穿膜肽介導(dǎo)苦蕎金屬硫蛋白的表達(dá)、純化及抗氧化損傷作用

何永吉，李云龍*，胡俊君，范曉軍，李紅梅，程 哲

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院 太原 030031 2 特色農(nóng)產(chǎn)品加工山西省重點實驗室 太原 030031 3 太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 太原 030024）

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類廣泛存在于生物界，分子質(zhì)量較低（6～7 ku），富含半胱氨酸，缺少芳香族氨基酸和組氨酸，能與多種重金屬結(jié)合的熱穩(wěn)定胞內(nèi)蛋白質(zhì)[1]。早在1957年，哈佛大學(xué)的Margoshes 和Vallee 教授在研究馬腎臟鎘蓄積的過程中分離獲得一種含鋅和鎘的蛋白質(zhì)，1960年Kagi 和vallee 將這種特殊的蛋白質(zhì)首次正式命名為金屬硫蛋白（Metallothionein）[2]。此后陸續(xù)在多種哺乳動物組織器官、高等植物、真核微生物及原核生物中發(fā)現(xiàn)并分離獲得MT 蛋白。研究證實多數(shù)物種內(nèi)存在1 個以上具有不同氨基酸組成和蛋白特性的MT 亞型（isoform）[3]。MT 蛋白存在的廣泛性、多態(tài)性、高度誘導(dǎo)性以及保守性，均暗示其可能在生物體內(nèi)具有極其重要的生理功能[4]。有研究表明，金屬硫蛋白具有多種生物學(xué)功能，包括清除自由基，拮抗電離輻射，解除重金屬毒性，參與體內(nèi)必需金屬元素平衡，參與激素和發(fā)育過程調(diào)節(jié)，增強機體對各種應(yīng)激的反應(yīng)，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡密切等[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，無論在體內(nèi)還是體外，MT 對糖尿病及其并發(fā)癥導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷均具有潛在的保護作用[6]。然而，作為一種定位于胞內(nèi)的非信號類蛋白，受制于其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，MT 功能研究和臨床應(yīng)用無法深入展開。

穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs），又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（Protein transduction domain，PTD），是近年來發(fā)現(xiàn)的一種可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)、RNA 和DNA 等生物大分子穿過細(xì)胞膜或組織屏障的短肽，既可以保持生物大分子的生物活性，又不損傷細(xì)胞[7]。其中，來源于HIV-1 病毒編碼的一段富含堿性氨基酸序列的多肽Tat 和短肽11R（11個精氨酸），因廣譜和高效的穿膜活性而成為目前應(yīng)用較廣的兩種穿膜肽[8]。穿膜肽介導(dǎo)的跨膜作用，突破了基因工程蛋白必須是胞外蛋白的限制，抑或只能通過細(xì)胞表面受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞生物信息的規(guī)律，為非信號胞內(nèi)蛋白功能研究和臨床應(yīng)用開辟了新視野。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬于寥科（Polygonaceae），蕎麥屬（Fagopyrum Mill），是一種起源于我國而廣泛分布種植于東北亞、東歐等高寒地區(qū)的糧食和經(jīng)濟作物?？嗍w食藥兼用，富含生物類黃酮、活性蛋白、氨基酸、脂肪酸、膳食纖維、微量元素等，具有抗氧化、抗血栓、降血壓及增強免疫力等多種營養(yǎng)、保健和藥用功能[9]?？嗍w中的蛋白質(zhì)種類豐富，是其發(fā)揮特定生物學(xué)功能的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10]。然而，目前苦蕎蛋白質(zhì)主要以O(shè)sboren 分級蛋白組分的消化特性、營養(yǎng)特性的研究為主[10]，而特定氨基酸序列的蛋白研究僅集中在胰蛋白酶抑制劑、過敏原蛋白等[11-12]，而關(guān)于苦蕎金屬硫蛋白 （Fagopyrum tataricummetallothionein，F(xiàn)tMT）的研究關(guān)注甚少。1999年前南斯拉夫Jelena M.教授首次克隆獲得了蕎麥另一栽培種——甜蕎的金屬硫蛋白基因，隨后對其抗逆表達(dá)模式、組織特異性表達(dá)和某些特定生理功能研究[13-15]。2017年西北農(nóng)林科技大學(xué)陳鵬教授團隊第一次克隆獲得FtMT 編碼基因，僅對其重金屬解毒功能進行初步研究[16]。

