蝦青素化學(xué)和生物合成研究進(jìn)展

陳 丹，汪 鋒，蔣 珊，劉鵬陽，朱航志，李翔宇，萬 霞,4,5,*

（1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430205；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062；3.嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司，湖北武漢 430073；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430062；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430062）

蝦青素（C40H52O4）是一種酮式類胡蘿卜素，化學(xué)名為3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示：四個異戊二烯通過共軛雙鍵連接，兩端連接兩個異戊二烯組成的六元環(huán)。蝦青素有三種旋光異構(gòu)體，三種旋光異構(gòu)體的區(qū)別在于全反式蝦青素的立體異構(gòu)體中，消旋蝦青素的抗氧化活性最低，右旋蝦青素清除自由基能力最強(qiáng)，而左旋蝦青素對于脂質(zhì)過氧化的抑制作用和免疫活性較強(qiáng)[1?2]。蝦青素除了具有抗氧化活性外，還具有抗癌、抗炎、抗糖尿病等多種功效[3]。此外，蝦青素是唯一可以穿透血腦和血視網(wǎng)膜屏障并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腦功能有積極作用的類胡蘿卜素。因此，蝦青素被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療保健、化妝品及飼料添加劑中[4]。

圖1 蝦青素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of astaxanthin

天然蝦青素主要存在于海洋環(huán)境中，以游離態(tài)和酯化態(tài)等形式存在。游離態(tài)蝦青素不穩(wěn)定，易被氧化。蝦青素由于末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)中羥基的存在，易與脂肪酸結(jié)合形成蝦青素酯而穩(wěn)定存在。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）中約95%的蝦青素分子被脂肪酸酯化并存儲在富含三酰甘油的胞質(zhì)脂質(zhì)體中[5]。酯化態(tài)蝦青素根據(jù)其結(jié)合的脂肪酸不同分為蝦青素單酯和蝦青素二酯。H. pluvialis可積累高達(dá)4%的蝦青素（按干重計(jì)），HOLTIN 等[6]發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)光照脅迫下積累的蝦青素的95%被脂肪酸酯化。雖然目前尚不清楚生物體內(nèi)蝦青素和脂肪酸的相互作用機(jī)理，但在H. pluvialis中觀察到了蝦青素和脂肪酸生物合成的化學(xué)計(jì)量關(guān)系。CHEN 等[7]剖析了H. pluvialis中蝦青素和脂肪酸兩個生物合成途徑之間協(xié)調(diào)機(jī)制，并揭示這種相互作用發(fā)生在代謝物水平，而不是轉(zhuǎn)錄水平，而且體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明蝦青素的酯化作用促進(jìn)了蝦青素的形成和積累。

目前國內(nèi)外制備蝦青素的方法主要可以分為兩類：化學(xué)合成法和生物合成法。化學(xué)合成的蝦青素為三種結(jié)構(gòu)的混合物[5,8]（左旋：消旋：右旋1：2：1），化學(xué)合成蝦青素主要作為工業(yè)染料，但在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域不被允許使用。生物合成的蝦青素允許在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域使用。自然界中某些微藻、真菌、細(xì)菌和特定種類的植物具有合成蝦青素的能力。H. pluvialis被認(rèn)為是自然界中最有前途的蝦青素生產(chǎn)者之一。近些年研究發(fā)現(xiàn)，破囊壺菌屬（Thraustochytrium）多個菌株也具備合成蝦青素的能力[9]，合成的左旋蝦青素占蝦青素總量的90%以上。前期研究者綜述了蝦青素的化學(xué)合成方法及路徑[10]，概述蝦青素的天然生產(chǎn)者的生產(chǎn)水平現(xiàn)狀[11]。本綜述將從化學(xué)合成、生物合成兩個方向切入，在綜述化學(xué)合成路線的基礎(chǔ)上，著重對蝦青素的生物合成及不同生物體內(nèi)蝦青素的合成代謝路徑進(jìn)行總結(jié)。本文力求能夠?yàn)樽x者搭建蝦青素的生物合成宏觀體系，幫助讀者快速了解蝦青素合成方法的研究進(jìn)展。

1 化學(xué)合成蝦青素

化學(xué)合成蝦青素分為全合成法和半合成法。蝦青素全合成法以化工原料為原材料，通過化學(xué)合成反應(yīng)來獲得蝦青素。半合成法是利用角黃質(zhì)、葉黃素和玉米黃質(zhì)等類胡蘿卜素作為原料來制備蝦青素的方法。

