益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)不確定度的評(píng)定

商迎輝，李夢(mèng)潔，劉蕓如，黃漢昌，勞鳳學(xué)

（北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院 生物化學(xué)工程學(xué)院 北京 100191）

益生菌是對(duì)人體有益的活性菌群，能增強(qiáng)人體的免疫力[1]，促進(jìn)腸道的健康，預(yù)防和改善腹泄等狀況[2]。其中，雙歧桿菌不但可產(chǎn)生B1、B2、B6、B12等多種維生素及氨基酸，還可產(chǎn)生有機(jī)酸，使有害菌或一些致病菌因腸內(nèi)pH 值的下降而死亡。另外，益生菌必須滿(mǎn)足可食用性、安全性和穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)再加工生產(chǎn)后仍然穩(wěn)定且具有活性，可以耐受胃酸、膽汁和胰酶的消化，可在體內(nèi)繁殖[3]。

益生菌每日的攝入量決定其益生效果，到達(dá)腸道內(nèi)的益生菌數(shù)為106CFU/g（mL）時(shí)才能對(duì)人體產(chǎn)生益生效果[4]。益生菌類(lèi)保健食品應(yīng)含有與其益生作用相對(duì)應(yīng)的菌種和最低的含量值?！兑嫔?lèi)保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定（試行）》中規(guī)定益生菌類(lèi)保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)的活菌數(shù)量的最小值為106CFU/g（mL）。

不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[5]。《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》[6]和《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》[7]中明確要求：微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有對(duì)測(cè)量不確定度評(píng)定的相應(yīng)能力。

不確定度的評(píng)定一般用A 類(lèi)評(píng)定和B 類(lèi)評(píng)定來(lái)評(píng)定測(cè)量不確定度分量。其中，A 類(lèi)評(píng)定用統(tǒng)計(jì)方法評(píng)定不確定度分量，重復(fù)性檢測(cè)引入的不確定度屬于A 類(lèi)不確定度；而另一類(lèi)B 類(lèi)評(píng)定用任何非統(tǒng)計(jì)方法評(píng)定不確定度分量，儀器和設(shè)備校準(zhǔn)引入等的不確定度屬于B 類(lèi)不確定度[8]。

同時(shí)含有乳桿菌和雙歧桿菌的益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌的計(jì)數(shù)是按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35-2016）[9]進(jìn)行，其中，樣品稀釋和加樣時(shí)既可以使用1 mL 吸管也可以使用微量移液器。其操作方便，耗材成本較低，在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)過(guò)程中微量移液器的使用更普遍。益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌的數(shù)量較大，稀釋倍數(shù)大，由于與微量移液器相比吸量管的允差小，因此帶入的不確定度變小。本研究目的是比較以上兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)的測(cè)量不確定度產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售益生菌類(lèi)保健品（同時(shí)含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬），湯臣倍健股份有限公司；莫匹羅星鋰鹽、半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 引入B 類(lèi)不確定度的儀器與設(shè)備 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35-2016）。

1）天平 感量0.01 g，依據(jù)檢定證書(shū)，量程0～25 g 時(shí)，最大允許誤差±0.025 g。

2）量筒 250 mL，依據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196-2006）[10]，容量允差為±2.0 mL。

3）無(wú)菌吸量管（A 類(lèi)）依據(jù) 《常用玻璃量器》（JJG 196-2006），1 mL（具0.01 mL 刻度），容量允差為±0.008 mL；10 mL（具0.1 mL 刻度），容量允差為±0.05 mL。

4）微量移液器（100～1 000 μL）依據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）[11]，移取1 mL 時(shí)，容量允差為±0.01 mL。

1.2.2 其它設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（36 ℃），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；均質(zhì)器，西班牙IUL 及無(wú)菌均質(zhì)袋；厭氧包，日本MGC 公司。

1.3 方法

1.3.1 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)進(jìn)行雙歧桿菌計(jì)數(shù)》（GB 4789.35-2016）

1.3.2 雙歧桿菌計(jì)數(shù)過(guò)程

1.3.2.1 樣品稱(chēng)量與制備 充分混勻樣品，按無(wú)菌操作要求稱(chēng)取25.00 g，置于含225 mL 無(wú)菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器均質(zhì)120 s，制成1∶10 的樣品勻液。