本研究采用基因工程技術(shù)完成了FtMT、11RFtMT 和Tat-FtMT 的高水平可溶表達(dá)，分析了3種重組蛋白的金屬結(jié)合特性和羥自由基清除活性，檢測了穿膜肽介導(dǎo)的FtMT 蛋白的穿膜活性，研究了CPP-FtMT 融合蛋白對胰島細(xì)胞Ins-1 和心肌細(xì)胞H9c2 在高糖、高脂以及缺氧毒性條件下的抗氧化損傷作用，為深入研究FtMT 的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

phoA 表達(dá)載體，具有可經(jīng)低磷酸鹽誘導(dǎo)的堿性磷酸酶啟動子（phoA promoter）和可引導(dǎo)外源蛋白分泌至細(xì)胞周質(zhì)、編碼19 個氨基酸的改良型果膠酶信號序列 （Modified pelB leader sequence，5'-MKYLLPTAAAGLLLLAAQP-3'），具有氨芐抗性，多克隆位點3′端帶有6 His tag，該質(zhì)粒由本研究室構(gòu)建、保存；FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT 編碼基因和PCR 引物序列，上海派森諾生物科技有限公司合成；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌BL21 （DE3）、DNA Marker、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoI 和BamHI，上海生工生物工程有限公司；快速磷含量測定試劑盒phosphorus liquirapid kit，德國Human GmbH 公司；Ni sepharoseTM6 Fast Flow 層析柱，GE Healthcare 公司；PVDF 膜（0.22 μm），美國Bio-Rad 公司；兔抗6 His tag 多抗、AP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG、NBT/BCIP 顯色劑，金斯瑞生物科技有限公司；羥自由基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；熒光素FITC 蛋白標(biāo)記試劑盒，上海喜潤生化試劑公司；大鼠胰島細(xì)胞Ins-1 和大鼠心肌細(xì)胞H9c2，美國ATCC 細(xì)胞庫；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM-H 培養(yǎng)基，GIBCO 公司；胎牛血清，HyClone 公司；MTT細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。其余常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 儀（C1000 touch），美國Bio-Rad 公司；低溫冷凍離心機（CR22G III），日本日立公司；蛋白純化系統(tǒng)（AKTA purifier100），美國GE Healthcare 公司；多功能酶標(biāo)儀（infinite M200PRO），瑞士TECAN 公司；電感耦合等離子原子發(fā)射光譜儀（iCAP 6300），美國Thermo 公司；紫外-可見分光光度計（UV-2802PC），美國UNICO 公司；高壓均質(zhì)機 （Basic I），加拿大ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司；半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Trans-Blot SD），美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 根據(jù)FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT 編碼序列及phoA 表達(dá)載體多克隆位點分別設(shè)計3 對擴增引物（見表1），引入限制性內(nèi)切酶NcoI 和BamHI 位點。分別以化學(xué)合成的FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT cDNA 序列為模板，利用設(shè)計合成的相應(yīng)的PCR 引物反應(yīng)擴增目的片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測、鑒定后回收。NcoI 和BamHI 雙酶切PCR產(chǎn)物和phoA 表達(dá)載體，分別回收酶切后的PCR片段和phoA 質(zhì)粒，在T4連接酶作用下連接，構(gòu)建phoA-FtMT、phoA-Tat-FtMT 和phoA-11R-FtMT重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌 （E.coli）DH 5α 細(xì)胞，涂布于LB 瓊脂平板（含100 μg/mL Amp），37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性單克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進行菌落PCR 及質(zhì)粒酶切鑒定。重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物公司測序。

表1 FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 質(zhì)粒構(gòu)建引物序列信息Table 1 Oligonucleotide primers used for constructing FtMT，Tat-FtMT and 11R-FtMT plasmid

