ERp57通過影響成纖維細胞活化參與特發(fā)性肺纖維化疾病發(fā)生發(fā)展

岳慧慧 張鳳芹 賀健晗 張惠蘭 王從義

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 生物醫(yī)學研究中心國家衛(wèi)生健康委呼吸疾病重點實驗室,武漢 430030

特發(fā)性肺纖維化 (idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、進行性、纖維化性間質性肺疾病,其臨床特征表現(xiàn)為進行性呼吸困難、低氧血癥,伴或不伴干咳,最終進展為呼吸衰竭而導致死亡[1]。IPF的病理特征主要表現(xiàn)為普通型間質性肺炎,其組織學特征是病變呈斑片狀分布,主要累及胸膜下肺組織,顯微鏡下可見正常肺泡結構破壞,肺組織呈現(xiàn)纖維化、蜂窩狀改變,致密的纖維化瘢痕區(qū)伴隨著散在分布的成纖維細胞灶[2]。IPF的發(fā)病機制尚不明確,目前研究認為IPF是由多基因遺傳(如SFTPC、TOLLIP等的基因突變)和環(huán)境危險因素(如吸煙和感染)之間復雜的相互作用所致[3]。值得注意的是,近年來人們關注到內質網(wǎng)應激與纖維化疾病發(fā)生發(fā)展密切相關[4],因此研究內質網(wǎng)應激在IPF中的作用機制具有重要意義。

內質網(wǎng)作為真核細胞中最大的細胞器,參與多種細胞活動,包括負責新合成蛋白的修飾和折疊、糖原的產(chǎn)生和儲存、脂質生物合成及維持鈣穩(wěn)態(tài)[5]。當細胞受到環(huán)境和遺傳因素交互作用時,可導致內腔中錯誤折疊的蛋白質累積,進而誘發(fā)內質網(wǎng)應激和激活未折疊蛋白反應。未折疊蛋白反應是一個復雜的信號傳導途徑,主要通過3種未折疊蛋白反應壓力傳感器的激活而啟動:蛋白激酶RNA樣內質網(wǎng)激酶、轉錄激活因子6 和肌醇需要酶1α[6-7]。研究表明內質網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應信號通路可通過誘導肺泡上皮細胞凋亡、成纖維細胞分化、上皮-間充質轉分化和巨噬細胞極化等參與肺纖維化形成[4,8]。ERp57,也稱為PDIA3、ERp60或GRP58,是蛋白質二硫鍵異構酶基因家族中的一員,其包含4個硫氧還原蛋白樣結構域折疊[9]。研究已揭示ERp57具有氧化還原和蛋白質二硫鍵異構酶活性,在內質網(wǎng)中通過與分子伴侶鈣網(wǎng)蛋白和鈣連接蛋白協(xié)同作用參與新合成蛋白質的折疊和修飾[10]。ERp57 在器官組織中廣泛表達,其表達失調與多種疾病的發(fā)生相關,包括神經(jīng)退行性疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)狀況、腎纖維化、氣道炎癥和癌癥等[11]。然而,ERp57對成纖維細胞活化的影響以及在IPF 中的作用尚待闡明。因此,本研究將從臨床標本和動物模型出發(fā),探究ERp57的表達特征,繼而通過人肺原代成纖維細胞探究ERp57對成纖維細胞活化的影響,以期為IPF 的治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗標本

1.1.1 實驗小鼠 實驗性研究。所有實驗小鼠均采用野生型C57BL/6 背景小鼠,8～10 周齡,雄性,統(tǒng)一從湖北省實驗動物中心購買,且動物飼養(yǎng)和實驗均在華中科技大學同濟醫(yī)院科研大樓無特定病原體級實驗動物中心完成。所有的動物實驗相關操作均嚴格遵循美國國立衛(wèi)生研究所規(guī)定的相關原則,并已通過華中科技大學同濟醫(yī)院動物研究委員會的批準(TJH-201901012)。

