基于“腎絡(luò)癥瘕”理論探討腎炎防衰液治療腎間質(zhì)纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與機制*

劉夢超，王明哲，肖 遙，沈 存，王夢迪，趙文景

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100010）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是大多數(shù)慢性腎臟疾病的共同途徑，以成纖維細胞增生、細胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)過度沉積為主要病理特征，在腎臟結(jié)構(gòu)和功能的逐步喪失中起重要作用。無論是腎小球疾病、腎小管間質(zhì)病變還是腎血管疾病，其腎功能損害的程度都與RIF密切相關(guān)[1-2]。腎間質(zhì)纖維化程度也被認為是預(yù)后指標和治療指導(dǎo)之一，然而目前在RIF的防治方面尚缺乏有效的措施。

中醫(yī)藥治療RIF具有一定優(yōu)勢?！澳I絡(luò)癥瘕”理論[3-4]是王耀獻以絡(luò)病學(xué)說、癥瘕理論、腎臟病理研究為基礎(chǔ)，由呂仁和糖尿病腎病“腎絡(luò)微型癥瘕”理論發(fā)展推進而成，已形成理、法、方、藥較完備的中醫(yī)藥治療慢性腎臟疾病的理論體系。該理論認為慢性腎臟疾病的主要病機是腎疾日久，失治誤治，“腎絡(luò)徵瘕”形成，終致腎用失司，濕濁瘀毒潴留。聚散消長是“腎絡(luò)癥瘕”理論的核心病機，持續(xù)的聚散失衡，腎絡(luò)痰濕、瘀血、瘀毒漸聚膠結(jié)，即成“腎絡(luò)癥瘕”，與RIF的病理發(fā)展過程相符合。

王耀獻教授提倡應(yīng)用消癥散結(jié)法，常用腎炎防衰液治療RIF[5]。腎炎防衰液由黃芪、當歸、海藻、熟地黃、大黃組成，有補氣扶正、消癥散結(jié)之功，經(jīng)多年臨床證實其療效確切。前期臨床試驗提示腎炎防衰液可延緩CKD5期非透析患者的首次進入透析時間，減少CKD5期患者透析事件發(fā)生率[6]；多項針對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（unilateral ureteral obstruction,UUO）誘導(dǎo)的RIF大鼠模型的實驗研究顯示，腎炎防衰液對RIF具有抑制炎癥、減少細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）積聚等作用[7-8]，但其具體機制尚未完全探明。因此，本研究通過可體現(xiàn)中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探尋腎炎防衰液治療RIF的具體機制，以期為進一步的研究提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腎炎防衰液有效成分及作用靶點的篩選 以“黃芪”“當歸”“海藻”“熟地黃”“大黃”為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索腎炎防衰液的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18進行篩選，獲取腎炎防衰液的活性成分，并在該數(shù)據(jù)庫查詢這些成分的對應(yīng)靶點。另以“HUANG QI”“DANG GUI”“HAI ZAO”“DI HUANG”“SHU DI HUANG”“DA HUANG”為關(guān)鍵詞，于BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http://bionet.Ncpsb.org/batman-tcm/)以“P＜0.05且Score cutoff≥39”為標準篩選腎炎防衰液的有效成分及作用靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點信息進行規(guī)范化處理。將上述篩選后的成分與靶點合并后去除重復(fù)項，建立“中藥-成分-靶點”數(shù)據(jù)庫。

1.2 RIF作用靶點的獲取 以“renal interstitial fibrosis”為關(guān)鍵詞，應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://genecards.weizmann.ac.il/v3/）、DisGeNET平臺（https://www.disgenet.org/home/）獲取RIF相關(guān)靶點，利用UniProt數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范化處理，合并后去掉重復(fù)項，獲得RIF作用靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.3.1 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.1”項中獲取的成分靶點與“1.2”項中的RIF作用靶點通過韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，獲得共有靶點，即腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點。將其導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后將該文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件進行分析，獲得核心靶點。

1.3.2 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將共有靶點與其對應(yīng)中藥成分通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，利用“Network analyze”功能進行分析，并通過該軟件的Centiscape插件根據(jù)自由度篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心成分。