1.3.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化 重組表達(dá)載體經(jīng)測序鑒定后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)肽大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建重組工程菌株phoA-FtMT/BL21（DE3）、phoA-Tat-FtMT/BL21（DE3）和phoA-11R-FtMT/BL21（DE3）。將工程菌接種于LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)12 h 制備種子。次日，按照體積分?jǐn)?shù)2.5%的接種量分別接種至經(jīng)優(yōu)化改良的Neidhardt 低磷培養(yǎng)基中[17]，培養(yǎng)基成分：0.25 g/L 酶母提取物，2.5 g/L 胰蛋白胨，3 g/L（NH4）2SO4，5 g/L NaCl，1 g/L MgSO4，4 g/L 葡萄糖，含磷量0.05 mmol/L。低磷培養(yǎng)30 min 后添加300 μmol/L ZnSO4，穩(wěn)定蛋白防止自聚合，30 ℃，180 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用磷測定試劑盒（磷酸鉬酸鹽法）測定磷含量，當(dāng)培養(yǎng)上清中磷含量降至0.005 mmol/L 時，可認(rèn)定磷全部消耗完畢。繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)5 h，測定OD600nm菌體密度，4 ℃，8 000 r/min 離心25 min，收集細(xì)菌。按照每1 g 濕菌用5 mL Tris-HCl 緩沖液（20 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L PMSF、0.1%Triton、10 mmol/L 咪唑，pH 7.8）重懸，用高壓均質(zhì)機800 bar 高壓破碎3 min，4 ℃，14 000×g離心25 min，收集上清。上清經(jīng)0.22 μmol/L 濾膜過濾后，上樣于Ni SepharoseTM6 Fast Flow 親和層析柱，分別用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫、收集目的蛋白。將含目的蛋白組分超濾濃縮至儲存液（100 mmol/L Tris-HCl，0.2 mmol/L PMSF，10 mmol/L DTT，pH 7.8）保存。15%SDSPAGE 電泳分析各純化組分，用BandScan 軟件進行蛋白薄層掃描分析。

1.3.3 Western blot 檢測 重組蛋白FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT 純化樣經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉液（pH 7.4 PBS+5%脫脂奶粉）4 ℃過夜封閉，PBST 洗膜4 次，10 min/次。將加入1∶1 000 稀釋的Anti-6His tag 兔源多抗作為一抗，4 ℃過夜，PBST 洗膜4 次。加入1∶5 000稀釋的AP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)2 h，用PBST 洗膜4 次，最后用BCIP/NBT 顯色試劑盒避光顯色，拍照。

1.3.4 紫外光譜掃描分析 重組FtMT、Tat-FtMT和11R-FtMT 蛋白經(jīng)超濾濃縮至儲存液，用UNICO UV-2802 PC 型紫外-可見分光光度計在波長190～300 nm 范圍分析其紫外光譜特征。

1.3.5 金屬結(jié)合能力分析 以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋 白濃度。取1 mL 重組蛋白純化樣品置硝化瓶中，加入硝酸、高氯酸（體積比1∶3），置電熱板上消化完全后，用去離子水完全溶解定容，用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜儀 （ICP-OES，Thermo iCAP 6300，USA）在波長213.856 nm 處測定重組蛋白中Zn 含量。

1.3.6 清除自由基能力分析 按照羥自由基測定試劑盒操作說明，分別在反應(yīng)體系中加入1，2，4，8，16，32，64，128 μmol/L 不同濃度的重組FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT，檢測其清除羥自由基能力。在波長550 nm 處，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度。羥自由基清除率SR 計算公式：

式中，SR——羥自由基清除率；Ac——空白對照的吸光度值；As——樣品的吸光度值。

1.3.7 穿膜活性的檢測 將Ins-1 接種于含100 ml/L 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素，100 mg/mL 鏈霉素，50 μmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L 丙酮酸） 中，將H9c2 接種于含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（含100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素），置于37 ℃，50 mL/L CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培育。

按照文獻[18]方法，16 μmol/L 異硫氰酸熒光素 （FITC） 標(biāo)記的重組FtMT、Tat-FtMT 和11RFtMT 蛋白，分別與Ins-1 和H9c2 細(xì)胞孵育1 h，用細(xì)胞裂解劑RIPA 裂解，收集細(xì)胞裂解液，以RIPA 為空白對照，檢測細(xì)胞裂解液中A495nm吸收值。其穿膜效率計算公式：

式中，CPR——蛋白穿膜效率 （%）；Pc——進入細(xì)胞的標(biāo)記蛋白量 （mg）；Pt——加入的標(biāo)記蛋白總含量（mg）；LR——蛋白標(biāo)記效率（%）。