1.1.2 人體肺組織 根據(jù)ATS/ERS提供的IPF診斷標準,經(jīng)患者及其家屬同意后,收集在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院行肺移植或心肺聯(lián)合移植的IPF 患者的肺組織以及肺組織手術切除患者(臨床診斷為肺部腫塊性質待查,影像學上無纖維化,術后病理診斷為良性病變,留取病變部位遠端大于5 cm 的正常肺組織)標本作為對照組。本研究經(jīng)同濟醫(yī)院倫理委員會批準 (TJIRB20210919),并獲取患者知情同意。

1.2 動物模型 8～10周齡野生型小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉 (5 μl/g)麻醉后氣管內注射博來霉素(bleomycin,BLM) (2.5 mg/kg,生理鹽水溶解),對照組小鼠給予相同劑量的生理鹽水,21 d后取肺組織。

1.3 實驗細胞 將人體肺組織標本置于無菌EP管,用剪刀、鑷子將氣管剝離,并剪碎,鋪于10 cm皿中,使其貼附于培養(yǎng)皿,采用含10%Gibco血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。成纖維細胞作為優(yōu)勢細胞,在肺組織塊貼壁后的第3～4天,可見成纖維細胞爬出,呈梭形。之后進行傳代,取3～6代的細胞進行后續(xù)的實驗。

1.4 實驗材料與儀器 高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胰酶購自武漢科瑞有限公司;Trizol,逆轉錄與實時熒光定量PCR 試劑盒購自日本Takara公司;RIPA裂解液購自上海Beyotime公司;PVDF 膜購自美國Millipore公司;ECL發(fā)光液購自谷歌生物有限公司;細胞轉染試劑盒購自美國ThermoFisher公司;恒溫培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher公司;生物顯微鏡購自日本Olympus公司;實時熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad公司;Nano Drop微量分光光度計購自美國ThermoFisher公司。BLM 購自輝瑞制藥公司;重組人TGF-β1購自美國Pepro Tech公司。

1.5 免疫組織化學分析 用4%多聚甲醛經(jīng)氣管內灌注左肺24 h 后行石蠟包埋,切至5μm切片。脫蠟至水后,使用已經(jīng)建立的技術對切片進行HE染色和Masson染色[12]。對于免疫熒光染色,脫蠟至水后,使用ERp57 抗體 (1∶100)和FSP1 抗體(1∶100)共孵育切片組織,之后孵育熒光二抗,使用奧林巴斯熒光顯微鏡進行拍照。

1.6 蛋白質印跡試驗 根據(jù)標準方案進行蛋白質印跡分析[13]。一抗包括膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白、α-平滑肌肌動蛋白 (alpha smooth muscle actin,α-SMA) (Proteintech,武漢,1∶1 000)、GAPDH(美國Santa Cruz公司,1∶1 000)、ERp57 (美國Abcam 公司,1∶1 000)。使用化學發(fā)光底物系統(tǒng)進行檢測,灰度值用ImageJ軟件分析。

1.7 細胞轉染 將人肺成纖維細胞接種在12孔板中 并 分 為4 組:對 照 組、TGF-β1組、ERp57 siRNA 組、ERp57 siRNA+TGF-β1組,待細胞密度為60% 左右開始轉染。將ERp57 siRNA 和Lipofectamine 3000 充分混勻后,常溫孵育15 min,棄上清,將siRNA 和Lipofectamine 3000混合液加至12孔板內。將細胞置于細胞培養(yǎng)箱內孵育4～6 h,換液至正常含10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉染48 h后,分別添加重組TGF-β1(10μg/L)刺激細胞24 h 后,收取細胞蛋白。本研究所用的ERp57 siRNA 序列為5′-AGACCCAAATATCGTCATA-3′ (銳 博 生物科技有限公司)。

1.8 統(tǒng)計學分析 本研究中所有的實驗均至少重復3次,實驗數(shù)據(jù)以±s表示,采用GraphPad Prism (7.0版)軟 件 進 行Student′st檢 驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ERp57在IPF患者中的表達水平 收集IPF患者和對照組的臨床特征 (表1),蛋白質印跡結果表明IPF患者中的ERp57蛋白表達水平顯著高于對照組(t=6.314,P＜0.01);同時IPF組成纖維細胞活化標記α-SMA 蛋白表達水平顯著高于對照組(t=4.226,P＜0.01)。見圖1。