1.3.3 “中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于“1.3.2”項的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，與RIF、疾病靶點、中藥關(guān)聯(lián)，應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件繪制“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)并進行分析。

1.4 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 通過Cytoscape3.7.2的Clue GO 2.5.4插件對共有靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，獲取腎炎防衰液治療RIF的主要通路。

1.5 分子對接預(yù)測 通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載核心成分的mol2格式，通過Chem3D對所下載的化合物進行能量最小化，并轉(zhuǎn)化為pdb格式；通過PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載自由度前5位核心靶點的晶體結(jié)構(gòu)PDB格式文件。采用AutoDock Tools-1.5.6軟件對上述文件進行常規(guī)處理，將處理后的化合物作為小分子配體，5種蛋白靶點作為受體，根據(jù)小分子與靶點的作用位點確定的Grid Box的中心位置以及長寬高，最后通過AutoDock vina和python腳本進行批量對接，對分子對接結(jié)果進行分析，化合物與蛋白的結(jié)合作用可視化采用Pymol軟件。

2 結(jié) 果

2.1 藥物成分篩選與潛在作用靶點的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫與BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進行篩選，獲得黃芪的活性成分38個，當歸的活性成分124個，海藻的活性成分5個，熟地黃的活性成分5個，大黃的活性成分28個，總計200個。黃芪的潛在作用靶點253個，當歸的潛在作用靶點468個，海藻的潛在作用靶點100個，熟地黃的潛在作用靶點94個，大黃的潛在作用靶點249個，總計1 164個。5種中藥潛在作用靶點再次合并去重，獲得腎炎防衰液潛在作用靶點共701個。將5種中藥的潛在作用靶點繪制韋恩圖，可見多種中藥具有共同靶點。（見圖1）

圖1 中藥潛在作用靶點分布

2.2 RIF靶點及共有靶點的獲取 應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取RIF靶點328個，通過DisGeNET平臺獲得138個，兩者合并去重后獲得RIF潛在靶點共429個，與腎炎防衰液的潛在作用靶點通過韋恩圖取交集，獲得76個共有靶點（見圖2），這些靶點可能是腎炎防衰液治療腎間質(zhì)纖維化的潛在作用靶點。將這些靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，導(dǎo)出數(shù)據(jù)后應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共涉及76個節(jié)點和967條邊，節(jié)點表示成分與靶點，邊表示兩者之間相互作用，自由度是重要的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，表示與該節(jié)點直接相互作用的節(jié)點的數(shù)目，自由度越大，其關(guān)聯(lián)的生物功能越多，在網(wǎng)絡(luò)中的重要性就越大。結(jié)果顯示，共有37個靶點自由度值高于平均值（25.78），表明與其他蛋白相互作用較強，可能具有重要作用。（見表1）

表1 自由度大于平均值的重要靶點

圖2 RIF與腎炎防衰液的潛在作用靶點分布

2.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將“2.2”項中獲取的76個共有靶點與其對應(yīng)的117個中藥成分通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，篩選腎炎防衰液治療RIF相關(guān)的活性成分。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)共涉及194個節(jié)點，488條邊，節(jié)點的最大自由度為75，大于平均自由度（5.03）的活性成分有24個。（見表2）。

表2 可能參與腎炎防衰液治療RIF的活性成分

2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將中藥、包含共有靶點的成分、共有靶點與RIF通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，紅色六邊形節(jié)點代表疾病，綠色菱形節(jié)點代表中藥，藍色矩形節(jié)點代表腎炎防衰液主要活性成分，黃色三角形節(jié)點代表潛在作用靶點。該網(wǎng)絡(luò)共有200個節(jié)點，682條邊，聚類系數(shù)0.357，網(wǎng)絡(luò)密度0.032，最短路徑為39 006（100%），網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性1.325，平均自由度為6.333。（見圖3）