1.3.8 CPP-FtMT 細(xì)胞毒性的測定 單層培養(yǎng)細(xì)胞Ins-1 和H9c2 經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640 和DMEM-H 培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后，按照每孔103～104個細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，加入16 μmol/L 重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白，每孔終體積200 μL，37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL MTT 溶液或MT 儲存液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使甲臜（Formazan）充分溶解，波長490 nm 處測定各孔光吸收值。

1.3.9 CPP-FtMT 抑制細(xì)胞凋亡活性的測定 配制0.01 mol/L NaOH，70 ℃下加入棕櫚酸溶解30 min，配制20 mmol/L 棕櫚酸溶液。將20 mmol/L 棕櫚酸溶液與pH 7.4 PBS 溶解的5%BSA 按8∶1配制成棕櫚酸培養(yǎng)基 （300 μmol/L 棕櫚酸+37.5 μmol/L BSA）。Ins-1 細(xì)胞糖脂毒性GL 造模條件：300 μmol/L 棕櫚酸+37.5 μmol/L BSA+50 mmol/L葡萄糖，加入16 μmol/L 重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白。糖脂毒性下缺氧造模條件：300 μmol/L 棕櫚酸+37.5 μmol/L BSA+50 mmol/L 葡萄糖，16 μmol/L 重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT蛋白，37 ℃，5%CO2+95%N2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。H9c2 細(xì)胞高糖HG 毒性造模條件：350 mmol/L 葡萄糖，加入16 μmol/L 重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白。高糖HG 毒性下缺氧造模條件：350 mmol/L 葡萄糖，加入16 μmol/L 重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白，37 ℃，5% CO2+95%N2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后MTT 法測定各樣品細(xì)胞活力。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以±s表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和LSD 法進行顯著性比較，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物長度分別為250，280 bp 和280 bp，與預(yù)期目的片段的理論值247，280 bp 和280 bp 一致。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，phoA 空載約3 076 bp 質(zhì)粒，重組質(zhì)粒phoA-FtMT、phoA-Tat-FtMT 和phoA-11RFtMT 為3 323，3 356，3 356 bp，瓊脂糖電泳結(jié)果與理論值一致（圖1）。以重組工程菌熱解后暴露的DNA 為模板，分別以對應(yīng)的引物進行PCR 擴增。結(jié)果證實FtMT、Tat-FtMT和11R-FtMT基因已成功轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞（圖1）。重組工程菌經(jīng)南京金斯瑞生物公司測序，證實FtMT、Tat-FtMT 和11RFtMT 成功定向插入表達(dá)載體。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切及重組工程菌PCR 產(chǎn)物鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by restriction enzyme digestion and PCR

2.2 重組FtMT 表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒經(jīng)驗證后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）構(gòu)建重組表達(dá)工程菌，經(jīng)氨芐抗性平板篩選，挑取單克隆接種至5 mL LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)制備種子。次日，接種重組工程菌至低磷培養(yǎng)基培養(yǎng)，監(jiān)測培養(yǎng)過程磷含量變化，測定OD600nm菌體生長密度。試驗結(jié)果顯示，工程菌培養(yǎng)20 h 后其培養(yǎng)基中磷含量基本降至0.1 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)至24 h，測定菌體量OD600nm約2.6。離心收集菌體，經(jīng)低溫高壓均質(zhì)破壁后離心收集上清，上樣于Ni sepharoseTM6 Fast Flow 層析柱分離純化，用不同濃度的咪唑洗脫液梯度洗脫。SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示（見圖2）：重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 主要以可溶狀態(tài)存在于菌體上清中，經(jīng)鎳柱純化可獲得較高純度的重組蛋白，其分子質(zhì)量分別為9 000，10 000 u和11 000 u，與理論值基本一致（9 098.1，10 639.93 u和10 816.16 u）。用BandScan 軟件對SDS-PAGE泳道進行蛋白薄層掃描分析，結(jié)果顯示：重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 分別占菌體總蛋白的14%，18%和17%，經(jīng)鎳柱純化，其純度達(dá)95%以上。

圖2 SDS-PAGE 分析重組FtMT 表達(dá)及純化Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of recombinant FtMT

