舒郁膠囊在大鼠腦內(nèi)的化學(xué)成分鑒定及對(duì)5-HT3R通道功能的影響*

李 芳，王海蘋(píng)，狄建英，香秋梅，王 倩，楊 賡，魏 盛

（1.北京市豐臺(tái)區(qū)婦幼保健院，北京 100069；2.金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250101；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院急診危重癥中心，北京 100029；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250355）

舒郁膠囊是名老中醫(yī)張珍玉教授研發(fā)的治療抑郁癥之肝郁氣滯證的處方，由柴胡、白芍、香附、甘草組成，具有疏肝解郁、調(diào)暢情志的作用[1-2]。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)舒郁膠囊在治療抑郁癥肝氣郁證、郁怒情緒等情感障礙方面有著獨(dú)特的作用[3-4]，但舒郁膠囊發(fā)揮該中樞作用的具體有效成分、主要靶點(diǎn)和作用環(huán)節(jié)均不明確。有研究表明5-HT3受體拮抗劑有抗焦慮和抗抑郁作用[5]，能夠增強(qiáng)5-羥色氨再攝取抑制劑的抗抑郁樣作用[6]，但5-HT3R介導(dǎo)的離子通道功能影響抑郁癥抑郁情緒的機(jī)制尚不明確。針對(duì)這些關(guān)鍵問(wèn)題，筆者運(yùn)用LC-ESI-MS技術(shù)對(duì)舒郁膠囊給藥后大鼠海馬的吸收成分和代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分辨識(shí)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了抑郁情緒模型大鼠并用舒郁膠囊進(jìn)行干預(yù)，以含藥血清作為細(xì)胞給藥方式，以5-HT3R蛋白表達(dá)及通路電流改變?yōu)檠芯繉?duì)象，試圖從5-HT3R功能水平尋找舒郁膠囊調(diào)節(jié)抑郁癥抑郁情緒的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥物與試劑 氟西?。ǘY來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)：H20110742）；柴胡提取物（柴胡提取率為20%，即5 g生藥提取出1 g提取物）、舒郁膠囊（新藥臨床批件2008L11169）和白芍提取物（芍藥苷含量35%）均由青島海川創(chuàng)新生物天然藥物研究中心提供。

芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110736-2005030）、柴胡皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110777-201208）、柴胡皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110778-201208）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；5-HT3R激動(dòng)劑phenylbiguanide（Sigma公司，貨號(hào)：164216）；5-HT3AR一抗（Abcam公司，貨號(hào)：ab51950）；5-HT3A二抗（Abcam公司，貨號(hào)：ab16248）；5-HT3BR一抗（Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-51198）；5-HT3B二抗IgG-HRP（Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-2020）；乙腈（德國(guó)Merck公司，LC-MS級(jí)）；甲醇（美國(guó)Thermo Fisher公司，LC-MS級(jí)）；甲酸（美國(guó)Sigma Aldrich Fluka公司，LC-MS級(jí)）。

1.2 主要儀器 Multiclamp 700B膜片鉗放大系統(tǒng)（美國(guó)MDC公司）；電泳儀、蛋白印跡轉(zhuǎn)移裝置（美國(guó)伯樂(lè)公司）；Agilent 1100 series液相色譜儀系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；XRXvideo曠場(chǎng)監(jiān)控裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；Agilent XCT plus型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；Micropipette puller P97微電極拉制儀（美國(guó)Sutter公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠64只，體質(zhì)量160～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2002-0003；新出生24 h內(nèi)的SPF級(jí)Wistar大鼠，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2011-0003。大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室在溫度（23±2）℃和40%～60%濕度環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均經(jīng)過(guò)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：DWSY2017 03013，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作遵從美國(guó)NIH頒布《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。實(shí)驗(yàn)中取材腦組織的大鼠采用心臟灌流法處死，其余大鼠采用頸椎脫臼法處死。

2 方 法

2.1 HPLC-ESI-MSn法的色譜條件和質(zhì)譜檢測(cè) 色譜柱：Kromasil C18100 R（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%冰醋酸（V/V）水溶液（A）和乙腈（B）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相洗脫梯度：0～6 min，2%～5%B；6～12 min，5%～12%B；12～28 min，12%～15%B；28～43min，15%～25%B；43～56min，25%～34%B；56～70 min，35%～40%B；70～81 min，40%～65%B；81～90 min，65%～100%B；流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。質(zhì)譜檢測(cè)條件：負(fù)離子掃描模式，霧化氣（N2）壓力：40.0 psi，離子源溫度：350 ℃，掃描范圍（m/z）：100～1400，電離源電壓：3.5kV，多級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓：1V。