1.1 蝦青素化學(xué)全合成法

國內(nèi)外對于蝦青素的化學(xué)全合成路線都展開了一系列的研究。國外霍夫曼羅氏公司與巴斯夫公司是化學(xué)合成蝦青素的兩家主要企業(yè)，兩家公司利用化學(xué)合成法生產(chǎn)蝦青素的合成路線相似，采用C9＋C6→C15，2C15＋C10→C40 路線。霍夫曼羅氏公司以6-氧代異佛爾酮為原料[12]，首先利用丙酮與甲醛在弱堿條件下發(fā)生羥醛縮合失水生成α-β不飽和丁烯酮，再與乙炔發(fā)生1,2-親核加成生成六碳炔叔醇，并在硫酸作用下重排，保護(hù)產(chǎn)物的羥基使其與6-氧代異佛爾酮發(fā)生反應(yīng)，最后在強(qiáng)堿作用下發(fā)生雙邊的Wittig 反應(yīng)合成蝦青素。巴斯夫公司合成路線[13?14]中合成中間的體六碳炔叔醇并不先經(jīng)過酸化重排，而是將羥基進(jìn)行保護(hù)后與6-氧代異佛爾酮發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化的過程中進(jìn)行重排，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物蝦青素。國內(nèi)皮士卿等[10]合成蝦青素路線則與國外合成路線不同，采用C13＋C2→C15，2C15＋C10→C40 的合成路線來制備蝦青素。他以α-紫羅蘭酮為原料，經(jīng)過間氯過氧苯甲酸處理，經(jīng)過一系列的中間轉(zhuǎn)化過程后，在氫溴酸作用下酸化重排，再與三苯基膦作用生成十五碳三苯基季鏻鹽，最后進(jìn)行雙向Wittig 反應(yīng)生成蝦青素。皮士卿等[10]合成路線的獨(dú)特之處在于采用一種新的方法合成關(guān)鍵中間體C15 化合物，該方法的起始原料易得、反應(yīng)的選擇性高、總收率高。

Witting 反應(yīng)是蝦青素的全合成路線特征反應(yīng)。此類合成路線具有工藝簡單，成本低的優(yōu)點(diǎn)。雖然霍夫曼羅氏公司與巴斯夫公司這兩條路線工藝流程很復(fù)雜，生產(chǎn)過程較長、中間過程的控制難度較大、要求嚴(yán)格，但其合成成本低、價(jià)格便宜，且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，是市場上蝦青素供應(yīng)的最主要工業(yè)化來源（圖2）。

圖2 霍夫曼羅氏公司蝦青素合成路線（a）和巴斯夫公司蝦青素合成路線（b）Fig.2 Routes for chemical synthesis of astaxanthin by F.Hoffmann-La Rocha（a）and BASF（b）

1.2 蝦青素化學(xué)半合成法

半合成法是利用角黃質(zhì)、葉黃素和玉米黃質(zhì)等類胡蘿卜素作為原料來制備蝦青素的方法[15]。經(jīng)典的方法是以葉黃素為起始原料，葉黃素在堿的催化下發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)生成玉米黃質(zhì)。以1，2-丙二醇為溶劑，氫氧化鉀作為催化劑，在110 ℃下反應(yīng)168 h，玉米黃質(zhì)在碘和溴酸鈉的作用下直接氧化為蝦青素。

以角黃素為原料時(shí)則經(jīng)過堿化、硅醚化、環(huán)氧化、水解4 個過程合成蝦青素，具有合成快捷、收率高（約產(chǎn)率60%）的特點(diǎn)。由于角黃素的成本高，且生產(chǎn)過程中有一定的危險(xiǎn)性，目前難以達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。與全合成法相比，半合成法合成的蝦青素生物活性高，但產(chǎn)率低，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)困難（圖3）。

圖3 角黃素合成蝦青素的合成路線Fig.3 Synthesis route of canthaxanthin to astaxanthin

2 生物合成蝦青素

2.1 蝦青素合成代謝路徑

蝦青素是C40 類胡蘿卜素代謝的最終產(chǎn)物。生物體內(nèi)類胡蘿卜素的合成又可以分為三個階段，第一階段為中心碳代謝，第二階段為類胡蘿卜素前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸酯（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸酯（DAMPP）的合成，第三階段為類胡蘿卜素的合成。

