干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在缺血性心臟病中的研究進(jìn)展

向祖金 張 靜 楊 簡(jiǎn)

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 心血管內(nèi)科 & 三峽大學(xué) 心血管病研究所 & 湖北省缺血性心血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 湖北 宜昌 443003)

中國心血管病患病率及病死率近年來持續(xù)攀升，其中缺血性心臟病病死率每年以5.05%的幅度持續(xù)上升，已成為繼中風(fēng)后第二大死亡病因[1]。缺血性心臟病往往伴隨心肌細(xì)胞死亡、心臟功能退化，最終進(jìn)展為心力衰竭。完全恢復(fù)晚期心力衰竭患者心功能的唯一方法是心臟移植，但由于供體短缺，心臟移植常常受到限制。干細(xì)胞具有多向分化潛能，近年研究表明，干細(xì)胞的心臟譜系分化潛能較低，其心臟保護(hù)及心肌修復(fù)作用大多是通過旁分泌多種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)[2]。目前認(rèn)為干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)可能是治療缺血性心臟病的有效策略，本文就干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)及其主要機(jī)制作一綜述。

1 干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的概述

干細(xì)胞是一種具有自我更新能力、低免疫原性和多譜系分化潛能的特殊細(xì)胞，按發(fā)生學(xué)來源可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，按不同分化潛能可分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞及單能干細(xì)胞。然而，將干細(xì)胞暴露于各種心源性刺激，均不能實(shí)現(xiàn)其大量向心臟譜系分化的目標(biāo)[3]。一直以來，干細(xì)胞的心臟保護(hù)效應(yīng)未獲得合理解釋。

直到2004年，Kinnaird等[4]首先提出了移植干細(xì)胞以旁分泌效應(yīng)發(fā)揮作用的概念，他們發(fā)現(xiàn)骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞可向培養(yǎng)基中釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，且單獨(dú)向大鼠缺血心肌輸注這些細(xì)胞因子可提高心肌存活率、增加梗死周圍區(qū)微血管密度及提高左室射血分?jǐn)?shù)。隨后，部分學(xué)者提出了“藥用信號(hào)細(xì)胞”一詞，以解釋骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞整合到損傷心肌部位，并分泌具有藥理或組織修復(fù)活性相關(guān)因子的現(xiàn)象[5]。這種旁分泌效應(yīng)隨后也經(jīng)一系列體內(nèi)外研究證實(shí)，被學(xué)界廣泛接受，認(rèn)為這是多種干細(xì)胞改善心功能的主要方式。Roura等[6]發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞盡管無顯著的心肌分化潛能，但在體內(nèi)外均可顯著促進(jìn)血管新生，修復(fù)部分受損心肌，一定程度改善心功能。另外，Tang等[7]研究顯示，盡管移植細(xì)胞不能分化為心肌細(xì)胞，但干細(xì)胞分泌的某些物質(zhì)卻可顯著延長(zhǎng)心臟祖細(xì)胞在靶部位的存活時(shí)間，從而整體提高移植效率。

2 干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在缺血性心臟病治療中的重要介質(zhì)——外泌體

旁分泌效應(yīng)是干細(xì)胞發(fā)揮作用的主要模式，一種直徑40～100 nm的細(xì)胞衍生性囊泡樣小體是其關(guān)鍵介質(zhì)，并廣泛參與各種細(xì)胞間通訊，這種小體被稱為“外泌體”。外泌體可由包括干細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌，并通過內(nèi)含的各種載體(如RNA、脂質(zhì)或蛋白質(zhì))發(fā)揮多種生物學(xué)作用[8]。

干細(xì)胞分泌的外泌體可被局部轉(zhuǎn)運(yùn)至功能障礙心肌而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Arslan等[9]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，給嚴(yán)重缺血小鼠心肌局部注射間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的外泌體，可顯著減小心肌梗死面積并減輕心室重構(gòu)，改善心功能。因此，我們合理地推測(cè)，外泌體可作為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì)而發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)。除上述心臟保護(hù)特性外，干細(xì)胞來源外泌體也顯示出較強(qiáng)的可塑性，從而拓展了干細(xì)胞通過旁分泌效應(yīng)治療缺血性心臟病的范疇[10]。一方面，它們可能被用作理想的藥物傳遞載體，而且可以通過干細(xì)胞在體外大量生產(chǎn)；另一方面，外泌體可在體外經(jīng)過合理的修飾后高效傳遞心臟特異性保護(hù)因子[11]。

