知黃潰瘍合劑對復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍大鼠創(chuàng)面修復(fù)的作用及對MCP-1/CCR2/NF-κB通路的影響*

耿乾書，姚 娜，王 雯，李慶隆

（唐山市協(xié)和醫(yī)院，河北 唐山 063000）

復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍?yōu)榭谇豢谱畛Ｒ姷目谇火つぜ膊?，發(fā)生率位居口腔黏膜病首位，主要表現(xiàn)為口腔黏膜反復(fù)出現(xiàn)孤立橢圓形或者圓形淺表潰瘍，可單發(fā)或多發(fā)于口腔黏膜任意位置，有復(fù)發(fā)性、周期性特征[1-2]。當(dāng)前，西醫(yī)對復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍的治療方法雖多，但無特效療法[3]。中醫(yī)對復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍早有認(rèn)知，認(rèn)為外感六淫燥火、內(nèi)傷臟腑熱盛為其主要致病因素，提出了諸多治療方劑，其中知黃潰瘍合劑療效顯著[4]，但其對復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)機制尚不清楚。故本研究制備了復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍大鼠模型，研究知黃潰瘍合劑的具體作用及機制，以期為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SPF級雄性健康SD大鼠70只，體質(zhì)量260～280 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室溫24～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替照明，實驗開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究已經(jīng)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：20200115。

1.2 藥物與試劑 弗氏完全佐劑（上海雷浩信息科技有限公司，貨號：F5881）；左旋咪唑水溶液（山東博山制藥有限公司，批號：170325）；知黃潰瘍合劑（四川省南充市中心醫(yī)院，批號：170323）；大鼠γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號：20190411）、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA試劑盒（批號：20190406）均購自上海江萊生物科技有限公司；大鼠T淋巴細(xì)胞亞群試劑盒（北京科瑞美科技有限公司，批號：20190412）；APC-CD3抗體（批號：20190621）、PE-CD4抗體（批號：20910814）、FITC-CD8抗體（批號：20190119）均購自上海研生實業(yè)有限公司；10%溶血素（美國Beckman Coulter公司，批號：20180115）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（中國碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20190519）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（批號：20190811）、細(xì)胞裂解液（批號：20181214）均購自中國碧云天生物公司；兔抗大鼠β-actin（批號：20190517）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）（批號：20190305）、趨化因子受體-2（2CC-Chemokine Receptor 2，CCR2）（批號：20190905）、核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）（批號：20190817）、磷酸化型NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體（一抗）（批號：20190929）均購自西寶生物科技股份有限公司；辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（北京百奧萊博科技有限公司，批號：20190425）。

1.3 主要儀器 FSH-2可調(diào)高速勻漿機（常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；5415D型離心機（廣州和竺生物科技有限公司）；Leica RM2235超薄石蠟切片機（德國徠卡微系統(tǒng)有限公司）；EPICS-reg ALTRA型流式細(xì)胞儀（山東博科干細(xì)胞應(yīng)用研究院有限公司）。

1.4 造模與分組 70只大鼠隨機選取15只用于制作復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍抗原，具體操作：脫頸處死大鼠，無菌操作剝離大鼠口腔黏膜，生理鹽水沖洗，加入10倍量的生理鹽水，采用高速勻漿機2 000 r/min勻漿20 min，制好的黏膜勻漿置于-20 ℃保存。將等量的弗氏完全佐劑和黏膜勻漿混勻，期間順時針方向逐滴加入研磨，研磨至乳劑。其余55只大鼠隨機選取10只作為對照組，剩余45只采用免疫法制備復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍大鼠模型[5]，常規(guī)消毒45只造模大鼠脊柱兩側(cè)，皮內(nèi)注射上述乳劑，每只注射2點，每點0.1 mL，每周注射1次，連續(xù)注射8周。大鼠口腔黏膜多處腫脹，下齒齦有充血、紅腫、潰瘍創(chuàng)面，即為造模成功。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組，每組10只。

1.5 實驗給藥 造模成功24 h后開始給藥，大鼠的等效劑量為成人劑量6.3倍，故左旋咪唑組大鼠予以2 mL左旋咪唑水溶液灌胃，20 mg/kg；知黃潰瘍合劑低、高劑量組大鼠分別予以2 mL知黃潰瘍合劑灌胃，原生藥劑量分別為4、8 g/kg；模型組、對照組大鼠予等體積生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)給藥20 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠口腔潰瘍變化 觀察各組大鼠造模后口腔潰瘍數(shù)目、干預(yù)后潰瘍愈合程度，其中口腔黏膜潰瘍組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)見表1，計算各組大鼠口腔潰瘍數(shù)目平均值、潰瘍愈合評分平均值。

