基于TLR4通路探討自擬清熱涼血方對(duì)牙周炎大鼠的抑炎作用及對(duì)牙周組織生長(zhǎng)的影響*

許 楠，趙雁煥，楊春山

（唐山市協(xié)和醫(yī)院，河北 唐山 063000）

牙周炎是牙齒周圍組織慢性破壞性進(jìn)行性疾病，可引起牙齦發(fā)炎、牙周袋及牙槽骨吸收陷窩形成，導(dǎo)致牙齒動(dòng)搖甚至脫落。我國(guó)牙周病患病率高達(dá)92%，是成年人牙齒損傷及缺失的主要原因[1]。致病微生物是牙周病的主要因素，研究表明牙菌斑中革蘭氏陰性厭氧菌與牙周炎發(fā)生密切相關(guān)[2]。大多數(shù)牙周病組織損傷由宿主本身對(duì)感染應(yīng)答引起，如牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物可通過(guò)白介素、前列腺素、一氧化氮和基質(zhì)金屬蛋白酶等導(dǎo)致骨吸收與組織炎癥。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為牙周炎與腎虛、氣血不足及胃火上炎有關(guān)，故補(bǔ)氣養(yǎng)腎、清熱敗火是治療該病的關(guān)鍵[3]。自擬清熱涼血方由生地黃、赤芍、梔子、連翹、淡竹葉、玄參、牡丹皮、水牛角、川黃柏、白茅根、茜草和紫草組成，有清胃瀉火、消腫止痛、滋陰補(bǔ)腎、益精固齒、調(diào)補(bǔ)氣血、養(yǎng)齦健齒的作用[4]。Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）屬于天然免疫受體家族，其表達(dá)受到腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子調(diào)節(jié)，TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥免疫反應(yīng)中起著重要調(diào)控作用[5]。研究表明，許多中藥是通過(guò)TLRs信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，如金茵清熱口服液可以活化髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）依賴型TLR信號(hào)通路，而且TLR2抑制劑可以阻斷金茵清熱口服液介導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory Factor 3，IRF3）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的核轉(zhuǎn)位[6]。TLR4通路抗牙周炎及對(duì)牙周組織生長(zhǎng)的影響作用機(jī)制研究較少，本研究通過(guò)建立牙周炎大鼠模型，探討自擬清熱涼血方對(duì)牙周炎大鼠的影響及可能作用機(jī)制，旨在為臨床治療牙周炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡健康SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠85只，體質(zhì)量（250±35）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0003。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前于室溫23～25℃，濕度50%～65%，人工12 h晝/夜循環(huán)照明，分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水。本研究經(jīng)唐山市協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 自擬清熱涼血方，方藥組成：生地黃20 g，赤芍12 g，梔子10 g，連翹12 g，淡竹葉8 g，玄參15 g，牡丹皮12 g，水牛角30 g（先煎），川黃柏15 g，白茅根15 g，茜草30 g，紫草30 g，上述藥材由唐山市協(xié)和醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)唐山市協(xié)和醫(yī)院中藥房主任鑒定為正品，上述藥材加水1 L，文火煎煮，濃縮至300 mL。

TLR4通路抑制劑IAXO-102（美國(guó)MedChemExpress公司，批號(hào)：HY-125171，純度＞98.0%）；兔抗大鼠MYD88單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab133739）；NF-κB p65多克隆抗體（美國(guó)Abbkine公司，批號(hào)：ABP51951）；p-NF-κB p65多克隆抗體（美國(guó)Abbkine公司，批號(hào)：ABP0043）；TLR4多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab13556）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：A0208）；熒光定量PCR試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：11201ES08）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：11141ES10）；TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司，批號(hào)：tw045949）；IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司，批號(hào)：tw039569）。