第一階段為中心碳代謝循環(huán)。生物體利用葡萄糖、果糖等碳源通過糖酵解途徑合成甘油三磷酸（G3P）、丙酮酸（Pyruvate）和乙酰輔酶（Acyl-CoA）等物質(zhì)。甘油三磷酸、丙酮酸和乙酰輔酶作為IPP 和DAMPP 的前體物質(zhì)流入下一階段。同時(shí)，一部分乙酰輔酶進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）。三酸酸循環(huán)是三大營養(yǎng)素（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝路徑，也是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。三羧酸循環(huán)合成多種代謝產(chǎn)物，流向細(xì)胞代謝的各個方向，同時(shí)三羧酸循環(huán)還產(chǎn)生大量腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH），為后兩個階段中物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供能量和還原力。

第二階段為類胡蘿卜素的前體物質(zhì)IPP 和DAMPP 的合成。IPP 和DAMPP 的合成有兩種天然合成途徑：甲羥戊酸途徑（MVA）和甲基赤四醇4-磷酸（MEP）途徑。MVA 途徑主要存在于真核及古生菌中，是古細(xì)菌、酵母及部分革蘭氏陽性細(xì)菌中形成IPP 的唯一途徑[16]。MEP 途徑則存在于植物、藻類和大多數(shù)細(xì)菌中。這些植物和藻類可以通過細(xì)胞質(zhì)中的MVA 途徑和質(zhì)體中的MEP 途徑產(chǎn)生IPP[17?18]。直到20 世紀(jì)末，MVA 仍被認(rèn)為是包括類胡蘿卜素在內(nèi)的萜類合成的異戊二烯前體的唯一來源。在MVA 途徑中，Acyl-CoA 在Acyl-CoA 硫醇酶、β-合酶及β-還原酶的作用下生成三羥基-三甲基戊二酰輔酶（HMG-CoA），HMG-CoA 在HMGCoA 還原酶的作用下形成甲羥戊酸鹽，甲羥戊酸鹽經(jīng)過一系列的磷酸化反應(yīng)合成IPP。在MEP 途徑中，甘油三磷酸和丙酮酸分子經(jīng)過縮合及異構(gòu)化反應(yīng)形成MEP，MEP 與三磷酸胞苷偶聯(lián)后經(jīng)過一系列的磷酸化反應(yīng)形成IPP，IPP 通過異構(gòu)化反應(yīng)生成同分異構(gòu)體DAMPP。早期研究表明，MVA 途徑已在許多綠藻和紅藻中丟失，MEP 途徑是雨生紅球藻中IPP 合成的唯一路徑[19]。隨著研究的不斷深入，多重結(jié)果表明MEP 途徑是IPP 合成的唯一路徑這一現(xiàn)象在綠藻細(xì)胞中可能普遍存在[20]。而在Aurantiochytriumsp. SK4 在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中卻未發(fā)現(xiàn)MEP 途徑的大多數(shù)基因，而是甲羥戊酸（MVA）途徑參與了Aurantiochytriumsp. SK4 細(xì)胞內(nèi)IPP 的形成[21]。此外，Henry 等[22]在植物中發(fā)現(xiàn)了由胞質(zhì)中磷酸異戊基激酶催化的第三種途徑。這種MVA 途徑與在某些古細(xì)菌和細(xì)菌的葉綠素門中發(fā)現(xiàn)的另一種MVA 途徑在形成MVAP 過程路徑相同，區(qū)別在于細(xì)菌中的MVAP 通過磷酸甲戊二烯酸脫羧酶（MPD）轉(zhuǎn)換為異戊烯基磷酸（IP），隨后被異戊烯基單磷酸激酶（IPK）磷酸化為IPP。植物中雖然有MVA 和MEP 兩條路徑，但植物體內(nèi)類胡蘿卜素前體主要來源于MEP 途徑[23]。