圖3 腎炎防衰液治療RIF“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG富集分析 將腎炎防衰液治療RIF的共有靶點進行KEGG通路富集分析，篩選校正P≤0.01的項目，共富集到99條信號通路，根據(jù)P值由小到大排列，發(fā)現(xiàn)腎炎防衰液可能通過以下途徑參與RIF的治療，如糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、松弛素信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、白介素-17（IL-17）信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、脂肪細胞脂肪分解的調(diào)節(jié)、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路、Toll樣受體（TLRs）信號通路等。（見表3）

表3 腎炎防衰液治療RIF的潛在信號通路

2.6 分子對接 將24個核心成分作為小分子配體，選取自由度前5位的INS（PDB ID：6S4J）、IL-6（PDB ID：2HMH）、ALB（PDB ID：6RQ7）、VEGFA（PDB ID：4KZN）、TNF（PDB ID：2AZ5）作為蛋白受體進行分子對接，并獲取其結(jié)合能。若結(jié)合能＜0，表明兩者可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol為分子與靶點結(jié)合性較好[9]，結(jié)合能越小表明結(jié)合活性越好。結(jié)果顯示，表中77.5%的活性成分可與靶點蛋白較好地結(jié)合。（見表4）將上述各基因與其結(jié)合排名前2位的化合物的分子對接模式可視化，可見上述化合物可很好地匹配INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF的活性口袋。（見圖4）

表4 腎炎防衰液核心成分與5種蛋白靶點的結(jié)合能（kJ/mol）

圖4 活性成分與靶點蛋白的結(jié)合模式

3 討 論

RIF的主要病理表現(xiàn)為間質(zhì)成纖維細胞的增殖，ECM的過度沉積，細胞凋亡，腎小管損傷與大量炎癥細胞浸潤，其具體機制復(fù)雜，涉及多種炎癥細胞和細胞因子信號傳導(dǎo)之間復(fù)雜的相互作用，單一途徑的藥物很難奏效。因此，中醫(yī)藥的多成分、多靶點、多途徑的特點具有一定優(yōu)勢。

腎炎防衰液是基于“腎絡(luò)癥瘕”理論而成，氣滯血行不暢、絡(luò)脈失養(yǎng)、氣血瘀滯、津凝痰結(jié)、絡(luò)毒蘊結(jié)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的血流動力學(xué)異常、細胞的保護及損傷、細胞因子的調(diào)節(jié)至ECM等有形之質(zhì)的形成過程有一定相似之處[3-4]。在中醫(yī)方面消癥散結(jié)，改善氣血、痰濁、絡(luò)毒等淤積，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方面改善大量炎癥細胞浸潤、抑制ECM的過度沉積等是本方的初衷。目前，前期臨床及動物實驗已證實其對RIF具有治療作用，但具體機制尚未完全清楚，因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索其藥效學(xué)基礎(chǔ)及潛在作用機制以指導(dǎo)進一步的研究。

經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選，本研究共發(fā)現(xiàn)76個腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點，包括INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF、MAPK1、IL-1β、EGF、EGFR、TP53、MAPK8、NOS3、MMP9、CCL2、PTGS2、MAPK14、MMP2等。包含這些靶點的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、7-O-甲基異丙醇胺、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、異鼠李亭、苯丁烯酮等。藥理學(xué)研究表明，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮均具有一定的抗炎、抗腫瘤作用。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是迄今研究最多、最重要的致纖維化細胞因子，槲皮素可通過抑制TGF-β來延緩腎纖維化[10]。異鼠李素是源自槲皮素的代謝物，可調(diào)節(jié)NF-κB、PI3K/Akt、MAPK及其下游因子，阻斷TLR4途徑，減少ROS的產(chǎn)生以減輕炎癥反應(yīng)，還可抑制ROS介導(dǎo)的HIF-1α積累來發(fā)揮腎臟保護作用[11-12]。山萘酚可通過激活BMP-7-Smad1/5信號通路改善腎纖維化[13]。大黃酸是大黃中最具生物活性的成分，可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR途徑來抑制UUO大鼠腎小管細胞的自噬，抑制UUO誘導(dǎo)的p-STAT3、膠原蛋白I和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）[14-15]。此外，β-谷甾醇、豆甾醇還具有明顯的降脂作用[16-17]，芒柄花黃素有抗氧化、降低高血糖、胰島素抵抗等作用[18]。這些成分是腎炎防衰液發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，提示腎炎防衰液可能通過抗炎、調(diào)節(jié)自噬、糖脂代謝等發(fā)揮治療作用。