2.2 大鼠腦組織樣品制備及檢測(cè) 將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別灌胃給予純凈水[5 mL/（kg·d）]、舒郁膠囊內(nèi)容物[0.41 g/（kg·d）]、柴胡提取物[0.32 g/（kg·d）]和白芍提取物[36 mg/（kg·d）]，連續(xù)灌胃4 d。將第4天灌胃后的大鼠，用生理鹽水心臟灌流，冰上分離大鼠海馬、額葉、下丘腦、紋狀體、小腦和腦干，置于-80 ℃冰箱備用。將各腦核團(tuán)分別精密稱(chēng)質(zhì)量并記錄，勻漿，沉淀蛋白，渦旋1 min，在4 ℃條件下離心20 min（15 000 g）。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈EP管中，吹干，復(fù)溶，渦旋，高速離心15 min，吸取20 μL上清液，利用HPLC-ESI-MS進(jìn)樣分析。

2.3 抑郁情緒模型大鼠及含藥血清制備 采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)[7]選取得分相近的大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。（1）正常對(duì)照組，給予純凈水，5 mL/（kg·d），簡(jiǎn)稱(chēng)正常組；（2）抑郁情緒模型組，進(jìn)行28 d孤養(yǎng)結(jié)合慢性溫和刺激[8]，同時(shí)給予純凈水，5 mL/（kg·d），簡(jiǎn)稱(chēng)抑郁組；（3）舒郁膠囊組，按“（2）”項(xiàng)中方法進(jìn)行抑郁情緒造模，同時(shí)給予舒郁膠囊，0.41 g/（kg·d），簡(jiǎn)稱(chēng)舒郁組；（4）氟西汀組，按“（2）”項(xiàng)中方法進(jìn)行抑郁情緒造模，同時(shí)給予氟西汀，10 mg/（kg·d）（相當(dāng)于成人臨床8倍劑量）。每天灌胃給藥2次，造模28 d完成后即進(jìn)行模型評(píng)價(jià)（曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)合宏觀行為藥理學(xué)觀察）。末次灌胃給藥90 min后[9]，麻醉并腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后高速離心，合并同組血清分裝放置于-80 ℃冰箱，使用時(shí)將血清常溫解凍，滅活并用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.4 培養(yǎng)及孵育海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞 取新出生24 h內(nèi)的Wistar大鼠，無(wú)菌分離海馬組織，37 ℃培養(yǎng)箱0.125%胰酶消化15 min，終止消化，清洗，將上清液滴加在被多聚賴(lài)氨酸包被好的細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)4 h，輕搖，清洗，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，更換為配制好的不含血清的培養(yǎng)基，并置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d換液1次（每次半量更換）。于第8天細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入正常組血清、抑郁組血清、舒郁組血清及氟西汀組血清至最終體積分?jǐn)?shù)為10%，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h，用Western blotting方法檢測(cè)5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達(dá)，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄5-HT3受體激動(dòng)劑加入后介導(dǎo)的離子通道電流。

2.5 Western blotting法檢測(cè)海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A/3B受體的蛋白表達(dá) 將含血清（10%）培養(yǎng)基孵育24 h后的海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞分組裂解，提取裂解后的神經(jīng)元總蛋白，其中每組取10 μL用BCA法做蛋白含量檢測(cè)，其余使蛋白變性分裝后置于-20℃冰箱備用。取10μL室溫融化后的備用樣品，經(jīng)SDSPAGE電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜。將NC膜裝入孵育袋并加入已經(jīng)稀釋好的相應(yīng)anti-5-HT3A（1∶200）一抗和anti-5-HT3B（1:5 000）一抗，封口，孵育4 ℃過(guò)夜；洗膜3次，然后放入孵育袋并分別加入相應(yīng)anti-5-HT3A（1∶400）二抗和anti-5-HT3B（1∶400）二抗，封口，室溫孵育2 h；洗膜3次，顯影和定影檢測(cè)雜交信號(hào)。5-HT3A/3B受體的相對(duì)表達(dá)量為其與內(nèi)參β-actin的灰度比值。