第三階段為類胡蘿卜素類物質(zhì)的合成。DAMPP和IPP 以1:3 的比例在焦磷酸合成酶（CrtE）的作用下合成法尼基二磷酸（FPP），F(xiàn)PP 在焦磷酸合成酶的作用下生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）。GGPP 在八氫番茄紅素合成酶（CrtB）和植物烯去飽和酶（CrtI）作用下縮合形成番茄紅素，番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶（CrtY）作用下合成β-胡蘿卜素。第三階段蝦青素的合成在不同生物體內(nèi)合成路徑有所不同，但主要都是通過β-胡蘿卜素羥基化和酮基化合成。在紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma）中，蝦青素由玉米黃質(zhì)在細(xì)胞色素P450 酶作用下催化合成[24]；在細(xì)菌和藻類中，主要通過β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）和β-胡蘿卜素酮醇酶（CrtW 或BKT）催化合成。玉米黃質(zhì)是由β-隱黃質(zhì)經(jīng)專一性酶β-胡蘿卜素羥化酶作用轉(zhuǎn)化而成，β-胡蘿卜素中的烯酮和4-酮體玉米黃質(zhì)在β-胡蘿卜素酮醇酶作用下合成角黃素，角黃素經(jīng)由磷黃嘌呤（角磷酰胺）形成蝦青素。在不同物種中，β-胡蘿卜素羥化酶和β-胡蘿卜素酮醇酶將β-胡蘿卜素催化生成蝦青素的過程中作用的先后順序不一樣。LIU 等[25]在集胞藻（Synechocystissp. PCC6803）中使用異源表達(dá)的雨生紅球藻的β-胡蘿卜素酮醇酶發(fā)現(xiàn)，集胞藻細(xì)胞中首次合成蝦青素，且含量達(dá)到（4.81±0.06） mg/g 細(xì)胞干重（DCW）。體外試驗(yàn)[26?27]也進(jìn)一步證實(shí)，在雨生紅球藻中蝦青素合成的最佳路徑是酮醇酶的催化反應(yīng)在前，其次是羥化酶的羥基化反應(yīng)（圖4）。

圖4 蝦青素生物合成代謝路徑圖Fig.4 Biosynthetic pathway of astaxanthin

2.2 細(xì)菌合成蝦青素

蝦青素已在革蘭氏陽性細(xì)菌短波單胞菌（Brevundimonassp.）和革蘭氏陰性細(xì)菌鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.）、海云衫副球菌（Paracoccus haeundaensis）、甲基單胞菌屬（Methylomonassp.）和石垣嗜熱鏈球菌（Altererythrobacter ishigakiensis）等幾類細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)（表1）。

表1 合成蝦青素的細(xì)菌Table 1 Bacteria for the synthesis of astaxanthin

一些細(xì)菌中蝦青素合成代謝的前體物質(zhì)的存在，以及蝦青素合成途徑中多種關(guān)鍵基因的確定，為構(gòu)建蝦青素高產(chǎn)工程菌株提供了可能。研究發(fā)現(xiàn)，通過將海洋細(xì)菌海云衫副球菌來源的類胡蘿卜素基因crtW、crtZ、crtY、crtI、crtB和crtE轉(zhuǎn)入E.coli，成功地構(gòu)建出產(chǎn)蝦青素的大腸桿菌工程菌株，且產(chǎn)量高達(dá)400 μg/g DCW[36]。在E.coli中，兩種主要限速酶DXP 合酶（DXP）和IPP 異構(gòu)酶（IDI）過表達(dá)增加IPP 和DMAPP 的供應(yīng)。通過增加異戊二烯前體的代謝通量，可以使番茄紅素或β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素的產(chǎn)量顯著增加。然而，對于大腸桿菌中蝦青素的異源生物合成而言，將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為蝦青素是實(shí)現(xiàn)蝦青素高效生物合成的最關(guān)鍵步驟。利用λ-Red 重組技術(shù)構(gòu)建出不含質(zhì)粒的E.coli，將菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）和念珠藻的葉黃素生物合成基因整合到E.coliBW-CARO 的染色體上得到工程菌株E.coliBW-ASTA，該菌株異源表達(dá)后得到蝦青素產(chǎn)量為1.4 mg/g DCW。在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中表達(dá)Fulvimarina pelagi來源番茄紅素環(huán)化酶CrtY，β-胡蘿卜素酮醇酶CrtW 和β-胡蘿卜素羥化酶CrtZ 的編碼基因后，C. glutamicum成功合成蝦青素，產(chǎn)量可以達(dá)到0.4 mg/L/h[32]。雖然細(xì)菌自身合成蝦青素的水平與藻類差距較大，但細(xì)菌中蝦青素的合成具有重要意義，為后續(xù)工程菌株的構(gòu)建提供了相應(yīng)的基因序列。