2.3 紫外光譜掃描及WB 分析

重組FtMT 經(jīng)紫外全波長掃描后，在波長220 nm 和280 nm 處有特征吸收（圖3）。Tat-FtMT 和11R-FtMT 紫外光譜掃描圖與重組FtMT 幾乎一致（結(jié)果未顯示），主要原因在于苦蕎MT 中有酪氨酸，同時C 端融合引入多聚組氨酸標(biāo)簽，具有280 nm 特征吸收。同時具有Zn-MT 金屬簇220 nm 特征吸收。WB 結(jié)果顯示，重組FtMT、Tat-FtMT和11R-FtMT 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜后，其C 段6His 可與Anti-6His tag 兔源多抗發(fā)生陽性反應(yīng)（圖4）。

圖3 重組FtMT 純化樣紫外掃描光譜分析Fig.3 UV absorption spectrum of recombinant FtMT

圖4 重組蛋白純化樣WB 分析Fig.4 Western blotting of recombinant FtMT

2.4 金屬結(jié)合特性和自由基清除分析

采用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒定量重組蛋白FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白濃度，ICP-OES 法測定重組蛋白中Zn 含量。FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 分別按照分子質(zhì)量9.0，10.0，10.0 ku 計算，其蛋白與金屬離子物質(zhì)的量比（[FtMT]/[Zn2+]）分別為1∶5.2，1∶5.1，1∶5.0，證明3種融合重組表達(dá)蛋白可與二價鋅離子結(jié)合，它們具有幾乎一致的鋅離子結(jié)合量。

按照羥自由基測定試劑盒操作說明檢測重組FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT 清除羥自由基能力。結(jié)果表明（圖5），引入穿膜肽并未改變其自由基清除能力，重組FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT 蛋白具有一致的自由基清除能力，其16 μmol/L 重組蛋白羥自由基清除率達(dá)50%，64 μmol/L 重組蛋白羥自由基清除率在90%以上。

圖5 重組FtMT 蛋白羥自由基清除活性Fig.5 Hydroxyl radical scavenging ability of recombinant FtMT

2.5 穿膜活性

FITC 標(biāo)記重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT蛋白，分別以Ins-1 和H9c2 細(xì)胞為靶細(xì)胞，檢測重組蛋白穿膜能力。試驗結(jié)果證實，重組Tat-FtMT 和11R-FtMT 均可高效跨膜進入Ins-1 和H9c2 細(xì)胞，且呈劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。在16 μmol/L 蛋白濃度下，與細(xì)胞作用1 h 以上，其跨膜效率可達(dá)到最大平臺值（結(jié)果未顯示）。在5%DMSO 作用下，16 μmol/L 重組Tat-FtMT 分別與Ins-1、H9c2 細(xì)胞孵育1 h 后，其穿膜效率分別達(dá)（82.7±4.2）%和（80.1±3.1）%，較無穿膜功能的重組FtMT（3.5±1.2）%差異顯著（P＜0.01）。重組11RFtMT 分別與Ins-1、H9c2 細(xì)胞孵育1 h 后，其穿膜效率分別達(dá)（83.5±3.6）%和（81.2±3.4）%，較無穿膜功能的重組FtMT（4.5±1.3）%差異顯著（P＜0.01）（圖6）。

圖6 重組蛋白穿膜效率Fig.6 Penetrating efficiency of the recombinant FtMT

2.6 重組蛋白細(xì)胞毒性

MTT 細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示：在1～16 μmol/L范圍，重組FtMT、Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白3種重組蛋白對大鼠胰島細(xì)胞Ins-1 和心肌細(xì)胞H9c2 均無顯著的細(xì)胞毒性（圖7）。

圖7 FtMT 和CPP-FtMT 對Ins-1（a）和H9c2（b）細(xì)胞毒性Fig.7 Cytotoxicity of FtMT and CPP-FtMT fusion protein in Ins-1（a） and H9c2（b）