圖1 蛋白質印跡檢測IPF患者和對照組ERp57、α-SMA 蛋白表達水平 A:電泳圖;B:ERp57蛋白相對表達;C:α-SMA 蛋白相對表達

表1 人體標本的臨床特征

2.2 小鼠肺纖維化肺組織中ERp57表達特征 為進一步檢測ERp57 在小鼠肺組織中的表達情況,利用經(jīng)氣道注射BLM 建立小鼠肺纖維化模型,HE和Masson染色顯示經(jīng)BLM 處理21 d后,小鼠肺組織肺泡結構破壞,肺泡壁增厚,并伴有炎癥細胞浸潤;Masson染色示大量膠原纖維聚集,以上結果均為纖維化的典型表現(xiàn) (圖2)。蛋白質印跡和免疫熒光染色結果顯示,ERp57在BLM 小鼠纖維化肺組織中表達水平較對照組顯著上調。同時,免疫熒光結果表明,ERp57 主要在纖維化小鼠的肺成纖維細胞中表達,且與對照組相比,BLM 誘導小鼠的纖維化肺組織中,雙染陽性數(shù)量顯著增加(t=7.443,P＜0.01)。見圖3～5。

圖2 對照組 (A、C)和博來霉素處理21 d后小鼠 (B、D)肺組織病理表現(xiàn) (每組3只小鼠) HE (A、B) Masson (C、D)×100

圖3 蛋白質印跡檢測各組小鼠肺組織中ERp57、collagen Ⅰ的表達 (每組3只小鼠) A:電泳圖;B:ERp57蛋白相對表達;C:collagen Ⅰ相對表達

圖4 ERp57 (綠色)與FSP1 (紅色)的免疫熒光共染 ×400

圖5 雙染陽性數(shù)目分析

2.3 成纖維細胞中ERp57的表達 提取正常對照人體肺原代成纖維細胞進行培養(yǎng),在鏡下可觀察到呈梭形的細胞,成纖維細胞特異性蛋白FSP1染色陽性,以上表明該細胞為成纖維細胞 (圖6)。之后利用TGF-β1 刺激成纖維細胞0、12、24、48 h后收取蛋白,蛋白質印跡 (圖7)結果顯示經(jīng)TGF-β1 刺 激 后,纖 連 蛋 白、α-SMA 和ERp57 的表達水平呈時間依賴性增加 (P值均＜0.05)。同時,細胞爬片進行免疫熒光共染結果顯示經(jīng)TGF-β1刺激后,人原代成纖維細胞活化后ERp57的表達顯著升高(圖8)。綜上表明,ERp5 7表達水平的升高可能與成纖維細胞的活化密切相關。

圖6 成纖維細胞的鑒定分析 A:普通顯微鏡下的成纖維細胞 ×50;B:成纖維細胞的FSP1染色 ×200

圖7 蛋白質印跡檢測經(jīng)TGF-β1 刺激后人肺原代成纖維細胞中fibronectin、ERp57 和α-SMA 的表達水平 A:電泳圖;B:fibronectin蛋白相對表達;C:ERp57蛋白相對表達;D:α-SMA 蛋白相對表達

圖8 免疫熒光染色檢測成纖維細胞活化后ERp57的表達水平 ×400

2.4 干擾ERp57 的表達對成纖維細胞活化的影響 為進一步探究ERp57表達水平對成纖維細胞功能的影響,應用siRNA敲減ERp5 7的表達,蛋白質印跡結果 (圖9)顯示,經(jīng)TGF-β1刺激后,抑制ERp57可顯著降低纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ的表達水平 (P值均＜0.05)。這些結果提示抑制ERp57的表達能抑制成纖維細胞的活化及細胞外基質的分泌。