2.6 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄5-HT3受體門(mén)控離子通道電流 在電壓鉗模式下記錄5-HT3R通道電流，所充電極內(nèi)液成分和灌流用外液成分參考文獻(xiàn)記錄，鉗制電壓為-70 mV，微電極電阻3～5 Mohm，濾波器濾波頻率為2.9 kHz，采樣頻率為20 kHz[10]。通過(guò)細(xì)胞旁Y管快速灌流方式給予PBG（phenybiguanide，10 μmol/L）和其他各組滅活后的血清，在倒置顯微鏡下通過(guò)微電極操縱儀控制電極入液情況，隨時(shí)觀察電極入液、電極接近細(xì)胞膜及封接過(guò)程電阻變化，串聯(lián)電阻Ra＜20 Mohm的細(xì)胞記錄入實(shí)驗(yàn)，用PClamp10.0軟件采集每組6個(gè)海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞的5-HT3受體通道電流數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合要求后再進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)。5-HT3A/3B受體相對(duì)表達(dá)量及5-HT3受體通道電流密度值數(shù)據(jù)采用單因素方差進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件作圖。計(jì)量資料以（）表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni's multiple comparisons test，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 舒郁膠囊在大鼠海馬組織中的化學(xué)成分鑒定 通過(guò)LC-ESI-MSn方法檢測(cè)得到舒郁膠囊在大鼠海馬核團(tuán)和額葉核團(tuán)各化學(xué)成分保留時(shí)間和質(zhì)譜信息。（見(jiàn)表1）根據(jù)舒郁膠囊入血成分和代謝產(chǎn)物[9]，通過(guò)比對(duì)對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)，化合物一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜信息、保留時(shí)間等，對(duì)可能通過(guò)血腦屏障的化學(xué)成分進(jìn)行分析，確定為進(jìn)入腦核團(tuán)的化學(xué)成分及其代謝產(chǎn)物。由此共鑒定出舒郁膠囊進(jìn)入大鼠額葉和海馬中的化學(xué)成分有5個(gè)，其中4個(gè)成分為白芍提取物組共同的化學(xué)成分，1個(gè)成分為柴胡提取物組共有的化學(xué)成分，而下丘腦、紋狀體、小腦、腦干均未檢測(cè)到該5種化學(xué)成分。

表1 舒郁膠囊給藥后大鼠海馬和額葉中的成分表

化合物1（tR=27.7 min）通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，將其鑒定為芍藥苷。芍藥苷的相對(duì)分子質(zhì)量為480，根據(jù)元素組成分析，其分子式應(yīng)為C23H28O11。在碰撞誘導(dǎo)過(guò)程中，準(zhǔn)分子離子m/z 479丟失122 Da（苯甲酸基團(tuán)）生成碎片離子m/z 357，進(jìn)一步裂解失去一分子甲醛（30 Da）產(chǎn)生碎片離子（m/z 327）。另外，在二級(jí)質(zhì)譜圖譜中，準(zhǔn)分子離子m/z 479還可以發(fā)生碰撞裂解直接失去一分子的甲醛（30 Da）產(chǎn)生碎片離子（m/z 449）。這些特征離子都提示該化合物結(jié)構(gòu)中應(yīng)該含有1分子的甲醛和苯甲酸基團(tuán)?；谝陨戏治?，該化合物可以初步推斷為芍藥苷。芍藥苷可能的ESI-MS/MS裂解途徑見(jiàn)圖1，ESI-MS/MS質(zhì)譜見(jiàn)圖2。

圖1 芍藥苷可能的ESI-MS/MS 裂解途徑

圖2 芍藥苷ESI-MS/MS 質(zhì)譜圖

化合物2（tR=24.6 min）與芍藥苷對(duì)照品有相同的溶劑離子峰，其ESI-MS譜產(chǎn)生了[M-H+CH3COO]-離子(m/z 539)，并進(jìn)一步裂解產(chǎn)生ESI-MS譜m/z 479，繼續(xù)中性丟失122 Da（苯甲酸）、30Da（甲醛）而產(chǎn)生m/z 357、m/z 327和m/z283[M-H-122-30-44]-離子。它們的裂解途徑與芍藥苷類(lèi)似，ESI-MS/MS質(zhì)譜見(jiàn)圖3。根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的單萜類(lèi)成分[11]，此化合物可鑒定為芍藥內(nèi)酯苷。

圖3 芍藥內(nèi)酯苷ESI-MS/MS 質(zhì)譜圖

化合物3（tR＝27.9 min）ESI-MS譜產(chǎn)生了基峰離子m/z 449離子，MS/MS裂解中性丟失122 Da、18 Da等特征裂解途徑，生成碎片離子m/z 327和m/z 309碎片離子，繼而中性丟失162 Da（葡萄糖殘基），形成m/z 165碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)資料[11]，將其鑒定為去羥基去亞甲基芍藥苷。