上述結(jié)果顯示，外泌體在缺血性心臟病的干細(xì)胞治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而其具體作用機(jī)制目前仍未闡明。Arslan等[9]發(fā)現(xiàn)MSCs來源的外泌體被注入缺血再灌注心肌后，心肌組織內(nèi)ATP及還原型輔酶水平升高，局部心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，局部及全身炎癥水平降低。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在H9C2缺氧/復(fù)氧模型中，通過激活PI3K/Akt/mTOR通路發(fā)揮抗凋亡作用。為了充分利用干細(xì)胞來源外泌體介導(dǎo)相應(yīng)治療，需要進(jìn)一步研究來闡明其具體作用機(jī)制。

3 干細(xì)胞旁分泌在缺血性心臟病治療中的主要效應(yīng)物質(zhì)

3.1 細(xì)胞因子

生長(zhǎng)因子是參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程的重要信號(hào)分子，其含量在多種干細(xì)胞治療前后可發(fā)生顯著變化，因此被認(rèn)為是干細(xì)胞旁分泌的主要效應(yīng)物質(zhì)。Tachibana等[13]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其來源的心肌細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞及其來源的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-8、粒細(xì)胞集落刺激因子含量減低，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量增加，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管生成，加速細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，這可能是心梗后心功能恢復(fù)的主要機(jī)制。此外，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞也可產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，促進(jìn)血管新生，抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[14]。

然而，這些在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中有益的部分生長(zhǎng)因子，卻未在臨床試驗(yàn)中獲得滿意療效。例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是一種常見的促血管生成因子，在急性心肌梗死動(dòng)物模型中，可以改善局部心肌血流灌注并在一定程度恢復(fù)心功能，但其在臨床研究中，與安慰劑組比較，輸注血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的心肌梗死患者，心功能未見明顯改善[15-16]。同樣，心肌特異性過表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2可提高梗死小鼠的心功能，減少心肌梗死面積，但隨后臨床研究顯示，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2對(duì)缺血性心臟病患者的心臟保護(hù)作用甚微[17-18]。這可能是由于治療性生長(zhǎng)因子的移植效率低和/或生長(zhǎng)因子的半衰期短，盡管早期表現(xiàn)出一定心臟保護(hù)效應(yīng)，但后期隨著生長(zhǎng)因子逐漸耗竭，部分患者心功能反而惡化。

3.2 miRNA

除了各種細(xì)胞因子，miRNA也是干細(xì)胞旁分泌的重要效應(yīng)物質(zhì)。miRNA是一類高度保守的、單鏈小分子非編碼RNA，通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。miRNA廣泛參與心肌細(xì)胞發(fā)育和心血管疾病進(jìn)程。心肌梗死后，多由于心肌細(xì)胞再生不足導(dǎo)致心力衰竭，因此，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖是恢復(fù)心功能的關(guān)鍵。Borden等[19]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-294可通過Wee1/CyclinB-CDK1信號(hào)通路使成年小鼠損傷心肌細(xì)胞周期重啟，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，加速損傷心肌修復(fù)，減少心肌損傷面積，進(jìn)而改善心功能。miR-590-3p 也可通過心肌細(xì)胞內(nèi)吞，促進(jìn)梗死周圍心肌細(xì)胞增殖，最終改善心功能[11]。

miRNA被發(fā)現(xiàn)在多種干細(xì)胞外泌體中富集，并介導(dǎo)缺血性心肌的保護(hù)作用。MSC來源外泌體內(nèi)富集的miR-21a-5p，可通過下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白4抗原、人凋亡相關(guān)因子配體等促凋亡基因，減少缺氧心肌細(xì)胞凋亡[20]。CD34+干細(xì)胞群能分泌富含miR-126-3p的外泌體，直接作用于缺血小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過抑制靶基因SPRED1的表達(dá)來促進(jìn)血管生成[21]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的miR-21-5p可能通過PI3K信號(hào)通路，調(diào)節(jié)心肌收縮力和心肌細(xì)胞鈣處理水平，從而改善心功能[22]。心肌祖細(xì)胞衍生的外泌體內(nèi)也有多種促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和血管生成的miRNA富集，如miR-132、miR-210和miR-146等[23]。這些均表明干細(xì)胞可通過旁分泌各種miRNAs在缺血性心臟病中發(fā)揮治療潛力。