2.3 酵母合成蝦青素

目前，紅發(fā)夫酵母是天然蝦青素的主要酵母來源，已經(jīng)應(yīng)用于水產(chǎn)飼料行業(yè)。對紅發(fā)夫酵母合成蝦青素的研究主要集中在菌株分離、誘變以及基因工程獲得蝦青素高產(chǎn)菌株方向。紅發(fā)夫酵母是一種擔(dān)子菌真菌，屬于兼性嗜冷的低溫型酵母，其合成的蝦青素為右旋結(jié)構(gòu)，是紅發(fā)夫酵母次級代謝合成的主要類胡蘿卜素。野生型紅發(fā)夫酵母合成蝦青素的濃度約為200～400 μg/g DCW，菌株突變能夠獲得高產(chǎn)蝦青素的突變體菌株。通過抗霉素、亞硝基胍（NTG）、甲基硝基亞硝基胍等化學(xué)試劑、紫外及低能流子束技術(shù)對野生紅發(fā)夫酵母菌株進(jìn)行誘變，通過篩選獲得蝦青素高產(chǎn)菌株（誘變菌株的總結(jié)見表2），PhaffiarhodozymaZJB00010 經(jīng)低能離子束注入誘導(dǎo)獲得的E5042 菌株中產(chǎn)量可達(dá)到2512 μg/g[37]。紅發(fā)夫酵母能利用多種碳源、發(fā)酵周期短、能夠在發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)、生產(chǎn)速度快的優(yōu)勢，使其已成為工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素的優(yōu)良菌種。

此外，酵母工程菌株在蝦青素生產(chǎn)方面有很好的應(yīng)用前景（表2）。解酯耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有較高的IPP 和DMAPP 產(chǎn)量，研究發(fā)現(xiàn)CrtZ 是催化β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為蝦青素的關(guān)鍵酶，在解酯耶氏酵母基因組中引入來源于念珠藻（Pantoea ananatis）的β-胡蘿卜素羥化酶CrtZ 編碼基因和來源于Paracoccussp. N81106 的β-胡蘿卜素酮醇酶CrtW 的編碼基因，得到的工程菌株ST7403 中蝦青素產(chǎn)量高達(dá)3.5 mg/g DCW（54.6 mg/L）[40]。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中通過基因工程導(dǎo)入雨生紅球藻的crtZ和bkt基因能夠提升β-胡蘿卜素向蝦青素的轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累。在GGPP 合酶的陽性突變體中過表達(dá)tHMG1，CrtI CrtY 和CrtB 三種限速酶的編碼基因，優(yōu)化后的二倍體菌株中過表達(dá)CrtZ、BKT 的編碼基因，蝦青素累積量可達(dá)到了8.10 mg/g DCW[42]，值得注意的是合成的蝦青素為左旋結(jié)構(gòu)。

表2 合成蝦青素的酵母Table 2 Yeast for the synthesis of astaxanthin

2.4 微藻合成蝦青素

微藻通常是指含有葉綠素a 并能進(jìn)行光合作用的微生物的總稱。多數(shù)微藻不僅能夠合成多不飽和脂肪酸、微藻多糖等多種生物活性成分，還能夠積累大量類胡蘿卜素。部分微藻自身具有完整的蝦青素合成路徑。其中，雨生紅球藻、小球藻等淡水單細(xì)胞微藻是蝦青素生物合成的主要資源。此外，衣藻（Halamidomonas）、裸藻（Euglena）、傘藻（Acetabularin）中也含有蝦青素。