1.3 主要儀器HBS-1101全自動(dòng)酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CX-41型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；CFX熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.4 造模及分組85只大鼠隨機(jī)取70只，按照徐梅等[7]的方法建立牙周炎大鼠模型，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射輕度麻醉，仰臥固定，用絲線結(jié)扎上頜右側(cè)第一磨牙2～3圈，在牙齦上縫一針固定絲線。從實(shí)驗(yàn)當(dāng)天起，喂10%蔗糖水及軟飼料（大鼠正常飼料上噴含大鼠糞便的水，使其變軟）。造模4周后，肉眼檢查大鼠牙齦組織有充血、出血、腫脹、溢膿、潰瘍、糜爛等現(xiàn)象出現(xiàn)，并且牙齦指數(shù)≥2，即為建模成功。國(guó)際通用牙齦指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8]：牙齦健康，為0分；牙齦輕度炎癥即牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血，為1分；牙齦中等炎癥即牙齦色紅，水腫光亮，探診出血，為2分；牙齦嚴(yán)重炎癥即牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動(dòng)出血傾向，為3分。將建模成功的64只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、抑制劑組、自擬清熱涼血方低劑量組（簡(jiǎn)稱低劑量組）、自擬清熱涼血方高劑量組（簡(jiǎn)稱高劑量組），每組16只，其余15只大鼠為正常對(duì)照組。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 建模成功后開(kāi)始干預(yù)，灌胃劑量按照《中藥藥理學(xué)》[9]中人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表計(jì)算。低、高劑量組大鼠分別灌胃自擬清熱涼血方，0.75、1.50 mg/kg；抑制劑組、正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每只大鼠均灌胃等量生理鹽水，2次/d。同時(shí)抑制劑組腹腔注射TLR4通路抑制劑IAXO-102（IAXO-102溶于無(wú)水乙醇，用生理鹽水稀釋為無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%），3 mg/kg。其余各組腹腔注射等量含5%無(wú)水乙醇的生理鹽水，1次/d。各組大鼠連續(xù)用藥3個(gè)月。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況觀察 觀察各組大鼠造模前、干預(yù)結(jié)束后24 h一般情況，包括毛發(fā)、飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量等。

1.6.2 牙齦指數(shù) 根據(jù)“1.4”中國(guó)際通用牙齦指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估各組大鼠干預(yù)后牙齦指數(shù)變化。

1.6.3 動(dòng)物取材及處理 完成一般情況及牙齦指數(shù)檢測(cè)后，大鼠以3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，摘眼球法采集靜脈血2 mL，隨后分離上頜右側(cè)磨牙區(qū)，冰上剝離牙周組織，分為3份，2份置于液氮保存，1份置于10%福爾馬林固定。

1.6.4 ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-1β水平 取靜脈血，3 500 r/min，離心5 min，離心半徑為8 cm，取上層血清，-20℃保存?zhèn)溆?，測(cè)定TNF-α和IL-1β的含量。按照酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書加樣，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光（A值），通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出TNF-α和IL-1β的含量。

1.6.5 HE染色觀察牙周組織病理學(xué)變化 取10%福爾馬林固定牙周組織，10%鹽酸脫鈣，流水沖洗24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，厚4～5 μm，HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察牙齦、牙周膜及牙槽骨等牙周組織病變。

1.6.6 RT-qPCR檢測(cè)TLR4 mRNA、MYD88 mRNA及NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 取1份液氮保存牙周組織，冰上研磨，用TRIzol法提取總RNA，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為A：預(yù)變性95℃3 min；B：變性95℃15 s；退火56℃20 s，延伸72℃20 s，共45個(gè)循環(huán)；C：72℃5 min，4℃終止反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因，取均值，采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6.7 Western blotting檢 測(cè)TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1份液氮保存牙周組織，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心取上清用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，95℃水浴使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別加入1∶1 000稀釋的MYD88、N-FκB p65、p-NF-κB p65單克隆抗體，TLR4多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入1∶4 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，各蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模前，所有大鼠毛發(fā)光亮、飲食正常、活動(dòng)靈敏。干預(yù)后，正常對(duì)照組大鼠毛發(fā)光亮，飲食及活動(dòng)正常；模型對(duì)照組大鼠皮毛粗糙無(wú)光澤，少動(dòng)，食欲不振，體質(zhì)量減輕；與模型對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠皮毛逐漸恢復(fù)光澤，食欲變好，活動(dòng)增加，體質(zhì)量明顯增加。