2.7 CPP-FtMT 糖脂、缺氧毒性保護作用

按照體外羥自由基自由基清除能力結(jié)果，16 μmol/L 重組FtMT、Tat-FtMT、11R-FtMT 蛋白的體外抗氧化活性≥50%。在糖脂、缺氧毒性保護作用試驗中，選擇16 μmol/L 重組蛋白測定。大鼠胰島細(xì)胞Ins-1 經(jīng)300 μmol/L 棕櫚酸、37.5 μmol/L BSA、50 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)后，建立糖脂毒性細(xì)胞模型。聯(lián)合95%N2培養(yǎng)后，建立糖脂缺氧毒性細(xì)胞模型。大鼠心肌細(xì)胞H9c2 經(jīng)350 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)后，建立高糖毒性細(xì)胞模型。聯(lián)合95%N2 培養(yǎng)后，建立高糖缺氧毒性細(xì)胞模型。MTT 測定結(jié)果顯示，重組FtMT 處理后，對大鼠胰島細(xì)胞Ins-1 的糖脂毒性和糖脂缺氧毒性幾乎無影響；而經(jīng)重組Tat-FtMT、11R-FtMT 蛋白處理后，較GL對照可顯著緩解糖脂毒性和糖脂缺氧毒性對細(xì)胞活力的影響 （圖8）。大鼠心肌細(xì)胞H9c2 經(jīng)350 mmol/L 葡萄糖處理后，其細(xì)胞活力顯著降低。經(jīng)350 mmol/L 葡萄糖和95%N2缺氧培養(yǎng)后，細(xì)胞活力進一步損傷。經(jīng)重組FtMT 處理后，大鼠心肌細(xì)胞H9c2 未顯示顯著的毒性緩解作用；而經(jīng)重組Tat-FtMT、11R-FtMT 蛋白處理后，與對照組相比，高糖毒性和高糖缺氧毒性所致細(xì)胞損傷獲得較大程度的緩解 （圖9）。試驗結(jié)果證實，外源CPPFtMT 可通過跨膜作用進入胞內(nèi)，顯著降低因糖尿病而導(dǎo)致的胰島細(xì)胞糖脂毒性和缺氧毒性損傷以及心肌細(xì)胞高糖毒性和缺氧導(dǎo)致的氧化損傷。

圖8 CPP-FtMT 對Ins-1 高糖（a）和高糖+缺氧毒性（b）的保護作用Fig.8 Protective effects of CPP-FtMT against （a） glucolipotoxicity （GL） and （b） glucolipotoxicity with hypoxia （HP）

圖9 CPP-FtMT 對H9c2 糖脂（a）和糖脂+缺氧毒性（b）的保護作用Fig.9 Protective effects of CPP-FtMT against （a） hyperglycemia （HG） and （b） hyperglycemia with hypoxia （HP） in H9c2 cells

3 討論

國內(nèi)外目前關(guān)于金屬硫蛋白與糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)系已有較為系統(tǒng)的研究，分別從組織水平、細(xì)胞水平、分子水平研究MT 在糖尿病中的作用[19-21]。有研究已證實，糖尿病在臨床上表現(xiàn)的胰島細(xì)胞損傷和心肌細(xì)胞損傷的主要發(fā)病機制是高糖、高脂和缺氧所致的氧化損傷。然而，MT 作為一種定位于胞內(nèi)的非信號類蛋白，受制于其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。國內(nèi)外關(guān)于MT 與糖尿病的相關(guān)研究多集中于內(nèi)源MT 對糖尿病氧化損傷保護方面，而外源性MT 逆轉(zhuǎn)糖尿病及其并發(fā)癥病程中氧化損傷的研究鮮見報道。

MT 因分子質(zhì)量小，半衰期短，在宿主體內(nèi)易被降解，富含半胱氨酸，極易形成包涵體，易螯合體內(nèi)必需金屬元素而對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性等問題，使得小分子可溶性MT 重組表達(dá)一直難以實現(xiàn)[22]。Tat 和11R 作為一種典型的陽離子型穿膜肽，穿膜活性主要是由富含堿性氨基酸的特性所決定[23-24]，然而，典型穿膜肽所富含的賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸在高效發(fā)揮穿膜內(nèi)化作用的同時，卻在大腸桿菌高效表達(dá)時因過高的極性而使重組蛋白難以保持可溶形式[25]。本研究在原有堿性磷酸鹽啟動子（phoA）小分子MT 蛋白可溶性表達(dá)技術(shù)基礎(chǔ)上[17]，通過改良果膠酶分泌信號肽序列（5'-MKYLLPTAAAGLLLLAAQP-3'），克服了因MT 蛋白特性及穿膜肽高堿性氨基酸組成而導(dǎo)致的高效可溶表達(dá)障礙，Tat-FtMT、11R-FtMT 在大腸桿菌中均獲得較高水平的可溶表達(dá)（分別占到菌體總蛋白的18%和17%），通過鎳柱親和層析實現(xiàn)了重組CPP-FtMT 的高效分離純化。