化合物4（tR＝36.5 min）在ESI-模式下得到m/z 523離子峰，該化合物相對(duì)分子質(zhì)量比芍藥苷多44 Da，并且與芍藥苷有共同的碎片離子m/z 479、449，m/z 479([M-H-44]-)離子中性丟失18Da（1分子H2O）得到m/z 461碎片離子，推測(cè)該化合物可能是芍藥苷甲酯。這可能是芍藥苷經(jīng)過(guò)甲酯化反應(yīng)后極性變小，易于透過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦組織。

化合物5（tR＝52.1 min）在ESI-模式下得到m/z 455離子峰，根據(jù)前期舒郁膠囊內(nèi)容物化學(xué)成分分析及各化學(xué)成分在血中移行成分分析結(jié)果[12]，對(duì)可能進(jìn)入腦組織的藥物成分進(jìn)行研究。柴胡可能的入腦成分是柴胡皂苷元m/z 471，但該成分的提取離子流卻不存在，而存在m/z 455[M-H]-離子。柴胡皂苷元進(jìn)入腦組織之前必須進(jìn)行脫氧化物反應(yīng)。以柴胡皂苷D為例，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z779（推測(cè)元素組成為C42H68O13），在m/z 779發(fā)生裂解失去162 Da（1分子葡萄糖基團(tuán)）產(chǎn)生m/z 617[M-H-Glc]-碎片離子，然后進(jìn)一步丟失1分子鼠李糖基團(tuán)（146 Da）產(chǎn)生柴胡皂苷元m/z 471的碎片離子[M-H-Glc-Rha]-。該碎片離子繼續(xù)發(fā)生脫氧化反應(yīng)，得到相對(duì)分子質(zhì)量比柴胡皂苷元小16 Da。結(jié)合質(zhì)譜碎片信息和對(duì)照品裂解規(guī)律，可推測(cè)該化合物為柴胡皂苷元脫氧化物，其ESI-MS/MS質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。柴胡皂苷D可能的ESI-MS/MS裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖4 柴胡皂苷元脫氧化物ESI-MS/MS 質(zhì)譜圖

圖5 柴胡皂苷D 可能的ESI-MS/MS 裂解途徑

3.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A/3B受體的蛋白表達(dá)各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A/3BR蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖6～7。與正常組血清所孵育的海馬神經(jīng)元比較，抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，氟西汀組和舒郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖6 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A 受體和5-HT3B 受體蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖7 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3A 受體和5-HT3B 受體蛋白表達(dá)比較（，n=6）

3.3 全細(xì)胞膜片鉗電流記錄大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3受體電流 各組大鼠5-HT3R激活電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。灌流給予5-HT3R激動(dòng)劑后，各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞可產(chǎn)生一個(gè)明顯移動(dòng)的電流，其電流密度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖9。與正常組比較，抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞的電流密度值明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；與抑郁組比較，氟西汀組和舒郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞電流密度值均明顯減弱（P＜0.01）。

圖8 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3R 激活電流反應(yīng)

圖9 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞5-HT3 受體通道電流比較（，n=6）

4 討 論

本研究表明，舒郁膠囊在大鼠腦內(nèi)的吸收成分和代謝產(chǎn)物主要有芍藥苷、芍藥苷甲酯、去羥基去亞甲基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷及柴胡皂苷元脫氧化物，其中白芍提取物對(duì)照組大鼠腦內(nèi)均可檢測(cè)到前3種成分，柴胡提取物對(duì)照組大鼠腦內(nèi)檢測(cè)到柴胡皂苷元脫氧化物的存在。舒郁膠囊的君藥是白芍和柴胡，課題組以往數(shù)據(jù)顯示白芍提取物在大鼠腦內(nèi)的吸收成分有芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷[12]。這兩種化學(xué)物質(zhì)也是本實(shí)驗(yàn)舒郁膠囊的腦內(nèi)吸收成分。前期研究顯示，舒郁膠囊在血中的吸收成分均含有芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷[10]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的大鼠入腦化學(xué)成分，可以推測(cè)舒郁膠囊被吸收入血后，一部分以原型成分通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，如芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷；另一部分化學(xué)成分則經(jīng)過(guò)脫氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成小分子（如去羥基去亞甲基芍藥苷、芍藥苷甲酯及柴胡皂苷元脫氧化物）才能透過(guò)血腦屏障，以代謝產(chǎn)物的形式進(jìn)入腦內(nèi)，或者進(jìn)入腦內(nèi)的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在腦內(nèi)直接代謝為芍藥苷甲酯和去羥基去亞甲基芍藥苷。這些腦組織內(nèi)的化學(xué)成分和代謝產(chǎn)物是舒郁膠囊發(fā)揮抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

