氮、磷濃度對太湖水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)群體生長的影響*

許慧萍，楊桂軍＊＊，周 健，秦伯強，張光生，鄒 華，胡細全

(1:江南大學環(huán)境與土木工程學院，無錫 214122)

(2:中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊環(huán)境與科學國家重點實驗室，南京 210008)

(3:湖北大學資源與環(huán)境學院，武漢 430062)

伴隨著我國經濟的快速發(fā)展，大量污染物的產生和排放致使水體富營養(yǎng)化日趨嚴重.由于水體富營養(yǎng)化，太湖最近每年的5-10月都會出現(xiàn)微囊藻水華，給太湖周邊的社會生活和生產造成重大影響和損失[1].盡管對微囊藻水華進行了大量研究[2-3]，然而，到目前為止微囊藻水華暴發(fā)機理還不清楚.

在自然水體中，微囊藻水華暴發(fā)時，大量微囊藻以群體狀態(tài)漂浮在水體表層[4].微囊藻群體的大小對微囊藻在水體中的遷移速度[5-7]、抗捕食壓力[8]和比表面積有重要影響.Wu 等[9]發(fā)現(xiàn)太湖微囊藻水華暴發(fā)時，微囊藻大群體更容易克服水體擾動產生的包裹力，同時微囊藻大群體對太陽輻射的晝夜變化反應不敏感，無論是有風還是無風的情況，大于120 μm 的微囊藻大群體總是聚集于水面上層.Cao 等[10]野外調查發(fā)現(xiàn)太湖大于200 個細胞的大群體微囊藻是構成6月份微囊藻水華的重要組成部分.

在野外條件下，微囊藻主要以群體形態(tài)存在[6]，而轉入室內培養(yǎng)后以單細胞和兩細胞形態(tài)為主[10-12].微囊藻單細胞如何轉變?yōu)槿后w微囊藻這一問題引起了關注.有研究顯示，很多因素都可以誘導單細胞微囊藻形成群體微囊藻，包括生物因子，如鞭毛蟲的攝食[6，13-15]、后生浮游動物攝食[16]、異養(yǎng)菌的誘導作用[17];化學因子，如微囊藻毒素[18];物理因子，如高光照強度[19].盡管有關微囊藻單細胞轉變?yōu)槿后w的研究已經取得了很多進展，然而到目前為止，其機理還不是很清楚.

微囊藻大群體都是由微囊藻小群體生長而來.影響微囊藻群體生長的的因素有很多，包括浮游動物捕食等生物因素以及營養(yǎng)鹽、光照、溫度等非生物因素.營養(yǎng)鹽是影響微囊藻的主要非生物因子之一，其中氮和磷是影響微囊藻生長的主要營養(yǎng)元素.有關氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對微囊藻生長的影響，國內外學者已經做了大量的研究[20-26]，但這些研究都是探討氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對微囊藻單細胞生長的影響，而有關氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對微囊藻群體生長影響的研究國內外未見報道.水華微囊藻是太湖微囊藻水華的主要優(yōu)勢種之一[27].本研究以水華微囊藻小群體為研究對象，以近幾年太湖微囊藻水華暴發(fā)最嚴重的梅梁灣氮磷比的平均值作參考，通過設置不同的氮、磷營養(yǎng)濃度，探討氮、磷濃度對水華微囊藻小群體生長的影響，將有助于人們了解太湖微囊藻水華暴發(fā)機理.