1.6.2 大鼠血清炎癥因子 末次干預(yù)后，大鼠禁食不禁水16 h，2%戊巴比妥鈉麻醉后，脫頸處死，在腹主動脈取血5 mL置入試管內(nèi)，室溫下靜置30 min，離心機3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，分離血清。按ELISA試劑盒說明書檢測血清IFN-γ、IL-17含量，在波長450 nm酶標(biāo)儀上讀取各孔光密度值，以光密度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖，根據(jù)樣品光密度值計算濃度范圍。

1.6.3 大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群 取大鼠外周血100 μL置入流式管底，再各取20 μL APC-CD3抗體、PE-CD4抗體、FITC-CD8抗體置入流式管底，與全血混勻，室溫避光孵育20min。每管加1倍溶血素2 mL，混勻后避光靜置10 min，1 000 r/min離心5 min，半徑10 cm，棄上清，加2 mL PBS洗液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.6.4 大鼠口腔黏膜組織病理變化 大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切取對照組大鼠口腔黏膜組織、造模大鼠口腔黏膜潰瘍組織，體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，生理鹽水沖洗組織塊上黏液、血液，展平后維持原型。4%中性甲醛固定，梯度脫水、浸蠟、包埋，最后切片，厚度為4 μm，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.5 大鼠口腔黏膜組織MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表達(dá) 按試劑盒說明書提取大鼠口腔黏膜組織蛋白，BCA法測定蛋白總量，蛋白與上樣緩沖液混勻后，沸水浴10 min使之變性，冷卻后離心取上清，取60 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)60 min，封閉液室溫孵育2 h，加入1∶1 000稀釋的兔抗大鼠β-actin、MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65抗體（一抗），4 ℃搖床過夜，加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，常溫孵育30 min，暗室中曝光、顯影，用凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶，MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值，即為目的蛋白相對表達(dá)量，并計算p-NF-κB p65/NF-κB比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，如Levene檢驗方差齊，采用單因素方差分析，再用LSD-t行兩兩比較，如Levene檢驗方差不齊，改用welch檢驗，再用Dunnett T3檢驗進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠口腔潰瘍變化比較 5組大鼠口腔潰瘍數(shù)目、潰瘍評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，左旋咪唑組、黃潰瘍合劑低劑量組、知柏潰瘍合劑高劑量組大鼠潰瘍數(shù)目減少，潰瘍評分降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低、高劑量組大鼠潰瘍數(shù)目增多，潰瘍評分升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組潰瘍數(shù)目減少，潰瘍評分降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠口腔潰瘍數(shù)目、潰瘍評分比較（）

表2 各組大鼠口腔潰瘍數(shù)目、潰瘍評分比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與左旋咪唑組比較，bP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 5組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，pg/mL）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，pg/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05；與左旋咪唑組比較，cP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，dP＜0.05

2.3 大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 5組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+降低（P＜0.05）。（見表4、圖1）

表4 各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比較（）

表4 各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05；與左旋咪唑組比較，cP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，dP＜0.05

圖1 各組大鼠外周血T 淋巴細(xì)胞亞群流式圖

2.4 各組大鼠口腔黏膜組織病理變化 對照組大鼠黏膜上皮完整，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠口腔黏膜組織破潰，細(xì)胞核深染、固縮、碎裂，可見大量空泡變性，大量炎癥細(xì)胞浸潤；左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜上皮組織基本完整，炎癥細(xì)胞浸潤較少；知黃潰瘍合劑低劑量組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤情況較模型組有所改善，空泡變性減少。（見圖2）

圖2 各組大鼠口腔黏膜組織病理圖（HE，×200）

2.5 各組大鼠口腔黏膜組織MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 5組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2蛋白相對表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相對表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB均升高（P＜0.05）；與模型組比較，左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相對表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB均降低（P＜0.05）；與左旋咪唑組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相對表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB均升高（P＜0.05）；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，知黃潰瘍合劑高劑量組MCP-1、CCR2蛋白相對表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB均降低（P＜0.05）。（見表5、圖3）

圖3 各組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表5 各組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)情況比較（）

表5 各組大鼠口腔黏膜組織中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)情況比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；模型組比較，bP＜0.05；與左旋咪唑組比較，cP＜0.05；與知黃潰瘍合劑低劑量組比較，dP＜0.05