2.2 各組大鼠牙齦指數(shù)比較 正常對(duì)照組大鼠牙齦指數(shù)為0；模型對(duì)照組大鼠牙齦指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙齦指數(shù)均低于模型對(duì)照組（P＜0.01）；高劑量組和抑制劑組大鼠牙齦指數(shù)明顯低于低劑量組（P＜0.01）；抑制劑組大鼠牙齦指數(shù)明顯低于高劑量組（P＜0.01）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠牙齦指數(shù)比較s，分）

表2 各組大鼠牙齦指數(shù)比較s，分）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01；與高劑量組比較，dP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg） 牙齦指數(shù)正常對(duì)照組 15 - 0模型對(duì)照組 16 - 2.21±0.32a低劑量組 16 0.75 1.11±0.12b高劑量組 16 1.50 0.70±0.08b c抑制劑組 16 3.00 0.34±0.04b c d F 46.422 P 0.000

2.3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組和抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較，ng/L）

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較，ng/L）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）TNF-α IL-1β正常對(duì)照組 15 - 125.32±10.32 108.62±11.85模型對(duì)照組 16 - 259.62±15.78a 268.68±21.32a低劑量組 16 0.75 164.21±13.25ab 172.16±18.24ab高劑量組 16 1.50 150.02±12.15abc 146.32±15.22abc抑制劑組 16 3.00 135.54±11.05abcd 128.14±12.36abcd F 325.041 152.154 P 0.000 0.000

2.4 HE染色觀察牙周組織病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠牙周組織正常；模型對(duì)照組大鼠牙齦組織糜爛、潰瘍，炎癥細(xì)胞形成，牙周袋出現(xiàn)并加深，牙槽骨骨吸收陷窩形成；低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙齦組織破壞情況得到改善，炎癥細(xì)胞減少，牙周袋逐漸變淺，牙周間隙逐漸恢復(fù)正常，牙槽骨出現(xiàn)新生，且抑制劑組修復(fù)效果更好。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠牙周組織病理學(xué)變化比較（HE，×400）

2.5 各組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA及NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與高劑量組比較，抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。5組大鼠牙周組織NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表4）

表4 各組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較s）

表4 各組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較s）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01；與高劑量組比較，dP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）TLR4 mRNA MYD88 mRNA NF-κB p65 mRNA正常對(duì)照組15 - 0.32±0.02 0.29±0.03 1.12±0.05模型對(duì)照組16 - 0.98±0.05a 1.15±0.06a 1.09±0.06低劑量組 16 0.75 0.62±0.04ab 0.73±0.05ab 1.12±0.04高劑量組 16 1.50 0.51±0.03abc 0.61±0.03abc 1.11±0.05抑制劑組 16 3.00 0.43±0.03abcd 0.48±0.02abcd 1.11±0.03 F 793.509 977.533 1.072 P 0.000 0.000 0.377

2.6 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與高劑量組比較，抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。5組大鼠牙周組織NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖2、表5）

表5 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表5 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01；與高劑量組比較，dP＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）TLR4 MYD88 NF-κB p65 p-NF-κB p65正常對(duì)照組 15 -模型對(duì)照組 16 -低劑量組 16 0.75高劑量組 16 1.50抑制劑組 16 3.00 F 229.227 343.869 0.148 482.911 P 0.000 0.000 0.963 0.000 0.29±0.02 0.83±0.09a 0.58±0.06a 0.50±0.04abc 0.38±0.03abcd 0.31±0.03 0.85±0.08a 0.56±0.04ab 0.47±0.03abc 0.37±0.02abcd 0.89±0.05 0.89±0.06 0.88±0.05 0.88±0.07 0.89±0.05 0.39±0.03 0.79±0.04a 0.57±0.03ab 0.51±0.03abc 0.37±0.02abcd

