胃癌組織中Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物的表達(dá)及意義*

鄭家雷，莫緩緩，方 向，胡 婷，周陽(yáng)陽(yáng)，蘇 方

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,安徽 蚌埠 233003;2.中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年消化科)

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球腫瘤第四位，死亡率位居第三位[1]。我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均高居第二位[2]。隨著手術(shù)、化療、放療、靶向及免疫治療的綜合治療理念的普及和推廣，一定程度上延長(zhǎng)了患者的生存期和提高了生活質(zhì)量，但根本上未改變胃癌高死亡率[1]?，F(xiàn)階段胃癌的治療已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)治療階段，如針對(duì)HER-2基因。胃癌HER-2基因的檢測(cè)已經(jīng)作為晚期胃癌臨床治療方案選擇的依據(jù)。Notch異二聚體是高度保守的跨膜蛋白質(zhì)，參與許多細(xì)胞進(jìn)程包括干細(xì)胞維持、凋亡、增殖和分化等[3]。1991年Ellisen LW首次從人急性T淋巴細(xì)胞白血病中鑒定出來(lái)Notch1，提示Notch信號(hào)通路可能與腫瘤相關(guān)[4]。Yao等研究顯示胃癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中Notch信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用[5]。我們?cè)谂R床工作中，通過(guò)對(duì)胃癌疑難病例的研究，在1例患者胃癌組織中檢測(cè)到Notch1基因第34外顯子斷裂與BPHL基因第4內(nèi)含子發(fā)生融合，豐度約為2.0 %，促使我們探索Notch1-BPHL融合基因在胃癌中表達(dá)水平及其基因突變的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2018年5月至10月我院腫瘤外科50例初治、手術(shù)治療且術(shù)后病理證實(shí)為胃癌患者的術(shù)后石蠟標(biāo)本為研究對(duì)象。其中男性35例,占70.0 %，年齡23～72歲，中位年齡50歲；女15例,占30.0 %，年齡30～75歲，中位年齡52歲。病變局限于黏膜及肌層19例(占38.0 %)，病變侵及漿膜層及臨近組織31例(占62.0 %)。淋巴結(jié)陽(yáng)性轉(zhuǎn)移22例(占44.0 %)，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移28例(56.0 %)。高、中分化程度20例(40.0 %)，低、未分化30例(占60.0 %)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲。(2)蚌埠及周邊地區(qū)常住人口。(3)既往無(wú)胃相關(guān)手術(shù)史。(4)術(shù)前未行靶向、化療及放療史。(5)臨床及病理資料完整。(6)無(wú)自身免疫系統(tǒng)疾病和其他系統(tǒng)重大疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理為賁門(mén)-食管結(jié)合部腫瘤。(2)合并其他惡性腫瘤。(3)臨床或病理資料不完整者。

1.2方法 (1)Notch1-BPHL融合基因引物的設(shè)計(jì)：以Notch1和BPHL基因的cDNA全序列為依據(jù),考慮到采用PCR拼接兩個(gè)基因片段及最終試驗(yàn)?zāi)康?確定選擇用于拼接的cDNA片段Notch1基因第1-34外顯子部分與BPHL基因第5-7外顯子部分。Oligo 6.0分析軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)。最終確定堿基順序：5'-3' GATGACCTGGGCAAGTCCG，3'-5'CAGCAGCATATGTCATTGTAGGAAGTCTTCTGC。(2)Trizol試劑提取標(biāo)本組織中總RNA(3)瓊脂糖凝膠電泳檢查評(píng)價(jià)總RNA的完整性。(4)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。(5)凝膠電泳鑒定、紫外線(xiàn)燈下切膠。(6)DNA膠回收目的基因，ARMS基因檢測(cè)法測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物與胃癌臨床病理關(guān)系 6例胃癌組織中檢測(cè)到Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物，陽(yáng)性率12.0 %，癌旁組織和正常胃黏膜未檢測(cè)到融合基因產(chǎn)物；性別間Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物檢出陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同分化程度組間Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同浸潤(rùn)深度組間Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物在正常黏膜、胃癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 正常胃黏膜無(wú)Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物

