甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究進展

李偉 解寶玥 王俊偉

山東新華制藥股份有限公司 山東淄博 255000

甾體化合物在自然界中有著廣泛存在，微生物轉(zhuǎn)化是指微生物細胞把復(fù)雜的外源物質(zhì)做特定結(jié)構(gòu)裝飾這一過程，也就是將微生物作為載體，經(jīng)由菌體于代謝過程當中所產(chǎn)生的酶來催化外源性底物發(fā)生反應(yīng)。甾體類化合物的微生物轉(zhuǎn)化無論是對新一代的甾體藥物、還是關(guān)鍵中間體的合成，皆不失為是有力工具。

1 甾體類化合物的微生物轉(zhuǎn)化工藝

甾體微生物轉(zhuǎn)化工藝主要有以下兩個階段：①菌體生長：在此階段，目的是為菌體提供充足營養(yǎng)，為菌體的生長提供有利的生長條件；為了進一步提高甾體化合物的轉(zhuǎn)化成功率，也要予以菌體充足的生長繁殖時間，在確保其合適菌體濃度之后，加入底物轉(zhuǎn)化；通常細菌需要12-24h 的培養(yǎng)時間、真菌需要24-72h 的培養(yǎng)時間。②底物轉(zhuǎn)化：在歷經(jīng)了前期菌體大量生長繁殖之后，菌體產(chǎn)酶催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。

但是在底物轉(zhuǎn)化的這一過程當中，需考慮到底物是存在疏水性的，所以添加底物時要輔助一些助溶舉措。例如先在乙醇和甲醇等有機溶劑當中溶解底物，再將其加入發(fā)酵培養(yǎng)基當中。

但是這樣的方式卻存在一定的轉(zhuǎn)化缺陷，如底物常會于培養(yǎng)基中析出；加入底物的有機溶劑會產(chǎn)生對菌體的毒性作用，抑制菌體生長；底物濃度過高也會帶給菌體毒性作用。因此，研究學(xué)者也對如何提高甾體類化合物溶解度的新技術(shù)展開了研究。

2 甾體化合物微生物轉(zhuǎn)化率提高的方法

2.1 固定化細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用

固定化細胞用于甾體化合物微生物轉(zhuǎn)化過程，能夠針對有毒溶劑來保護反應(yīng)環(huán)境。同時，固定化技術(shù)能夠保證微生物催化劑得到循環(huán)性利用。但是該方法的缺點表現(xiàn)在：存在固定化系統(tǒng)傳質(zhì)的限制、生產(chǎn)率較低。

2.2 新型溶劑的應(yīng)用

以選擇生物相容性非水溶劑為前提，培養(yǎng)基的設(shè)計無疑是研究的新方向。如對綠色溶劑的研究，像是超臨界流體：離子液體與天然油，再比如其它的液態(tài)聚合物，也都可以作為有機溶劑的替代品。有相關(guān)研究指出，在硅B 油培養(yǎng)基當中，Mycobacteriumsp.NRRL3805B 可以高效轉(zhuǎn)化植物甾醇為AD[1]。

2.3 濁點體系的應(yīng)用

在有關(guān)研究中，提出對濁點系統(tǒng)于甾體微生物轉(zhuǎn)化過程中的效能，指出濁點系統(tǒng)不僅可以影響發(fā)酵上游過程，而且還能有效分離產(chǎn)物[2]。

2.4 環(huán)化糊精的應(yīng)用

環(huán)糊精的各種作用、特別是改性環(huán)糊精，在甾醇微生物轉(zhuǎn)化過程中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。它的應(yīng)用能夠有效增加類固醇的溶解度，并刺激細胞的生長，促進細胞膜通透性。

2.5 優(yōu)化菌株改良與發(fā)酵工藝

（1）進行優(yōu)良菌種的培育。在工業(yè)微生物的發(fā)展過程當中，對具備轉(zhuǎn)化能力的菌株進行篩選及改良有積極意義。雖然說在自然環(huán)境當中所得到的轉(zhuǎn)化菌株有一定的轉(zhuǎn)化能力，但是原始菌株的不同、其轉(zhuǎn)化能力也是有差異性的，所以得到轉(zhuǎn)化率高或是可以作為工業(yè)化生產(chǎn)的原始菌株有限。繼而，想要進一步提高菌株轉(zhuǎn)化甾醇的能力，有必要采取微生物工業(yè)育種手段，目的是對原始菌株進行改良，從而得到高產(chǎn)菌株。

①物理誘變。包括紫外誘變、離子束、激光、超聲波等物理誘變育種方法，其中紫外誘變廣為使用。具體而言是借助于胸腺嘧啶二聚體來將基因復(fù)制打亂，從而使得堿基序列錯亂發(fā)生突變。該方法的應(yīng)用優(yōu)勢在于所需設(shè)備簡單、操作安全便捷，誘發(fā)率高。

②化學(xué)誘變?；瘜W(xué)誘變方法指的是經(jīng)化學(xué)誘變劑和DNA 分子作用來對DNA 分子結(jié)構(gòu)進行改變，具體根據(jù)不同的作用方式可分成：烷化類、移碼突變劑、堿基類似物三類。

③基因重組。重組DNA 技術(shù)的發(fā)展，給構(gòu)建基因工程提供了良好的支持條件。如實驗報道中[3]，通過重組細胞色素P450 在大腸桿菌中的表達，實驗得到可將孕酮轉(zhuǎn)化為3β-羥基-5-雄甾-17-酮的突變菌株。

④復(fù)合誘變?；谡T變方法的多種多樣，僅采用一種誘變手段于生物誘變過程中的應(yīng)用已不能再滿足工業(yè)育種需求，因此，近年來人們也將研究的焦點放在使用兩種或兩種以上誘變方法上。

（2）優(yōu)化發(fā)酵工藝。微生物生長離不開豐富的營養(yǎng)支持，良好的pH 值、溫度條件以及溶氧條件均有利于促進菌體的正常生長，并利于促進發(fā)生酶促反應(yīng)。菌體生長時，保證良好的基礎(chǔ)條件能夠為微生物生長與繁殖提供有力保障，繼而縮短大量菌體繁殖以及產(chǎn)生相應(yīng)酶的時間。菌體進入底物轉(zhuǎn)化時，需要做好對各種轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件的控制，例如溫度控制、攪拌速度、合適的通氣量等。轉(zhuǎn)化時維護菌體良好生長是獲得較多酶的根本途徑。因微生物產(chǎn)酶條件與生長條件有一定差異性，因此對影響轉(zhuǎn)化的物理條件（通氣、挽拌等）、培養(yǎng)基的組成（微量元素、碳源等）非常必要。

3 討論

甾體化合物在細胞當中有著重要的生物功能，同時也表現(xiàn)出有多樣活性，近年以來，微生物系統(tǒng)在甾體生產(chǎn)中的應(yīng)用有了更多的認知。但目前，利用微生物轉(zhuǎn)化篩選得到的甾體藥物或中間體種類還是不多，還有很多存在轉(zhuǎn)化甾體藥物的菌株尚未被發(fā)現(xiàn)。因此，對篩選有轉(zhuǎn)化甾體能力的菌株進行研究、得到有價值的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有極大的現(xiàn)實價值。