3 討 論

復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍又稱“復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍”，病因復(fù)雜，包括精神緊張、局部創(chuàng)傷、飲食、維生素缺乏等。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為遺傳、免疫、環(huán)境因素為其產(chǎn)生發(fā)展的重要因素[6]。復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍在中醫(yī)學(xué)中屬于“口瘡”范疇，主要病機為“火”，中醫(yī)提出了諸多中藥方劑，如知黃潰瘍合劑，原方源自《辨證錄》中的“引火湯”，在辨證論治原則指導(dǎo)下調(diào)整，作為常用經(jīng)驗方治療復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍，效果確切，有推廣價值[7-8]。

知黃潰瘍合劑由熟地黃、黃柏、知母、玄參、麥冬、茯苓、巴戟天組成。熟地黃為君藥，滋陰補血；黃柏、知母、麥冬為臣藥，黃柏有解毒斂瘡、瀉火除蒸之功效，專用于濕疹濕瘡、瘡瘍腫毒，知母性寒，可滋陰潤燥，麥冬滋養(yǎng)肺金，金水相生，可輔助熟地黃滋陰；茯苓利水滲濕，巴戟天溫陽除濕，且水火并補，可“引火歸原”。全方共奏溫補腎陽、解毒斂瘡、滋陰瀉火之功效，故適宜用于治療復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍。本研究結(jié)果顯示，模型組、知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠的潰瘍數(shù)目依次減少，潰瘍評分依次降低，提示知黃潰瘍合劑有一定治療作用，其中以高劑量知黃潰瘍合劑的效果更佳。復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍創(chuàng)面愈合通常需經(jīng)歷炎癥、增殖、塑形3個階段，以炎癥為基礎(chǔ)，長期炎癥反應(yīng)可造成“難愈性創(chuàng)面”[8]。IL-17、IFN-γ為口腔潰瘍產(chǎn)生的主要炎癥因子，IL-17是活化T細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，IFN-γ含量與潰瘍病情密切相關(guān)[9-11]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低，其中知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠血清IFN-γ和IL-17含量更低；HE染色觀察大鼠口腔黏膜病理變化發(fā)現(xiàn)，知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠的口腔黏膜上皮組織趨于完整，炎癥細(xì)胞浸潤較少，提示知黃潰瘍合劑在復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍治療中有抗炎作用，且高劑量復(fù)方潰瘍合劑抗炎功效更突出，更有助于保護(hù)口腔黏膜組織完整。免疫因素被認(rèn)為是復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍發(fā)生的主要因素之一，細(xì)胞免疫與其發(fā)作存在密切關(guān)系。T淋巴細(xì)胞分為兩類：CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，前者是輔助-誘導(dǎo)亞群，后者是殺傷-抑制亞群，各亞群之間互相調(diào)節(jié)、平衡，確保機體對外源性抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答[12-13]。CD4+/CD8+下降可增強機體對各種特異性和非特異性因子的易感性，促進(jìn)口腔黏膜局部潰瘍發(fā)生[14]。謝方英等[15]發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍模型大鼠的CD4+/CD8+明顯降低，經(jīng)治療后升高，本研究結(jié)果與其具有一致性，提示高劑量知黃潰瘍合劑在增強復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍大鼠自身免疫能力上的積極作用。

梅和平等[16]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍發(fā)作后，巨噬細(xì)胞異常激活，分泌大量促炎因子，直接損傷口腔黏膜組織，同時還可激活NF-κB抑制蛋白激酶復(fù)合體，促使NF-κB移位到細(xì)胞核，并結(jié)合靶基因啟動區(qū)域上NF-κB位點，增強促炎因子IL-17等表達(dá)、抑制抗炎因子基因表達(dá)，打破抗炎、促炎因子之間平衡，加劇口腔黏膜損傷，反過來再度加速NF-κB擴散及核轉(zhuǎn)移，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致口腔黏膜潰瘍反復(fù)發(fā)作、纏綿不愈。MCP-1在復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍轉(zhuǎn)歸中有重要作用，其可在復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍發(fā)作時快速結(jié)合CCR2，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集于口腔、活化，激活炎癥信號通路，增加促炎因子分泌，對口腔黏膜組織造成不可逆性損傷。本實驗中，模型組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)增強，而知黃潰瘍合劑低劑量組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯減弱，其中尤以左旋咪唑組、知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠蛋白表達(dá)最弱，提示高劑量知黃潰瘍合劑可能通過下調(diào)MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，發(fā)揮對復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)作用。

綜上所述，知黃潰瘍合劑可有效修復(fù)復(fù)發(fā)性口腔黏膜潰瘍模型大鼠創(chuàng)面，發(fā)揮抗炎、增強免疫的效應(yīng)，其作用機制可能是抑制MCP-1/CCR2/NF-κB通路。