圖2 胃癌組織Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物

圖3 轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物

表1 Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物與胃癌臨床病理關(guān)系

3 討論

自1991年Ellisen LW等首次從人急性T淋巴細(xì)胞白血病中鑒定出來(lái)Notch1，通過(guò)t(7;9)(q34;q3403)使9號(hào)染色體的Notch1基因斷裂，Notch1胞外區(qū)丟失，從而胞內(nèi)區(qū)獲得活性而表現(xiàn)出致癌作用，提示Notch信號(hào)通路可能與急性T淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)[4]。隨后研究表明，Notch通路對(duì)結(jié)直腸癌、乳腺癌等具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，而對(duì)于甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌等部分腫瘤起到抑癌作用[6]。更有研究結(jié)果顯示，Notch1在同一種腫瘤的不同發(fā)展階段或不同病理類(lèi)型中作用不同,不但可表現(xiàn)為致癌作用,還可表現(xiàn)為抑癌作用[7-10]。另有部分研究表明，宮頸癌發(fā)生早期階段Notch1為促癌作用, 晚期則為抑癌作用[11]。同樣在胃癌的諸多研究中提示Notch信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但存在爭(zhēng)議和分歧。有研究顯示Notch1在胃癌組織中表達(dá)比正常組織明顯升高，且與腫瘤的浸潤(rùn)、分化程度及大小顯著相關(guān)[12-13]。另有研究提示Notch1在胃癌中表達(dá)下調(diào)，起抑癌作用，是預(yù)后良好的獨(dú)立因素[14]。因此，目前胃癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中Notch信號(hào)通路的作用和機(jī)制沒(méi)有得到明確闡明。人聯(lián)苯樣水解酶(BPHL)基因編碼絲氨酸蛋白酶家族水解酶，水解活化核苷類(lèi)似物的氨基酸酯前體藥物(抗病毒藥物)為無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷，可能在解毒過(guò)程中起作用[15]。目前也還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于BPHL與胃癌之間關(guān)系的相關(guān)研究。本研究結(jié)果表明Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物在胃癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)率較癌旁組織及正常胃黏膜明顯增加，低分化及未分化的胃癌組織中Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物表達(dá)較高、中分化的上調(diào)，在癌組織浸潤(rùn)較深的T3、T4病例中檢測(cè)率明顯高于T1、T2。以上結(jié)果提示胃癌組織中Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物高表達(dá)可能參與胃癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。研究結(jié)論與國(guó)內(nèi)周寧、黃博的研究結(jié)果顯示胃癌組織中高表達(dá)Notch1受體，與患者的腫瘤預(yù)后、TNM分期、分化程度密切相關(guān)有異曲同工之處[16-17]。結(jié)合臨床中對(duì)疑難胃癌病理基因二代測(cè)序檢測(cè)到Notch1基因第34外顯子斷裂與BPHL基因第4內(nèi)含子斷裂發(fā)生融合，豐度約2.0 %。該融合產(chǎn)物可能為Notch1第1-34部分與BPHL第5-7外顯子氨基酸結(jié)合；其中Notch1蛋白與正常蛋白相比，缺失第2 075-2 555位氨基酸，尚未曾見(jiàn)報(bào)道于腫瘤中，因此具體突變意義不能明確；若融合產(chǎn)物對(duì)Notch1蛋白功能產(chǎn)生影響，可能通過(guò)改變其參與的信號(hào)通路參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究通過(guò)RT-PCR及ARMS基因檢測(cè)Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物在胃癌組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及正常黏膜中的表達(dá)，結(jié)果顯示低分化、未分化、T3及T4的胃癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中融合基因表達(dá)上調(diào)，提示Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物可能參與胃癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，對(duì)胃癌的診斷和治療具有一定應(yīng)用價(jià)值，但標(biāo)本量較少，且Notch1與BPHL基因融合產(chǎn)物介導(dǎo)的下游通路、機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及更多的研究進(jìn)一步檢測(cè)及驗(yàn)證，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。