在受到環(huán)境些脅迫時(shí)，微藻細(xì)胞會從綠色營養(yǎng)形態(tài)向紅色囊腫形態(tài)轉(zhuǎn)化，這是由于微藻細(xì)胞內(nèi)合成了大量蝦青素來抵抗對自身生長不利的環(huán)境。在小球藻中發(fā)現(xiàn)蝦青素的生物合成始于指數(shù)早期。細(xì)胞通常在最佳條件下生長，細(xì)胞為綠色營養(yǎng)形態(tài)；應(yīng)激條件下誘導(dǎo)蝦青素積累，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色的囊狀形態(tài)。與構(gòu)成光合作用結(jié)構(gòu)和功能成分的初級類胡蘿卜素（如β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素）不同，蝦青素能夠在強(qiáng)光，高鹽度和營養(yǎng)缺乏等壓力條件下大量積累。在低營養(yǎng)、強(qiáng)光等環(huán)境應(yīng)激條件下，包囊開始形成，積累大量蝦青素。光照、溫度、鹽度、化學(xué)試劑均在分子水平上對蝦青素合成產(chǎn)生影響。在高溫條件下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量的低活性氧使得類胡蘿卜素代謝減弱，高光照[44]及乙酸鹽[45]、茉莉酸甲酯[46]、赤霉素[46]等均具有促進(jìn)類胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)的功能。乙酸鹽、茉莉酸甲酯、赤霉素通過增強(qiáng)crtZ基因的表達(dá)并抑制lcyE基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)蝦青素的生物合成。與乙酸鹽等誘導(dǎo)條件相比，高光照影響pds，crtISO，lcyB，lut1，lut5和zep基因表達(dá)，更大程度促進(jìn)了類胡蘿卜素生物合成，是類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)變化的主要驅(qū)動力。研究表明，在高光照條件下，卡爾文循環(huán)和三羧酸循環(huán)為其他代謝提供了更多的前體，β-胡蘿卜素羥化酶、六氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶均被上調(diào)，從而使得細(xì)胞內(nèi)蝦青素積累增加。

從雨生紅球藻中提取蝦青素的生產(chǎn)大約在20 世紀(jì)90 年代后期開始大規(guī)模工業(yè)化。雨生紅球藻作為一類單細(xì)胞光合生物，野生型細(xì)胞內(nèi)蝦青素的含量可高達(dá)細(xì)胞干重的4%，且具有光能利用率高、生長速度快的特點(diǎn)，已被我國認(rèn)定為安全生產(chǎn)菌株。但是，雨生紅球藻的工業(yè)化中需要利用光反應(yīng)器以保證其光合作用，使得其生產(chǎn)成本大幅增加。因此開發(fā)新資源、新技術(shù)以降低生產(chǎn)成本成為當(dāng)下的重點(diǎn)研究方向。

2.5 海洋真核微生物合成蝦青素

破囊壺屬是一類類似于微藻但缺乏葉綠體而不進(jìn)行光合作用的真核微生物，細(xì)胞內(nèi)可以積累大量對人體有利的活性物質(zhì)，如：油脂、色素、角鯊烯等。此外，破囊壺菌（Thraustochytrium）、裂殖壺菌（Schizochytrium）、Aurantiochytrium中也可以積累β-胡蘿卜素、蝦青素等類胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)，Thraustochytrium、Schizochytrium、Aurantiochytrium在不同碳源的條件下代謝產(chǎn)物存在一定差異。目前相關(guān)代謝研究尚在進(jìn)行中（表3）。破囊壺菌以甘油作為碳源發(fā)酵的過程中，甘油主要通過增強(qiáng)糖酵解活性和產(chǎn)生NADPH 來促進(jìn)破囊壺菌中次級代謝產(chǎn)物的生物合成。利用釀酒副產(chǎn)物及廢糖漿做Thraustochytriidaesp.、Aurantiochytriumsp.碳源，在成功提升蝦青素產(chǎn)量的同時(shí)降低生產(chǎn)成本，為實(shí)現(xiàn)破囊壺菌內(nèi)蝦青素生物合成商業(yè)化進(jìn)一步提升可能性。

表3 合成蝦青素的海洋真核微生物Table 3 Marine eukaryotic microorganisms for the synthesis of astaxanthin

此外，通過環(huán)境脅迫、誘變、基因工程等手段可以進(jìn)一步提升細(xì)胞中蝦青素的產(chǎn)量。蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化能力，當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中，細(xì)胞中類胡蘿卜素代謝增強(qiáng)，使得蝦青素產(chǎn)量大幅增加，從而幫助細(xì)胞抵抗不利環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的丁醇、甲醇對于Schizochytrium limacinumB4D1 具有誘導(dǎo)蝦青素合成的作用。在培養(yǎng)基中加入5.6%的甲醇時(shí)，總蝦青素含量提升至約3300 μg/g，且合成的蝦青素主要為3S-3’S結(jié)構(gòu)[47]。隨著代謝路徑的明確，通過基因工程技術(shù)，在Aurantiochytrium中也獲得了蝦青素高產(chǎn)菌株。在Aurantiochytrium sp.SK4菌株中過表達(dá)透明顫菌（Vitreoscilla stercoraria）血紅蛋白的（vhb）基因，蝦青素產(chǎn)量增長9 倍達(dá)到131.09 μg/g[21]。此外，通過γ射線、NTG 化學(xué)試劑等方法對野生菌株進(jìn)行誘變可以獲得蝦青素高產(chǎn)菌株。使用γ射線獲得的高產(chǎn)菌株SchizochytriumSH104 中蝦青素的產(chǎn)量為原始菌株的3 倍，產(chǎn)量達(dá)到3.689 mg/L[51]。裂殖壺菌在作為DHA 生產(chǎn)安全菌株的基礎(chǔ)上還具有不需光照的特點(diǎn)，使其成為蝦青素生產(chǎn)工業(yè)化的潛在菌株。