表1 實驗各組培養(yǎng)基中的總氮、總磷濃度Tab.1 Concentrations of TN，TP and culture medium in treatments in this experiment

1 材料與方法

實驗用的水華微囊藻1028 來源于中國科學院武漢水生生物研究所，所有藻種接種于含改良的BG-11液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照設置為3000 lx，光暗周期比為12 h∶12 h.藻種在BG-11 培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，藻種中含有一定量的水華微囊藻單細胞、兩細胞以及小群體后正式開始實驗(藻種中含22.1% 小群體，群體平均大小為3.8 cells).取培養(yǎng)好的藻種分別加入100 ml無氮和無磷的 BG-11 培養(yǎng)液，總氮(TN)、總磷(TP)濃度設置見表1.實驗中 T1 ～ T4 氮磷比(20∶1)模擬近幾年太湖藍藻水華暴發(fā)最嚴重的梅梁灣氮磷比的平均值.T5 中的氮、磷濃度為正常BG-11 培養(yǎng)基中的氮、磷濃度.實驗每組設置3 個平行樣，在上述條件下置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，錐形瓶每天搖動一次.每3 天取樣一次并在顯微鏡(Nikon E200)下觀察計數(shù).測定微囊藻群體大小時通常直接測定群體的直徑.這樣的方法對于野外緊密型的微囊藻群體比較適合.但經觀察在室內培養(yǎng)下的微囊藻群體呈現(xiàn)較松散的立體空間結構，且群體沒有固定的形態(tài)，使用通常的方法測定誤差較大.為避免這樣的誤差，本實驗通過測定單個群體的細胞數(shù)來表示群體的大小.本研究中選取了單細胞、雙細胞、3 ～10 細胞的群體、含10 ～100 細胞的群體以及100 +細胞(＞100 cells)的群體進行計數(shù)[10].本研究中細胞計數(shù)時要求單細胞、雙細胞至少取100 個視野;測定群體大小時至少測定50 群體，然后取平均值.

2 結果

2.1 不同氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對水華微囊藻群體大小的影響

本實驗中，處理組T1、T2、T3 和T4 均有大于100 細胞的群體形成，而處理組T5 整個實驗期間未發(fā)現(xiàn)有較大群體形成(圖1 和圖2).其中，T1、T2、T3 和 T4 組的大群體平均大小依次是151、217、437 和160 cells(圖2)，T3 組中群體平均大小最大(圖1)，表明這個水平的氮、磷濃度最有利于水華微囊藻群體的增長.T5 組中初始時有3 ～10 細胞的群體以及10 ～100 細胞的群體形成，而后消失，表明這個水平的氮、磷濃度過高，不利于水華微囊藻群體的生長，這也可能是在實驗條件下微囊藻以單細胞和兩細胞形態(tài)存在的原因.

圖1 實驗中不同氮、磷濃度培養(yǎng)下水華微囊藻群體大小比較Fig.1 Contrasting on size of M.flos-aquae colonies under different N and P concentrations in this experiment

實驗結果表明，群體大小隨營養(yǎng)鹽濃度變化而變化.T1、T2、T3 和T4 組中群體大小基本上呈增長趨勢，而T5 組中則呈下降趨勢(圖3).T5 組中10 ～100 細胞群體在第12 d 時開始消失(圖3B).

2.2 不同氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對水華微囊藻群體密度的影響

隨著氮、磷營養(yǎng)鹽濃度從TN=0.1 mg/L、TP=0.005 mg/L 升高至TN =10 mg/L、TP=0.5 mg/L，水華微囊藻群體密度依次增高，且大于100 細胞的群體所占比例逐漸增大，TN =10 mg/L、TP=0.5 mg/L 時群體密度達到最大;營養(yǎng)鹽濃度升高至TN =250 mg/L、TP =5.44 mg/L 時，群體密度開始逐漸減小，T5 組中大于100 細胞的群體所占比例為0(圖4).這表明當TN=10 mg/L、TP=0.5 mg/L 時利于水華微囊藻群體大小的增長，而過高的氮、磷營養(yǎng)鹽濃度則會制約其群體的形成.