3.3 其他

除了細(xì)胞因子及miRNA外，近年來，干細(xì)胞來源外泌體內(nèi)部的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)也被證明是干細(xì)胞通過旁分泌效應(yīng)發(fā)揮心臟保護(hù)作用的重要物質(zhì)[8]。Arslan等[9]研究表明，外泌體來源的多種酶也可提高缺氧小鼠心肌細(xì)胞能量代謝率，改善心肌細(xì)胞缺氧狀態(tài)，減少心肌細(xì)胞凋亡。相信隨著研究深入，其他發(fā)揮心肌保護(hù)作用的旁分泌物質(zhì)也會(huì)相繼被發(fā)現(xiàn)。

4 干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在缺血性心臟病治療中的主要挑戰(zhàn)

干細(xì)胞一度被認(rèn)為具有分化為心肌細(xì)胞從而替代梗死心肌的潛力，但多年來并未被證實(shí)。后來，其旁分泌效應(yīng)被逐漸揭示，并顯示出心臟保護(hù)潛力，但仍有較多因素限制其轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

首先，干細(xì)胞很難在靶部位高效保留。為了增強(qiáng)受損心肌對(duì)治療性生長(zhǎng)因子的捕獲，有學(xué)者試圖利用生物支架材料，使這些細(xì)胞因子能夠在靶部位持續(xù)釋放。Garbayo等[24]在豬心肌梗死模型中，將神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白加載到特殊微粒中，可使治療因子在局部持續(xù)釋放，從而促進(jìn)血管生成，減少心室重構(gòu)，改善左心室功能。部分特殊載體也可增強(qiáng)干細(xì)胞移植效率。Wang等[25]將水凝膠-miR-302復(fù)合物單次注入心肌梗死小鼠心臟，可觀察到心肌細(xì)胞的持續(xù)增殖和心臟功能的改善。此外，改良的基因療法也提高了旁分泌效應(yīng)物質(zhì)的移植和表達(dá)效率。Shan等[26]發(fā)現(xiàn)，用生長(zhǎng)抑制特異性基因6修飾MSC，可增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，以旁分泌方式提高缺氧誘導(dǎo)因子-1等細(xì)胞因子在缺氧條件下的分泌，從而提高心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞存活率，減少心肌梗死面積，改善心功能。

其次，干細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)不僅取決于干細(xì)胞本身的質(zhì)量，還取決于良好的移植微環(huán)境。近年來，各種著力于移植微環(huán)境的研究相繼展開。心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)在梗死區(qū)微環(huán)境中高表達(dá)，Wang等[11]利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在MSC表面表達(dá)一種cTnI靶向的短肽，獲得cTnI靶向外泌體，這些外泌體可沿著cTnI濃度梯度定位于梗死區(qū)域，從而將其攜帶的miR-590-3p高效傳遞至心肌梗死區(qū)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Yang等[27]在干細(xì)胞治療心梗的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞移植前3天～后4天給予每晚1次80 mg阿托伐他汀強(qiáng)化治療后，患者射血分?jǐn)?shù)提高了12.6%，而單用阿托伐他汀治療組僅提高了5%。這提示在干細(xì)胞治療同時(shí)聯(lián)合其他治療途徑，可能改善干細(xì)胞移植前后心肌微環(huán)境，提高干細(xì)胞治療成功率。

5 總結(jié)與展望

干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)是干細(xì)胞治療的重要方式，參與旁分泌效應(yīng)的各種細(xì)胞因子、miRNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)可以通過外泌體等介質(zhì)在靶部位保留，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，抑制炎性反應(yīng)及免疫損傷，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。同時(shí)，外泌體作為旁分泌效應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，從培養(yǎng)的干細(xì)胞中分離提純并用于缺血性心臟病的治療，意味著“無細(xì)胞干細(xì)胞治療時(shí)代”的到來。然而旁分泌效應(yīng)物質(zhì)能否在靶部位高效保留并持續(xù)釋放仍是最大技術(shù)瓶頸。另外，除干細(xì)胞本身因素需重點(diǎn)考慮外，還應(yīng)注重移植微環(huán)境的改善，綜合考慮以期提高干細(xì)胞的治療效果。