兩株產(chǎn)紅色素細菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件初步研究

◎ 徐姍娜，盧 軍，侯鴻飛，趙蕓卉

（漢中市食品藥品監(jiān)督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000）

食品在制作過程中，經(jīng)常會使用食用色素這一食品添加劑，以滿足食品的感官要求。而食用色素又分為人工合成色素和天然色素。由于大多數(shù)人工合成色素被發(fā)現(xiàn)對人體有害，而天然色素不僅安全性高，還具有一定的藥用價值和保健功能，在食品、化妝品、保健品等行業(yè)領(lǐng)域具有巨大的的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。目前，世界各國尤其是發(fā)達國家都在加強對人工合成色素的使用進行規(guī)范和限制，并加大對天然色素的開發(fā)、研究和利用[1]。而我國由于對天然色素的研發(fā)起步較晚，還沒有達到發(fā)達國家以天然色素使用為主、人工合成色素使用為輔的程度。

食品用天然色素根據(jù)來源可分為植物色素、動物色素和微生物色素。目前，從動、植物色素中已研發(fā)出的種類較多，但價格昂貴。微生物色素多數(shù)是細菌、放線菌等的次級代謝產(chǎn)物，而微生物又具有易培養(yǎng)、生長繁殖快的特點，使得較低成本的工業(yè)生產(chǎn)獲得此類色素成為可能。當前，已知的色素產(chǎn)生菌主要有假單胞菌屬、微球菌屬、紅曲霉和沙雷氏菌屬[2]等。而粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）正是重要的天然紅色素——靈菌紅素(Prodigiosin，PG)的主要生產(chǎn)菌株。

近日，本實驗室在對兩批次食物樣品進行大腸菌群計數(shù)時，在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）平板上發(fā)現(xiàn)若干顏色鮮紅的菌落，這與在VRBA上呈紫紅色菌落，且周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)的大腸菌群明顯不同。挑取可疑菌落進行劃線分離，得到的菌株分別編號為WSW801和WSW851，使用全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株WSW801、菌株WSW851。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基，革蘭氏染色試劑為北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

光學(xué)顯微鏡Ci-L（尼康儀器有限公司）、全自動微生物鑒定系統(tǒng)WalkAway-40 plus（貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）。

1.4 菌株鑒定方法

對菌株WSW801和菌株WSW851分別進行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果顯示二者皆為革蘭氏陰性菌。采用Prompt快速接種法，菌株WSW801和菌株WSW851分別使用貝克曼專用取菌針沾取菌落3次，用環(huán)狀蓋帽將針邊緣多余的細菌刮掉，將取菌針插入專用的30 mL Prompt接種水瓶中，徹底混勻。依次接種于革蘭氏陰性菌鑒定板Neg Combo 50中，貼標簽，放板，開始培養(yǎng)、鑒定，探究不同條件下WSW801和WSW851中靈菌紅素的產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

為研究不同培養(yǎng)溫度對WSW801和WSW851中靈菌紅素產(chǎn)生的影響，選用NA瓊脂和VRBA瓊脂兩種培養(yǎng)基，將菌株WSW801和WSW851分別在28 ℃、36 ℃和42 ℃溫度下培養(yǎng)24～48 h，在24 h和48 h觀察靈菌紅素產(chǎn)生的情況，結(jié)果見表1。在NA瓊脂培養(yǎng)基上，兩種菌株在不同溫度條件下培養(yǎng)24 h后色素的產(chǎn)生情況見圖1、圖2。

圖1 菌株WSW801在不同溫度下培養(yǎng)24 h后色素產(chǎn)生情況圖

圖2 菌株WSW851在不同溫度下培養(yǎng)24 h后色素產(chǎn)生情況圖

表1 不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間對靈菌紅素產(chǎn)生的影響表

結(jié)果表明，菌株WSW801和菌株WSW851經(jīng)鑒定均為粘質(zhì)沙雷氏菌。測定不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間對WSW801和WSW851中靈菌紅素產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)二者均能在28 ℃和36 ℃培養(yǎng)時產(chǎn)生靈菌紅素，且28 ℃培養(yǎng)時產(chǎn)色素更多，而在42 ℃培養(yǎng)時均不產(chǎn)生靈菌紅素；相同溫度、相同時間培養(yǎng)時NA瓊脂上的色素產(chǎn)量比VRBA瓊脂更多；培養(yǎng)時間從24 h延長至48 h時，靈菌紅素產(chǎn)生量并無明顯變化。

3 討論

粘質(zhì)沙雷氏菌在自然界分布較廣，可存在于土壤、水，植物和動物等的腸道和呼吸道中，屬于變形菌門腸桿菌科下的沙雷菌屬，革蘭氏陰性兼性厭氧菌，短桿菌可近球形，無莢膜，形態(tài)上比其他腸道菌小，為細菌中最小者。沙雷氏菌所產(chǎn)紅色素是研究較多的一類微生物天然紅色素，稱為靈菌紅素。靈菌紅素作為粘質(zhì)沙雷氏菌的次級代謝產(chǎn)物，是一類含甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)的天然紅色素，相較于營養(yǎng)性低、有毒副作用的人工合成色素具有色調(diào)自然、使用安全等特點和優(yōu)勢，有研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素可能具有抗真菌、抗細菌等作用，因此，研究其在食品、功能性保健食品等色素添加劑工業(yè)中的應(yīng)用具有較大的前景和價值[2]。

微生物相較動、植物雖然生長旺、繁殖快、易培養(yǎng)、適應(yīng)性強，但通過微生物生產(chǎn)色素的條件卻較為復(fù)雜，不同的碳源、氮源選擇、培養(yǎng)溫度和pH等條件對不同菌株產(chǎn)色素的成分及產(chǎn)量會有不同的影響，另外，培養(yǎng)基中的磷酸鹽、金屬離子、溶解氧等也會或多或少對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。粘質(zhì)沙雷氏菌對生存溫度的要求范圍較為寬泛，但靈菌紅素的合成對溫度的要求卻較為嚴格[3]，此外，不同光照、氮源[4]、培養(yǎng)pH[5]對靈菌紅素的合成都會產(chǎn)生一定的影響。

本次試驗結(jié)果顯示，粘質(zhì)沙雷氏菌WSW801和WSW851在28 ℃和36 ℃培養(yǎng)時均能產(chǎn)生靈菌紅素，且28 ℃培養(yǎng)時產(chǎn)色素更多，而在42 ℃培養(yǎng)時不產(chǎn)生靈菌紅素，與前人研究認為的粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)色素最適溫度范圍為25～35 ℃相吻合[6]。不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間對WSW801和WSW851中靈菌紅素產(chǎn)生的影響結(jié)果顯示，選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基更有利于該菌產(chǎn)生靈菌紅素，而時間24 h對于該菌產(chǎn)生色素已經(jīng)足夠，不需再延長至48 h。

4 結(jié)論

天然色素雖具有多方面的優(yōu)勢，但作為次級代謝產(chǎn)物，本身大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物，穩(wěn)定性較差，如pH、光照、氧化劑、儲存溫度和食品中其他添加劑等都有可能影響天然色素的穩(wěn)定性，使其發(fā)生顏色變化、褪色甚至色素損失。綜上所述，為微生物生產(chǎn)天然色素選擇最優(yōu)的培養(yǎng)條件，使得天然色素更高產(chǎn)，探索天然色素的最佳貯存條件，提高天然色素的穩(wěn)定性，是利用研究、開發(fā)天然色素在食品、保健食品、化妝品工業(yè)等領(lǐng)域的使用亟待解決的兩大問題。