當營養(yǎng)鹽濃度較低時(TN=0.1 mg/L、TP=0.005 mg/L)，各群體密度增長趨勢并不明顯(圖5A);隨著營養(yǎng)鹽濃度的升高，水華微囊藻群體密度逐漸增大，T2 組中10 ～100 細胞群體和大于100 細胞群體密度開始呈現(xiàn)增長趨勢(圖5B);TN =10 mg/L、TP =0.5 mg/L 時大于100 細胞的群體密度增長速度最快，第21 d時超大群體比例最大，而單細胞數(shù)量幾乎為0(圖5C);TN =100 mg/L、TP =5 mg/L 時，隨著培養(yǎng)時間的增加，各群體密度也逐漸增大，相比較而言，10 ～100 細胞的群體密度大于100 +細胞的群體密度(圖5D);T5組中，細胞密度也以較快速度增長，其中雙細胞增長速度最快，10 ～100 細胞的群體在培養(yǎng)第12 d 時消失，其后一直以單細胞、雙細胞以及3 ～10 細胞的群體形態(tài)存在(圖5E).

圖2 實驗中不同氮、磷濃度水平水華微囊藻群體平均大小比較Fig.2 Contrasting on mean size of M.flos-aquae colonies under different N and P concentrations

圖3 實驗中不同氮、磷濃度水華微囊藻群體大小隨時間變化情況Fig.3 The variation of M.flos-aquae colony size under different N and P concentrations

3 討論

本研究結果顯示，當TN≤10 mg/L、TP≤0.5 mg/L時，氮、磷營養(yǎng)鹽濃度增加有利于水華微囊藻群體增大;當TN ＞10 mg/L、TP ＞0.5 mg/L 以后，氮、磷營養(yǎng)鹽濃度增加抑制水華微囊藻群體增長，不利于水華微囊藻群體增大.研究證實，隨著外界環(huán)境的改變，生物的表現(xiàn)型會發(fā)生相應的改變[28-29].微囊藻聚集效應是微囊藻應對環(huán)境改變最常見的方式.藻類群體中各細胞的聚集主要依靠的是具有粘性的胞外多聚糖，因此，浮游植物群體的形成與胞外多聚糖的含量有著直接的關系[30-34].Yang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻群體形成后胞外多聚糖要顯著多于單細胞胞外多聚糖.張民等[35]研究也發(fā)現(xiàn)群體微囊藻比單細胞微囊藻具有更多的胞外多聚糖.大量研究表明，細胞胞外多糖的分泌與生物和非生物因子(如:光照、營養(yǎng)鹽和溫度等)有重要關系.楊州等[13]發(fā)現(xiàn)在原生動物的強牧食壓力下銅綠微囊藻胞外多聚糖分泌量明顯增加.魚腥藻的胞外多聚糖的釋放受到溫度的影響[36].在一定的光照強度范圍內，藍藻胞外多糖的含量隨著光照強度的增加而增加，光照強度促進了藻類碳水化合物的產生以及胞外多糖的聚合[36-37].

在自然水體中，N、P 濃度是影響浮游植物生長的最主要營養(yǎng)元素[38].研究證實，經分離純化后轉入實驗室的單細胞微囊藻的胞外多糖含量比野外大群體的小得多[39]，因此影響胞外多糖分泌的因素在微囊藻群體的形成上也可能發(fā)揮了至關重要的作用.作為細胞物質合成的主要元素，氮、磷對胞外多糖的影響一直是研究的重點.De Philippis 等[40]研究發(fā)現(xiàn) N限制條件能促進藍藻體內胞外多糖的合成，而在P饑餓或P 缺乏時，一些藻類的多聚糖含量也會升高[41-42].有研究證實:相對的磷限制、氮限制或碳過量(即在較高的C/N 或C/P)能促進一些藻類或細菌胞外多聚糖的分泌，可能有助于細胞的聚合[31，43-44].Otero 等[45-46]發(fā)現(xiàn)，在氮限制或碳過飽和，也就是在不平衡的高碳氮比下，念珠藻(Nostoc sp.)可產生更多的胞外多聚糖，而在含氮豐富的培養(yǎng)基中，念珠藻的胞外多聚糖產量很低.Moreno等[36]發(fā)現(xiàn)魚腥藻(Anabaena sp.)胞外多聚糖產量與培養(yǎng)基中氮的總量呈現(xiàn)負相關關系.研究結果表明，N 限制能夠促進水華微囊藻碳水化合物的合成[47].陽振[19]發(fā)現(xiàn)將銅綠微囊藻(M.aeruginosa)培養(yǎng)在N 濃度為1.98 mg/L、P 濃度為0.65 mg/L或N 濃度更低的條件下，胞外多糖的合成明顯增加.Liu 等[48]用乙醛酸模擬營養(yǎng)脅迫對柵藻(S.obliquus)多糖產量的影響進行研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的乙醛酸對柵藻的增長無明顯影響，而高濃度則抑制其生長，且乙醛酸處理組中，有柵藻群體形成，實驗組中多糖產量、乙醛酸含量以及顆粒細胞數(shù)兩兩呈現(xiàn)正相關，Yang 等[49]在多糖含量對小球藻(C.pyrenoidosa)群體聚集影響時也發(fā)現(xiàn)多糖含量隨乙醛酸濃度的增加而增加，且胞外多糖含量同小球藻群體大小直接相關.

