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    蒙藥古日古木對(duì)自身免疫性肝炎INF-γ/STAT1通路的作用

    2021-11-22 13:20:56楊冬冬譚真真張子英馬麗杰
    科學(xué)技術(shù)與工程 2021年30期
    關(guān)鍵詞:古木免疫性肝細(xì)胞

    李 莎, 楊冬冬, 譚真真, 張子英, 金 蓉, 馬麗杰*

    (1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室, 呼和浩特 010110; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所, 北京 100050)

    自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種由肝細(xì)胞自身免疫介導(dǎo)進(jìn)行性的肝臟疾病[1]。自1950年6月首次被報(bào)道[2]以來,人們對(duì)AIH的特征的認(rèn)識(shí)逐漸加深,這類疾病的檢出率逐年升高[3],自身免疫性肝炎以女性為主,發(fā)病年齡呈雙峰型,發(fā)病高峰是兒童和中年人,尤其是更年期的婦女[4]。

    古日古木,即中藥紅花(CarthamustinctoriusL.)為菊科植物。傳統(tǒng)蒙藥成方中,古日古木-13是由紅花、丁香、蓮子、訶子、川楝子、桅子、麥冬、木香、紫檀香、麝香、銀朱、水牛角濃縮粉、牛黃組成的水丸,又稱紅花清肝十三味丸。古日古木-13出自《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊(cè))。臨床實(shí)踐中主要應(yīng)用于肝熱性病中,如脂肪肝、病毒性肝炎、藥物性肝損傷等[5]。研究證明,古日古木通過減少氧自由基生成、抑制一氧化氮(nitric oxide,NO)合成、減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(transforming growth factor 1,TGF-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)表達(dá)等途徑發(fā)揮減輕肝損傷的作用。古日古木中的訶子具有增加白介素2(interleukin-2,IL-2)分泌同時(shí)減少白介素8(interleukin-8,IL-8),進(jìn)而降低腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)生成減少炎性反應(yīng)的作用。而梔子也可以通過清除自由基、調(diào)節(jié)肝微粒酶作用等途徑有效的保護(hù)肝損傷。另外,麥冬、蓮子、麝香、牛黃等也被證明具有保護(hù)肝功能的作用[5]。胡建燃等[6]的研究發(fā)現(xiàn)紅花作為活血化瘀類中藥可以清除活性氧自由基,具有體外抗氧化和抗補(bǔ)體活性,表明可以在一定程度上應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療。本課題組前期研究證明,古日古木和古日古木-13對(duì)CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用,可能通過提高小鼠肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)及NO含量實(shí)現(xiàn)的[7-8]。而在CCl4誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷模型中,古日古木-13通過降低C-Jun、C-Fos蛋白表達(dá),增加肝再生增強(qiáng)因子ALR表達(dá),并抑制C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)信號(hào)激活等途徑發(fā)揮減輕肝損傷、促進(jìn)肝修復(fù)的作用[9]。本課題組前期研究證明古日古木和古日古木-13也可降低血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)等肝臟轉(zhuǎn)化酶而對(duì)刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)的免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。

    在Con A誘導(dǎo)的AIH模型中,IFN-γ/細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducer and activator of transcription1,STAT1)/血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用[10]。探討古日古木和古日古木-13對(duì)這條通路的影響可能揭示出它們的可能的分子內(nèi)作用機(jī)制之一,為它們?cè)贏IH中的應(yīng)用和進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

    基于此,現(xiàn)應(yīng)用現(xiàn)代藥理學(xué)方法探討蒙藥古日古木單、復(fù)方對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠急性自身免疫性肝損傷的保護(hù)作用,探索它們對(duì)INF-γ/STAT1/VCAM-1信號(hào)通路的影響。

    1 材料與儀器

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    BALB/c小鼠,體重(18±2) g,雌性,8~10周齡,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2011-0004。小鼠飼養(yǎng)于室溫、濕度55%、12 h晝夜節(jié)律的環(huán)境中,不限食水,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2 主要藥物與試劑

    古日古木,即紅花草藥,購(gòu)自同仁堂大藥房。古日古木-13(紅花清肝十三味丸),由內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):150152。用研缽將古日古木研磨成細(xì)粉,過80目篩。加1%吐溫80研磨均勻,分別加蒸餾水溶解并稀配成40、80、160 mg/kg混懸液,用即古日古木低劑量、中劑量、高劑量灌胃液,用前搖勻。古日古木-13灌胃液配制方法同古日古木。

    地塞米松磷酸鈉注射液,由鄭州卓峰制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):150722184,加入生理鹽水配制成0.002 mg/kg的灌胃液。丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(批號(hào):201603);堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒(批號(hào):201601);刀豆蛋白A(SLBR620V,Sigma公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)定試劑盒(批號(hào):201601-1);干擾素-γ(IFN-γ)測(cè)定試劑盒(批號(hào):201603-4)(南京博爾迪公司);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):4293719,BD公司);兔單克隆抗VCAM1抗體(批號(hào):GR257919-27);羊抗兔抗IgG抗體(批號(hào):GR297013-1)兔多克隆抗STAT1抗體(批號(hào):GR1095-11);α-Tublin(批號(hào):GR286515-3)(Abcam公司);兔多克隆p-STAT1抗體(批號(hào):0018,Cell Signaling 公司)NC膜(0.45 μmol/L,批號(hào):MM0006,Pull公司);ECL Western Blot顯色試劑盒(批號(hào):RE230466);BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào):RL242684,Thermo 公司)。