5-HT3受體通道屬于非選擇性配體門(mén)控陽(yáng)離子通道，由5個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基均由細(xì)胞外域，跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[13]。藥物成分或者大鼠體內(nèi)化學(xué)成分結(jié)合這些受體的細(xì)胞外域部分，可引發(fā)跨膜離子通道的打開(kāi)和離子（如Na+、K+、Ca2+等陽(yáng)離子）的流通，從而驅(qū)動(dòng)5-HT3受體通道電流的形成。本實(shí)驗(yàn)抑郁組血清孵育的海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞電流密度值明顯增強(qiáng)，可能是因?yàn)橐钟艚M血清異常的化學(xué)成分過(guò)度結(jié)合了5-HT3AR和5-HT3BR，致使5-HT3AR和5-HT3BR蛋白表達(dá)異常升高，也可能是因?yàn)橐钟艚M血清直接影響了Na+、K+、Ca2+離子流通。這與文獻(xiàn)中經(jīng)前期綜合征肝氣郁證模型大鼠血清改變5-HT3受體電流的趨勢(shì)相同[10]。同樣，電壓門(mén)控離子通道的鈉離子和鉀離子通道部分亞基蛋白表達(dá)的異常改變，也會(huì)影響神經(jīng)元興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、動(dòng)作電位和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[14-16]，從而改變了Na+、K+、Ca2+離子通道的功能。文獻(xiàn)研究表明，經(jīng)前煩燥障礙肝氣逆證模型大鼠情緒調(diào)控腦區(qū)（海馬區(qū)和額葉）5-HT3R蛋白表達(dá)減少，恰好反證了本實(shí)驗(yàn)抑郁情緒模型大鼠海馬區(qū)5-HT3R蛋白表達(dá)的異常升高。由此推測(cè)，抑郁情緒模型大鼠在Na+、K+、Ca2+相關(guān)的通道蛋白異常表達(dá)等反復(fù)刺激中，體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)不斷改變，促使腦內(nèi)5-HT3A/3BR蛋白表達(dá)發(fā)生異常，同時(shí)導(dǎo)致5-HT3受體介導(dǎo)的離子通道功能發(fā)生異常。這些異常的5-HT3R反過(guò)來(lái)又加重抑郁情緒，如此周而復(fù)始，共同推進(jìn)。

5-HT3R離子通道可通過(guò)Na+、K+和Ca2+來(lái)介導(dǎo)突觸前和突觸后神經(jīng)元的快速去極化反應(yīng)[18]，進(jìn)而改變5-HT3R通道的功能。研究表明白芍提取物和柴胡提取物均能通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT3R通道電流及5-HT3R蛋白表達(dá)而發(fā)揮其抗抑郁樣情緒的作用[19-20]。舒郁膠囊以白芍和柴胡共為君藥來(lái)發(fā)揮發(fā)揮疏肝解郁、調(diào)暢情志的功效。這些共同佐證了本實(shí)驗(yàn)舒郁膠囊通過(guò)下調(diào)5-HT3R蛋白表達(dá)和下調(diào)5-HT3R通道電流來(lái)拮抗抑郁情緒。研究表明，舒郁膠囊能發(fā)揮5-HT3R拮抗劑作用調(diào)控神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流，從而達(dá)到神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡[21-22]?？梢酝茰y(cè)，舒郁膠囊通過(guò)拮抗神經(jīng)元細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而促使了5-HT3R通道電流密度的降低。有研究顯示芍藥苷可以產(chǎn)生微弱的電壓依賴(lài)性Na+和延遲整流K+的抑制[23]，由此可見(jiàn)，舒郁膠囊可能通過(guò)本身藥物成分與5-HT3R不同亞基的結(jié)合活性來(lái)影響5-HT3R離子通道的功能，也有可能通過(guò)改變神經(jīng)元Na+、K+和Ca2+在5-HT3R通道的通透性和流動(dòng)性來(lái)調(diào)節(jié)5-HT3R功能。

本實(shí)驗(yàn)證明，舒郁膠囊經(jīng)大鼠灌胃吸收后，能夠通過(guò)血腦屏障，進(jìn)入大鼠額葉和海馬組織，但是仍舊需要我們繼續(xù)探討舒郁膠囊的化學(xué)成分或代謝產(chǎn)物在大鼠腦內(nèi)的作用靶點(diǎn)和富集性問(wèn)題，以更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)研究藥物的作用位點(diǎn)。同時(shí)，抑郁組和舒郁組大鼠海馬神經(jīng)元5-HT3R電流的變化，證明了不同狀態(tài)下海馬神經(jīng)元5-HT3R功能的改變。這些離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為將來(lái)研究海馬組織的腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)在體額葉組織5-HT3受體功能的改變，也有待于用腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。