2.6 植物合成蝦青素

少數(shù)金盞花物種是唯一能產(chǎn)生蝦青素的陸地植物[56]，金盞花（Adonis）屬中的Adonis aestivalis和Adonis annua的花瓣中由于蝦青素的積累呈現(xiàn)明亮的血紅色。然而，由于金盞花花朵較小，使得其在蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)中受到限制，但它卻是高級植物中蝦青素合成途徑的良好載體，為開發(fā)蝦青素生物反應(yīng)器提供了參考。蝦青素是類胡蘿卜素代謝的最終產(chǎn)物，雖然許多植物中不具有積累蝦青素的能力，但卻含有較高含量的類胡蘿卜素。這些植物細(xì)胞中缺少從β-胡蘿卜素到蝦青素代謝路徑的相關(guān)基因，使得代謝中斷在β-胡蘿卜素合成階段。研究人員通過基因工程獲得高產(chǎn)蝦青素的工程植物菌株。在番茄中共表達(dá)萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的β-胡蘿卜素酮醇酶和雨生紅球藻的β-胡蘿卜素羥化酶，使得番茄中大多數(shù)原有的類胡蘿卜素基因上調(diào)，有效地將碳通量引導(dǎo)到類胡蘿卜素中，大量游離蝦青素在葉片中大量積累。在煙草中表達(dá)Brevundimonassp. SD212 的編碼crtW和crtZ的基因，在煙葉中產(chǎn)生了0.5% DCW 的蝦青素（占總胡蘿卜素的70%以上）[57]。

3 結(jié)語與展望

蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化性能，隨著市場對蝦青素關(guān)注與需求的提升，蝦青素在食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑、醫(yī)療保健、飼料等方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展空間。化學(xué)合成、生物合成的蝦青素在不同領(lǐng)域具有不同的應(yīng)用空間?；瘜W(xué)合成蝦青素成本低、價(jià)格便宜，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，是市場上蝦青素供應(yīng)的最主要的工業(yè)化來源。隨著生物合成蝦青素的興起，各國對化學(xué)合成的蝦青素管理愈來愈嚴(yán)格，美國食品與藥物管理局（FDA）禁止化學(xué)合成的蝦青素進(jìn)入食品、保健品等市場。生物合成的天然蝦青素具有更高的生物活性，且來源更安全，滿足市場需要，尤其是供人類消費(fèi)的天然色素，成為研究熱點(diǎn)。這一市場需求也使得生物合成蝦青素的關(guān)注度日益增加。但是當(dāng)前的天然蝦青素的產(chǎn)量低導(dǎo)致價(jià)格高，不能滿足普遍的市場需求。針對市場對蝦青素需求的日益增長的問題，通過合成生物學(xué)、代謝工程、發(fā)酵工程等手段精確調(diào)控植物或微生物蝦青素的生物合成，是來實(shí)現(xiàn)天然蝦青素的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的有效途徑。已知的具有從頭合成蝦青素能力的生物僅限于幾類細(xì)菌、酵母、微藻和植物[19]，因此獲得蝦青素高產(chǎn)微生物菌株是蝦青素規(guī)模化生產(chǎn)的重要研究方向。

此外，生物合成的下游加工也存在巨大挑戰(zhàn)，尤其是蝦青素的高效提取和純化等技術(shù)。生物合成蝦青素的生產(chǎn)潛力巨大，有待克服的主要挑戰(zhàn)仍然需要更好的工程設(shè)計(jì)和創(chuàng)新，以使過程更具成本競爭力?？傊?，生物合成蝦青素是一個有吸引力的領(lǐng)域，并且可能會迅速發(fā)展。期待借助生物技術(shù)手段為生物源蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)打開新的格局。