中在黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間及蒸制時(shí)間等，鮮有考察黃酒酒精度對(duì)其工藝、質(zhì)量及功效的影響[5-9]。

本研究考察了輔料黃酒的酒精度、黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間及蒸制時(shí)間對(duì)山茱萸中莫諾苷、馬錢(qián)苷及獐芽菜苷多個(gè)指標(biāo)成分含量的影響，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選山茱萸酒制工藝，以期為酒萸肉的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260 infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（含G7111A四元泵、G7117C DAD檢測(cè)器、G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AUX220型電子分析天平（日本SHIMADZU公司）；AUX220D電子分析天平（日本SHIMADZU公司）；0.45 μm微孔濾膜（日本SHIMADZU公司）；HCP-400A型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠(chǎng)）。

1.2 試藥 山茱萸（湖南春可回中藥飲片有限公司，批號(hào)：191201）經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)張?jiān)Ｃ窠淌阼b定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。莫諾苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS0500-0025MG）；馬錢(qián)苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111640-201005）；獐牙菜苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)：111742-200501）；乙腈為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170104）；磷酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)）；其他試劑均為分析純。龍泉花雕酒，購(gòu)自大連長(zhǎng)興島酒業(yè)有限公司，采用密度瓶法測(cè)定其酒精度。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備[10]取酒萸肉粉末（過(guò)四號(hào)篩）1 g，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液定容至刻度，稱(chēng)質(zhì)量，超聲提?。üβ剩?00 W，頻率：53 kHz）45 min，取出，冷卻后再稱(chēng)定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)定莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐芽菜苷對(duì)照品適量，置50 mL棕色容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容成質(zhì)量濃度分別為1.45、1.40、1.05 mg/mL的對(duì)照品母液，置于4 ℃冰箱，備用。分別精密吸取上述母液0.4 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為58、56、42 μg/mL。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Hypersil C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.3%磷酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～25 min，15%A～20%A）；流速為1.0mL/min，柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在上述色譜條件下，精密吸取溶劑空白溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入色譜儀進(jìn)行分析，記錄圖譜。結(jié)果表明，溶劑空白溶液色譜圖無(wú)干擾；混合對(duì)照品溶液色譜圖中，莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷的相對(duì)保留時(shí)間分別為5.45、9.84、11.55 min；在供試品溶液色譜圖中，各峰分離度均大于1.5，且理論塔板數(shù)均大于10 000，故該色譜條件的系統(tǒng)適用性良好。（見(jiàn)圖1）

圖1 各樣品溶液HPLC 圖

2.3 山茱萸的酒制炮制方法 取生山茱萸，凈制，除去果核、果梗、霉變品、蟲(chóng)蛀品等殘次品，取凈山萸肉200 g，照酒蒸（《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則0213）蒸至酒吸盡，即得。

3 方法學(xué)考察

3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷對(duì)照品母液各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于同一5 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，得到不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐芽菜苷的線(xiàn)性方程分別為：Y=5 310X-27.835（r=0.999 6）、Y=4 079.7X+1.793 3（r=0.999 7）、Y=991.4X+24.46（r=0.999 2）。結(jié)果表明莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷分別在29～174、28～168、21～126 μg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.2 精密度試驗(yàn) 精密量取莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定6次峰面積值，RSD分別為0.37%、1.96%、1.54%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，于室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐芽菜苷的峰面積值。RSD分別為1.50%、0.35%、1.75%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一酒萸肉樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積值，并計(jì)算其含量。莫諾苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.52%，RSD為1.49%；馬錢(qián)苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.98%，RSD為0.3%；獐牙菜苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.155%，RSD為1.88%。結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷含量的酒萸肉粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，平行稱(chēng)取6份，每份按1∶1的比例分別加入適量對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。記錄峰面積，并計(jì)算平均回收率與RSD。莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷的平均回收率分別為98.92%、99.12%、100.23%，RSD分別為1.58%、1.87%、1.69%（n=6），結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高。（見(jiàn)表1）

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選山茱萸酒制工藝

4.1 總評(píng)歸一值計(jì)算[11]以莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷為指標(biāo)，采用Hassan法進(jìn)行歸一化處理，莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷取值越大越好，單指標(biāo)評(píng)價(jià)值（d）按式（1）進(jìn)行計(jì)算，總評(píng)歸一值按式（2）換算。

其中：d為單指標(biāo)評(píng)價(jià)值，d1為莫諾苷指標(biāo)評(píng)價(jià)值，d2為馬錢(qián)苷指標(biāo)評(píng)價(jià)值，d3為獐牙菜苷指標(biāo)評(píng)價(jià)值，Yi為指標(biāo)中第i個(gè)值，Ymin為指標(biāo)中最小值，Ymax為指標(biāo)中最大值。