金屬結(jié)合特性是MT 發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)[4]。MT 作為高效的抗氧化調(diào)節(jié)劑和自由基清除劑，其結(jié)構(gòu)中大量巰基與金屬離子形成的金屬巰基簇是其發(fā)揮抗氧化作用的活性中心[26]。一方面，MT 通過金屬巰基簇的解離，釋放金屬離子，暴露還原態(tài)的-SH，進而直接猝滅清除自由基；另一方面，MT 作為鋅離子存儲器，通過鋅供給促進抗氧化酶基因的表達(dá)和活化；再則，MT 還可鰲和Fe2+和Cu2+，阻斷體內(nèi)Fenton 反應(yīng)，減少·OH 生成。本研究利用ICP-OES 法測定重組蛋白中Zn2+含量，3種重組蛋白與金屬離子物質(zhì)的量比均在1∶5 左右，MT/金屬結(jié)合比率幾乎一致，具有發(fā)揮抗氧化損傷作用的基礎(chǔ)。

MT 對羥基自由基、DPPH 自由基、ABTS 自由基、超氧陰離子自由基等均有顯著的清除效果[26]。特別是對其中氧化活性最強的·OH，MT 具有最強的自由基清除活性[26]。在對FtMT 和CPP-FtMT 重組表達(dá)及鑒定的基礎(chǔ)上，本研究以MT 羥自由基清除活性為表征檢測指標(biāo)，比較了FtMT 和CPPFtMT 體外羥自由基清除活性。研究結(jié)果證實，F(xiàn)tMT 和CPP-FtMT 在體外均具有較強的羥自由基清除能力。與已報道的hMT2A[27]、華溪蟹MT[28]相比，F(xiàn)tMT 羥自由基清除能力略低，原因在于MT的自由基清除能力主要是由其中的還原性巰基基團數(shù)目所決定[29]，而FtMT 巰基含量（17.9%）均低于hMT2A（32.8%）和華溪蟹MT（30.5%）。兩種穿膜肽的引入并未改變其自由基清除能力，這與三者具有同樣的MT/金屬結(jié)合比率結(jié)果相吻合，也證實了其體外自由基清除率主要由MT 本身的還原態(tài)-SH 數(shù)量所決定。

在驗證重組FtMT 和CPP-FtMT 體外功能的基礎(chǔ)上，通過偶聯(lián)FITC，采用熒光法分析CPPFtMT 對Ins-1 和H9c2 細(xì)胞的穿膜效率。結(jié)果證實Tat-FtMT 和11R-FtMT 蛋白較FtMT 具有顯著的穿膜活性（P＜0.05）。16 μmol/L 重組CPP-FtMT作用1 h 后，其穿膜效率在80%以上。兩種重組CPP-FtMT 間穿膜效率無顯著差異，且Ins-1 和H9c2 兩種細(xì)胞間穿膜效率無顯著差異。為深入分析外源性MT 在細(xì)胞水平的抗氧化損傷作用，本研究以Ins-1 和H9c2 細(xì)胞構(gòu)建高糖、高脂以及缺氧毒性的糖尿病氧化損傷細(xì)胞模型，綜合分析CPP-FtMT 對氧化損傷細(xì)胞的保護作用。研究結(jié)果證實外源CPP-FtMT 可通過跨膜作用進入胞內(nèi)，顯著降低胰島細(xì)胞糖脂毒性和缺氧毒性損傷以及心肌細(xì)胞高糖毒性和缺氧導(dǎo)致的氧化損傷。Ins-1在高糖和高糖聯(lián)合缺氧毒性下，以及H9c2 在糖脂和糖脂聯(lián)合缺氧毒性下，具有不同的氧化損傷機制。本研究證實外源CPP-FtMT 經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜后，在胞內(nèi)具有顯著的抗氧化損傷作用，然而其具體的抗氧化損傷機制尚未闡明。本研究僅在細(xì)胞水平關(guān)注FtMT 的抗氧化損傷作用，仍需體內(nèi)實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究采用基因重組技術(shù)制備了穿膜肽-FtMT 融合蛋白，分析了FtMT 在高糖和高脂以及缺氧毒性糖尿病細(xì)胞模型中的抗氧化損傷作用，為FtMT 的生物學(xué)功能機制研究和食藥資源的開發(fā)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。