1.3.2.2 樣品稀釋

1）吸量管組 用1 mL 無(wú)菌吸量管吸取1∶10 樣品稀釋液1 mL，沿管壁緩緩注入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分振搖后制成1∶100的樣品稀釋液。按上述操作，依次作10 倍系列稀釋。

2）移液器組 使用微量移液器進(jìn)行上述操作。

1.3.2.3 加樣

1）吸量管組 選擇3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度用1 mL 無(wú)菌吸量管吸取1 mL 樣品稀釋液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平皿。

2）移液器組 使用微量移液器進(jìn)行上述操作。

1.3.2.4 培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 稀釋液被移入平皿后，將冷卻至48 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS 培養(yǎng)基傾注平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混合均勻。從樣品稀釋到平板傾注在15 min內(nèi)完成。36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌菌落計(jì)數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300 CFU 范圍，無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)雙歧桿菌菌落總數(shù)。

2.2 結(jié)果表述

只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍，計(jì)算2 個(gè)平板上的菌落數(shù)平均值，將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克樣品中雙歧桿菌菌落數(shù)。

2.3 不確定度的評(píng)定

2.3.1 樣品重復(fù)性檢測(cè)引起的A 類(lèi)不確定度 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35-2016），對(duì)同一含乳桿菌和雙歧桿菌的保健食品做10 次獨(dú)立測(cè)試，結(jié)果只有稀釋度為108的雙歧桿菌菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍。由于每克樣品中雙歧桿菌的數(shù)量在109數(shù)量級(jí)，因此對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)進(jìn)行A 類(lèi)不確定度的評(píng)定[12-14]。

2.3.1.1 吸量管組 按貝塞爾公式計(jì)算檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差：

式中，S——標(biāo)準(zhǔn)差；xi——第i次測(cè)量的測(cè)得值；——n次測(cè)量所得一組測(cè)得值的算數(shù)平均值。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中，urel（）——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u（）——標(biāo)準(zhǔn)不確度；——n次測(cè)量所得一組測(cè)得值的算數(shù)平均值。

2.3.1.2 移液器組 按貝塞爾公式計(jì)算出檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 B 類(lèi)不確定的度評(píng)定[15-17]

2.3.2.1 樣品制備過(guò)程中引入的不確定度 用天平（精度0.01 g）稱(chēng)取25.00 g 樣品，由天平檢定證書(shū)可知，最大允許差為±0.025 g。按級(jí)使用的數(shù)字儀表、測(cè)量?jī)x器最大允許誤差導(dǎo)致的不確定度屬于矩形（均勻）分布，天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)不確定度為：

用容量250 mL 的量筒量取225 mL 無(wú)菌生理鹽水，加入樣品中制備樣品勻液?！冻Ｓ貌ＡЯ科鳌罚↗JG 196-2006）規(guī)定，250 mL 量出式量筒的容量允差為±2.0 mL。取矩形分布，量筒引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)不確定度為：

以上2 項(xiàng)合成可得樣品制備過(guò)程中引入的相對(duì)合成不確定度為：

2.3.2.2 樣品稀釋過(guò)程中引入的不確定度

1）吸量管組 樣品10 倍系列稀釋方法：吸取樣品1 mL 加入9 mL 稀釋液中。依據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196-2006），1 mL（具0.01 mL 刻度），容量允差為±0.008 mL。取矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)不確定度為：

10 mL 吹出式（A 類(lèi)）分度吸量管容量允差為±0.05 mL，取矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)不確定度為：

該過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度U稀釋依據(jù)泊松關(guān)于微生物培養(yǎng)產(chǎn)生的不確定度定量測(cè)定理論中的公式計(jì)算：

因樣品的梯度稀釋方法相同，則=k×，k為10 倍系列梯度稀釋的次數(shù)，本試驗(yàn)中雙歧桿菌計(jì)數(shù)的稀釋倍數(shù)是108，則k=7。

2）移液器組 根據(jù) 《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）規(guī)定，100～1 000 μL 移液器吸取1 000 μL 時(shí)容量允差為±1 000 μL×1.0%=0.01 mL，取矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)不確定度為：

10 mL 吹出式（A 類(lèi)）分度吸量管容量允差為±0.05 mL，取矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