圖4 實驗中不同氮、磷濃度水華微囊藻各形態(tài)的平均密度Fig.4 The mean density of different units of M.flos-aquae under different N and P concentrations in this experiment

圖5 實驗中不同氮、磷濃度下水華微囊藻各形態(tài)平均密度隨時間的變化Fig.5 The density variation of different units of M.flos-aquae under different N and P concentrations in this experiment

本實驗中，T5 處理組所用培養(yǎng)基為含N 和P 極高的BG-11 培養(yǎng)基(TN=250 mg/L、TP=5.44 mg/L)，一直未形成超大群體，大群體也在隨后幾天消失.高濃度的氮、磷營養(yǎng)鹽可能抑制了微囊藻細胞胞外多糖的分泌，最終制約了微囊藻群體的形成.T1 組中大群體在第12 d 后開始緩慢減少，T1 組中氮、磷營養(yǎng)鹽濃度水平較低，隨著培養(yǎng)時間的增長，營養(yǎng)鹽逐漸被消耗，因此大群體密度開始逐漸減少.本實驗設置的濃度梯度中，TN =10 mg/L、TP=0.5 mg/L 時微囊藻超大群體大小最高達到900 cells(圖3C)，因此，在一定范圍內，其群體密度隨著營養(yǎng)鹽含量的升高而升高.過高的營養(yǎng)鹽則制約了胞外多糖的合成，由此可以得到T5 組多為單細胞和雙細胞而沒有超大群體形成的原因.通常情況下，實驗室中多用BG-11 培養(yǎng)基培養(yǎng)微囊藻，由此可以解釋為何在實驗室條件下很難獲得微囊藻群體.本研究表明，適宜的氮、磷濃度有利于微囊藻群體的生長，過低或過高的氮、磷濃度都不利于微囊藻群體的生長.

梅梁灣位于太湖北部，每年5-10月微囊藻水華暴發(fā)頻繁[1].同世界各地富營養(yǎng)化湖泊一樣，梅梁灣氮、磷水平較高(平均TN=4.57 mg/L、TP=0.165 mg/L)[50-51].水華微囊藻是太湖微囊藻水華暴發(fā)的主要優(yōu)勢種之一[52].本實驗結果表明從T1 ～T3，隨氮、磷營養(yǎng)鹽濃度增加，微囊藻藻群體也增大，其中，T1 為TN =0.1 mg/L、TP=0.005 mg/L;T3 為 TN=10 mg/L、TP=0.5 mg/L，太湖梅梁灣的氮、磷濃度處于 T1 ～ T3 之間，說明目前太湖氮、磷濃度水平有利于水華微囊藻群體的增長.本文研究結果可為解釋太湖以及其它富營養(yǎng)水體微囊藻水華頻發(fā)提供參考.

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