本研究進一步將76個腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點進行KEGG富集，發(fā)現(xiàn)腎炎防衰液可能通過抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)糖脂代謝、自噬、ECM的沉積等多個方面延緩RIF進程，與上文中活性成分的作用相符。

炎癥反應(yīng)在RIF的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。多種趨化因子、白細胞介素家族、黏附分子等可以刺激一系列炎癥信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致ECM過度沉積，腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎功能不全。經(jīng)KEGG富集的通路中，TNF信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等均與炎性損傷密切相關(guān)。JAK/STAT信號通路是誘導(dǎo)巨噬細胞活化的重要通路?；罨蟮哪I間質(zhì)巨噬細胞可釋放大量的炎癥因子，進而促進成纖維細胞的激活，誘導(dǎo)腎小管上皮細胞的分化與凋亡。此外，巨噬細胞的浸潤還可增加膠原的沉積，進一步加速RIF的進程。在本研究發(fā)現(xiàn)的潛在作用靶點中，多種細胞因子與JAK/STAT通路的激活相關(guān)，如IL-2與STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B的激活密切相關(guān)，IL-6可激活STAT1和STAT3，EGF可激活STAT3，IL-13可激活STAT6等。STAT1可與Runx調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合，作用于Smad3，STAT3與NF-κB的p50和p65亞基可直接結(jié)合，STAT1也與NF-κB存在協(xié)同作用[19-20]。可見JAK/STAT通路與本研究富集出的多個通路存在相互作用。TNF-α是TNF信號通路、MAPK信號通路和T細胞受體信號通路的關(guān)鍵因子，其作為最重要的炎癥因子之一參與了RIF進程。激活的單核-巨噬細胞、損傷的腎小管上皮細胞、內(nèi)皮細胞等均可產(chǎn)生該因子，其具有加速ECM堆積、損傷腎單位、促進系膜細胞增殖、加速脂質(zhì)代謝等的作用，可進一步加重RIF。同時，TNF-α與NF-κB也存在協(xié)同作用，其升高可促進NF-κB水平的升高和NF-κB信號通路的激活，從而進一步增加炎癥因子的表達，導(dǎo)致炎癥損傷的加重。此外，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）與絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）均參與介導(dǎo)腎纖維化中的促炎和促纖維化途徑[21]。松弛素可在UUO的早期階段下調(diào)TLR4-NF-κB信號通路，使巨噬細胞極化向M2表型轉(zhuǎn)移，并改善RIF[22]。

自噬在RIF初期具有保護腎臟的作用，但自噬的持續(xù)激活可促進纖維化的產(chǎn)生[23]。PI3K/Akt信號通路具有調(diào)控自噬的作用，與RIF炎性損傷的發(fā)生有關(guān)，其主要被TGF-β1激活，且參與其誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程[24]，還可通過mTOR信號通路的激活抑制細胞自噬[25]。

此外，MMPs/組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）的失衡直接影響ECM的沉積，在RIF的機制中具有重要的位置。本研究發(fā)現(xiàn)的潛在作用靶點中，MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、PLG，COL1A1是MMPs活化和膠原降解中的重要因子，可調(diào)控ECM的沉積，與腎炎防衰液擬通過消癥散結(jié)法改善腎纖維化的初衷相通。

綜上所述，本研究篩選出腎炎防衰液多種可改善RIF的活性成分，發(fā)現(xiàn)其可能參與治療RIF的多種途徑，其中與炎癥反應(yīng)相關(guān)最多。全方可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控自噬、調(diào)節(jié)糖脂代謝等延緩RIF的發(fā)展。提示腎炎防衰液在抑制炎癥反應(yīng)方面的研究前景廣闊，對自噬反應(yīng)的調(diào)控也尚待進一步的研究。