該過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度U稀釋依據(jù)泊松關(guān)于微生物培養(yǎng)產(chǎn)生的不確定度定量測(cè)定理論中的

公式計(jì)算：

2.3.2.3 加樣過(guò)程引入的不確定度

1）吸量管組 用吸量管吸取1 mL 樣品稀釋液加入平板，加樣引入的相對(duì)不確定度等同于稀釋樣品過(guò)程中吸取1 mL 產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。

U（1mL）=0.0046，U加=0.0046

2）移液器組 用移液器吸取1 mL 樣品稀釋液加入平板，加樣引入的相對(duì)不確定度等同于稀釋樣品時(shí)吸取1 mL 產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。

U（1ml）=0.0058，U加=0.0058

2.3.3 合成不確定度

2.3.3.1 吸量管組 雙歧桿菌計(jì)數(shù)的合成相對(duì)不確定度為：

則合成不確定度為：

2.3.3.2 移液器組 雙歧桿菌計(jì)數(shù)的合成相對(duì)不確定度為：

則合成不確定度為：

2.3.4 擴(kuò)展不確定度 測(cè)定結(jié)果按正態(tài)分布估計(jì)，置信水平為95%時(shí)，包含因子k=2。擴(kuò)展不確定度可由合成不確定度乘以包含因子獲得，U吸量管=2×0.14=0.28，U移液器=2×0.18=0.36。

2.3.5 不確定度結(jié)果計(jì)算 當(dāng)包含率在95%時(shí)，保健食品樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U吸量管為0.28，X=±U吸量管。以吸量管作為稀釋和加樣量具，樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)X值區(qū)間為9.35～9.91。取反對(duì)數(shù)后，其取值為（2.2～8.1）×109CFU/g，樣品雙歧桿菌總數(shù)的置信區(qū)間為（2.2～8.1）×109CFU/g。同樣，以移液管作為稀釋和加樣量具，樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)X值區(qū)間為9.43～10.15。取反對(duì)數(shù)后，其取值為（2.7～14）×109CFU/g，樣品雙歧桿菌總數(shù)的置信區(qū)間為（2.7～14）×109CFU/g。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果（對(duì)數(shù)值）的影響 使用MATLAB 軟件對(duì)吸量管組和移液器組雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值（見(jiàn)表1、表2）進(jìn)行方差分析（ANOVA）。ANOVA 箱形圖見(jiàn)錯(cuò)誤！ 未找到引用源。ANOVA 計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果中P=1.2816×10-4，證明兩組數(shù)據(jù)差異非常明顯。

圖1 ANOVA 箱形圖Fig.1 ANOVA boxplot

圖2 MATLAB 軟件中ANOVA 分析結(jié)果Fig.2 ANOVA result from the MATLAB analysis

表1 吸量管組雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果（×108 CFU/g）Table 1 Counting result of the Bifidobacterium using pipette（×108 CFU/g）

表2 移液器組雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果（×108 CFU/g）Table 2 Counting result of the Bifidobacterium using micropipettor（×108 CFU/g）

2.4.2 兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果不確定度的影響 除A 類(lèi)不確定度外，吸量管組樣品稀釋和加樣引入的不確定度以及置信區(qū)間均略小于移液器組。

表3 兩種量具對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果不確定度的影響Table 3 The influence of the two different tools to the uncertainty of counting the Bifidobacterium

3 討論

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35-2016）[9]對(duì)益生菌類(lèi)保健食品中的雙歧桿菌計(jì)數(shù)，其中樣品稀釋和加樣既可使用1 mL 吸量管也可使用微量移液器。由于益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌的數(shù)量較大，稀釋倍數(shù)大，因此引入的不確定度均較大。稀釋過(guò)程中使用吸量管與移液器相比，使用吸量管帶入的不確定度略小，且使用吸量管對(duì)加樣過(guò)程帶入的不確定度、合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度均略小，而使用吸量管對(duì)A 類(lèi)不確定度的影響比使用移液器略大。另外，使用兩種量具對(duì)同一益生菌類(lèi)保健食品中雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果差異顯著。應(yīng)進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因，使用哪種量具計(jì)數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確，以及如何縮小或消除這種差異。