圖2 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)western blotting圖

3 討 論

牙周炎是一種慢性破壞性炎癥疾病。牙菌斑是導(dǎo)致牙周炎的起始因子，牙菌斑中各種致病微生物及毒素不僅直接破壞牙周組織，還通過(guò)宿主自身免疫反應(yīng)與多種炎癥細(xì)胞因子損傷牙周組織。目前牙周炎治療方式主要是基礎(chǔ)治療與手術(shù)治療，并輔以抗生素，但抗生素存在副作用，且長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致致病微生物產(chǎn)生抗藥性。中醫(yī)學(xué)稱牙周炎為牙宣，牙宣之病變雖在牙周組織，但與全身臟腑氣血陰陽(yáng)之盛衰有密切因果關(guān)系，尤與胃火、腎虛、氣血不足有關(guān)，清熱涼血中藥有敗火、消腫、補(bǔ)氣、養(yǎng)腎功能，對(duì)牙周炎有明顯療效。因此，本研究用自擬清熱涼血方對(duì)牙周炎模型大鼠進(jìn)行治療，探究其對(duì)牙周炎的抑炎作用及對(duì)牙周組織生長(zhǎng)的影響，旨在為臨床治療提供思路。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“腎主骨，齒為骨之余”，牙齒與骨一樣由腎滋養(yǎng)，因此出現(xiàn)腎陰虛則虛火上炎，牙齦萎縮、紅腫、牙根頸宣露、牙齒松動(dòng)，治宜滋腎陰、清火邪為主[10]。清熱涼血方中的生地黃有清熱、生津、滋陰、養(yǎng)血的功效；赤芍和茜草有涼血止血、活血祛瘀的功效；梔子具有清熱瀉火、涼血解毒、消腫止痛的功效；連翹主要治心肺積熱；淡竹葉有清熱、瀉火、利尿的功效；玄參清熱涼血，滋陰降火；牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀、退虛熱等功效；水牛角有清熱、涼血、定驚、解毒的作用；川黃柏和白茅根有清熱解毒、涼血止血、瀉火燥濕等功效；紫草活血涼血，補(bǔ)中益氣。諸藥合用，共奏清熱解毒、涼血、滋腎補(bǔ)氣之功效。有研究表明生地黃、赤芍、枸杞子、金銀花、連翹和丹參組成的養(yǎng)腎平消方用于治療慢性牙周炎，治療組臨床有效率高于對(duì)照組，牙周指數(shù)明顯降低，揭示其對(duì)牙周炎具有抑制作用[11]。張建霞等[12]通過(guò)檢測(cè)牙周炎模型大鼠血清IL-4、IL-6和TNF-α水平及牙周組織病理學(xué)變化，證實(shí)補(bǔ)腎堅(jiān)骨湯（主要成分為熟地黃、川黃柏）通過(guò)降低IL-6和TNF-α水平，升高IL-4水平，達(dá)到抑制牙周組織炎癥、減緩牙周組織破壞的作用。另有研究采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)觀察中藥補(bǔ)腎合劑治療牙周炎的效果，發(fā)現(xiàn)其可降低牙周炎大鼠外周血中TNF-α的含量，改善牙周局部情況，補(bǔ)腎合劑主要成分為生地黃、川黃柏、白茅根等[13]。本研究中，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠皮毛逐漸恢復(fù)光澤，食欲變好，活動(dòng)與體質(zhì)量增加，牙齦指數(shù)降低，血清TNF-α和IL-1β水平降低，牙周組織病理學(xué)變化得到改善，提示清熱涼血中藥能減輕牙周組織炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是目前公認(rèn)的與牙周炎關(guān)系最密切的口腔細(xì)菌，屬于革蘭氏陰性菌[14]。TLR4主要識(shí)別Pg細(xì)胞膜上的脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS），LPS與TLR4結(jié)合，通過(guò)MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)炎癥因子的分泌[15]。MyD88的啟動(dòng)使下游的I-κB迅速被磷酸化激活，與NF-κB解離，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與激活蛋白1共同作用促使細(xì)胞因子TNF-α、IL-1等分泌，形成組織周圍炎癥反應(yīng)[16]。慢性牙周炎組IL-1β含量明顯高于健康組，而且TLR4蛋白表達(dá)明顯增加，揭示牙周炎發(fā)生可能與TLR4跨膜蛋白有關(guān)[17]。有TLR4在介導(dǎo)牙周組織炎癥的信號(hào)傳遞，參與牙周組織破壞過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[18-20]。本研究中低劑量組、高劑量組及抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，TLR4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，提示自擬清熱涼血方能通過(guò)抑制TLR4通路發(fā)揮抑炎作用。

綜上所述，自擬清熱涼血方對(duì)大鼠牙周炎有抑炎作用且影響牙周組織生長(zhǎng)，可能是通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路發(fā)揮作用的，為臨床牙周炎的治療提供了理論依據(jù)。