圖9 蛋白質印跡分析抑制ERP57表達水平后纖維化相關指標表達水平 A:電泳圖;B:fibronectin相對表達;C:collagenⅠ相對表達

3 討論

IPF作為一種發(fā)病機制不明,不可逆且致死率較高的難治性間質性肺疾病,常以肺泡結構破壞和肺間質纖維化為特征[1]。隨著社會老齡化的快速進展,IPF的發(fā)病率呈上升趨勢。盡管近年來人們?yōu)殛U述IPF的發(fā)病機制投入大量精力研究,但對于其確切致病機制的了解仍非常不足,這嚴重阻礙了針對這種難治性疾病的新型有效療法的發(fā)展。肺纖維化形成是由肺泡上皮細胞損傷所驅動,其反復損傷導致上皮細胞死亡和基底膜嚴重破壞,上皮修復難以完成,繼而啟動肺泡上皮細胞 “重編程”,呈現(xiàn)多種促纖維化表型,并分泌大量促纖維化因子,形成促纖維化微環(huán)境[14]。作為纖維化形成的主要效應細胞,成纖維細胞受到促纖維化微環(huán)境刺激后遷移聚集至損傷部位,并分化為肌成纖維細胞,產(chǎn)生大量細胞外基質蛋白進行組織重塑修復,導致肺組織正常結構的破壞和永久性瘢痕形成[15]。由此可見,成纖維細胞的活化、增殖和遷移對纖維化形成起著決定性作用。故研究其生物學特性和相關功能的調控機制是發(fā)現(xiàn)治療IPF 疾病有效靶點的關鍵所在。本研究旨在進一步揭示成纖維細胞活化的調控機制,為IPF 的治療提供潛在性藥物治療靶點。

既往研究表明內質網(wǎng)應激可通過影響多種細胞類型來參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展。Borok 等[16]的研究揭示上皮祖細胞中內質網(wǎng)伴侶蛋白GRP78的缺失誘導上皮細胞衰老凋亡而促進纖維化的發(fā)生發(fā)展。此外,Lee等[17]研究揭示內質網(wǎng)蛋白二硫化物異構酶家族ERp46通過增強TGF-β信號傳導促進肺纖維化,而目前對于ERp57在肺纖維化中的作用仍缺乏研究。本研究從臨床水平和動物模型出發(fā)證實ERp57在IPF患者和BLM 誘導的小鼠肺組織中高表達,這與Kumar等[18]新近發(fā)表的結果一致,不同的是本研究關注到ERp57在肺成纖維細胞中處于高表達水平,提示ERp57影響肺纖維化的進展不僅僅依賴于Club細胞,也可能通過影響成纖維細胞的功能進而發(fā)揮作用。

鑒于成纖維細胞活化在纖維化的形成中起關鍵性作用,而TGF-β1已證實是影響成纖維細胞表型轉變的關鍵因素[19],促使我們進一步探究ERp57與成纖維細胞活化的相關性。結果表明,在人肺原代成纖維細胞中,隨著TGF-β1刺激時間的延長,ERp57和纖維化指標的表達水平呈逐漸升高。與此同時,經(jīng)TGF-β1刺激后,敲減ERp57 可顯著抑制纖維化相關指標的表達水平。以上結果揭示ERp57功能缺失可抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化及細胞外基質的分泌,這可能與ERp57作為內質網(wǎng)應激伴侶蛋白,參與新合成蛋白的二硫鍵修飾有關[9]。

綜上所述,本研究證實了IPF患者和BLM 誘導的小鼠纖維化肺組織均存在ERp57 的高表達,且在成纖維細胞中高表達;體外實驗證實,敲減ERp57可抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞活化。因此,本研究數(shù)據(jù)揭示ERp57 的表達水平可能與IPF疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,靶向抑制ERp57基因可能有助于治療肺纖維化疾病。本研究的不足之處在于尚未進一步揭示ERp57影響成纖維細胞活化的分子機制以及ERp57缺失對BLM 誘導的小鼠肺纖維化的影響?？傊?本研究工作為了解IPF的發(fā)病機制提供了新的啟示與切入點,為開發(fā)IPF疾病治療方案提供了潛在的靶點和堅實的科學理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突