4.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以黃酒酒精度、黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間和蒸制時(shí)間為考察因素，以莫諾苷、馬錢(qián)苷及獐牙菜苷含量總評(píng)歸一值為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行4因素5水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素與水平見(jiàn)表2，星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素與水平

表3 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

4.3 模型擬合與方差分析 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，采用使用Design-Expert 11軟件，以總評(píng)OD值為因變量對(duì)各因素進(jìn)行多元二項(xiàng)式擬合，得二次多項(xiàng)回歸擬合方程為OD=0.651 667+0.069333A-0.07217B+0.054833C-0.02817D+0.02775AB+0.06AC+0.03325AD+0.024 875BC+0.018 625BD+0.027 375CD-0.042 25A2-0.040 13B2-0.116 63C2-0.078 13D2（R2=0.824 5，P＜0.002）。方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 二次多項(xiàng)式回歸方程模型方差分析

表4結(jié)果顯示，模型P=0.001 8＜0.01，說(shuō)明所采用的回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)P=0.072 7＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，故該方程擬合的模型可用于預(yù)測(cè)山茱萸酒制最佳工藝。其中黃酒用量（B）、C2、D2項(xiàng)P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；黃酒酒精度（A）、悶潤(rùn)時(shí)間（C）項(xiàng)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2項(xiàng)均不顯著，說(shuō)明單因素對(duì)OD值的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)交互項(xiàng)，且因素影響順序?yàn)锽＞A＞C＞D。

4.4 響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸酒制工藝 根據(jù)響應(yīng)曲面分析繪出各因變量的曲面，結(jié)果顯示最佳工藝條件為A=14%、B=24 kg，C=159 min、D=214.9 min，OD=0.714。綜合實(shí)際操作考慮，確定最佳炮制工藝為黃酒酒精度為14%，黃酒用量為藥材的24%，悶潤(rùn)時(shí)間為160 min，蒸制時(shí)間為215 min。（見(jiàn)圖2）

圖2 A、B、C、D 因素對(duì)OD 值影響的響應(yīng)面3D 圖

4.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)選出的最佳炮制工藝條件按“2.3”項(xiàng)下平行炮制3份酒萸肉，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷含量，計(jì)算其OD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該模型具備較高的準(zhǔn)確性和精密性，可較好地預(yù)測(cè)酒制山茱萸的炮制工藝，其所優(yōu)選工藝有效、可行，且穩(wěn)定性較好，其驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

5 討 論

中藥炮制工藝多采用單因素考察[12]、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[5,8]、均勻設(shè)計(jì)法[13]、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法[10-11]等模型進(jìn)行優(yōu)化，其中單因素考察法難以全面觀察整體優(yōu)化效果，正交設(shè)計(jì)存在試驗(yàn)精密度不夠、各因素間交互作用無(wú)法考察、試驗(yàn)次數(shù)多等問(wèn)題。而星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法能同時(shí)進(jìn)行線(xiàn)性、二項(xiàng)多項(xiàng)式或更高次項(xiàng)的模擬擬合，具有全面考察多因素交互作用、試驗(yàn)次數(shù)少、預(yù)測(cè)性高等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。故筆者采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化出的山茱萸酒制工藝穩(wěn)定可控。

輔料黃酒是用糯米、酒藥、紅曲和水為原料，經(jīng)釀造而成的發(fā)酵酒，為淡黃色澄明液體，味醇?xì)庀?，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)酒精度數(shù)）一般要求8%以上[16]。乙醇作為兩親性溶劑，能在藥材悶潤(rùn)一定時(shí)間后產(chǎn)生助溶或吸附作用，且濃度不同時(shí)會(huì)使多糖、皂苷、黃酮類(lèi)化學(xué)成分的浸出效應(yīng)差異化，進(jìn)而影響酒制后藥材的臨床療效。研究發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)黃酒各廠(chǎng)家的釀酒工藝不同，可影響輔料黃酒的含糖量、酒精度、pH值、總酸、β-苯乙醇等[17-18]。山茱萸產(chǎn)自浙江、陜西、河南等地，氣候、土壤、生長(zhǎng)環(huán)境等因素不同均可改變其藥效成分含量，產(chǎn)生不同的補(bǔ)腎增效作用[19-20]。筆者選擇同一廠(chǎng)家生產(chǎn)的不同酒精度的黃酒作為輔料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輔料黃酒的酒精度、用量均對(duì)酒萸肉苷類(lèi)成分有較大影響。故建議《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)范山茱萸酒制工藝中輔料黃酒的酒精度、黃酒用量及悶潤(rùn)時(shí)長(zhǎng)，以保障酒萸肉的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用質(zhì)量。