    1.3 主要儀器與設(shè)備

    酶標(biāo)儀Multiskan MK3(美國(guó)Thermo公司);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Mastercycler Gradient高速低溫離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司);FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(BD公司);LeicaCTR6000熒光顯微鏡(Leica 公司);Tanon-5200化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(北京原平皓生物技術(shù)公司)。

    2 方法

    2.1 動(dòng)物分組給藥與模型建立

    90只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為9組,即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、古日古木低、中、高劑量組、古日古木-13低、中、高劑量組。古日古木和古日古木-13低、中、高各劑量組分別給予古日古木和古日古木-13 400、800、1 600 mg/kg進(jìn)行灌胃;陽性對(duì)照組給予0.02 mg/kg地塞米松灌胃;空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃7 d。末次給藥1 h后,尾靜脈注射給予除空白對(duì)照組外各組小鼠20 mg/kg的Con A。

    2.2 細(xì)胞因子檢測(cè)

    小鼠麻醉下心臟取血,室溫下靜置30 min,1 000 r/min,低溫離心20 min,分離血清。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)血清中TNF-α和IFN-γ水平。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    2.3 TUNEL 法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

    TdT-mediated dUTP Nick-End labeling(TUNEL)檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)說明書說明進(jìn)行操作。將組織石蠟切片脫蠟至水,蛋白酶K(proteinase K) 37 ℃反應(yīng)30 min,磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗3遍。用配置好的TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光反應(yīng)60 min,PBS洗3次。Streptavidin-Fluorescein標(biāo)記液37 ℃避光反應(yīng)30 min,PBS洗3次。DAB(diaminobenzidine)顯色,蘇木素復(fù)染3 s后沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

    2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

    取新鮮的肝組織剪碎制成細(xì)胞懸液,加入結(jié)合緩沖液(1×binding Buffer)重懸細(xì)胞,調(diào)整濃度為106cells/mL,每管加5 μL 膜聯(lián)蛋白V(annexin V)和2.5 μL碘化丙啶(propidine iodide, PI)于重懸細(xì)胞液中,避光孵育15 min,最后加400 μL 1×binding Buffer后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),Annexin V為綠色熒光代表早期凋亡細(xì)胞,PI將核染為紅色,標(biāo)記中晚期凋亡細(xì)胞。

    2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測(cè)各組小鼠肝組織STAT1、p-STAT1、VCAM-1表達(dá)

    提取小鼠肝細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白含量,聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h,電轉(zhuǎn)2 h,脫脂奶粉封閉,加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜,加入二抗稀釋液室溫孵育1 h,洗膜緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)洗3次,每次10 min;超敏化學(xué)發(fā)光顯影液發(fā)光,儀器攝影。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    3 結(jié)果分析

    3.1 對(duì)小鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平的影響

    與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組TNF-α和IFN-γ水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與模型對(duì)照組相比,古日古木-13中、高劑量TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。古日古木高劑量組、古日古木-13對(duì)自身免疫性肝損傷有保護(hù)作用且作用強(qiáng)度呈劑量依賴性,保護(hù)作用可能是通過降低炎性細(xì)胞因子IFN-γ實(shí)現(xiàn)的,如表1所示。

    表1 對(duì)ConA所致小鼠肝損傷TNF-α、IFN-γ活力的影響Table 1 Effect of TNF-α and IFN-γ activity in liver injury induced by Con A in mice

    3.2 古日古木、古日古木-13對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響

    TUNEL標(biāo)記定位于肝細(xì)胞核,正常肝細(xì)胞核藍(lán)染,凋亡肝細(xì)胞核呈棕黃色??瞻讓?duì)照組肝細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,胞質(zhì)淡染,細(xì)胞核呈藍(lán)色且體積較大。模型對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,界限不清,絕大部分細(xì)胞核皺縮并出現(xiàn)棕黃色著染,提示這些這些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生凋亡,其余未染色細(xì)胞變小,胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象。各給藥組的肝細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞核皺縮、著染。其中古日古木各劑量組著染程度較重,古日古木-13各劑量組著染程度較輕,提示復(fù)方各劑量組對(duì)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用較顯著,尤其是復(fù)方中劑量組和高劑量組,如圖1所示。

    圖1 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡(10×40)Fig.1 Apoptosis was measured by TUNEL staining(10×40)

    由圖2和表2可知,流式細(xì)胞儀 (flow cytometry,F(xiàn)CM)測(cè)凋亡能力結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型對(duì)照組相比,古日古木和古日古木-13各劑量組均能明顯降低肝細(xì)胞的凋亡率(P<0.05),說明經(jīng)過古日古木和古日古木-13處理后,大鼠肝細(xì)胞凋亡能力降低。其中古日古木低劑量組、中劑量組降低幅度較小,其余4組降低幅度較大,但4組間沒有顯著差異。另外,古日古木、古日古木-13各劑量組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于陽性對(duì)照組。

    圖2 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Hepatocytes apoptosis in each group

    表2 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡率比較Table 2 The apoptosis rate of hepatocytes in each group was compared

    3.3 Western Blot檢測(cè)肝組織內(nèi)STAT1、p-STAT1和VCAM-1蛋白表達(dá)情況

    Western Blot結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織內(nèi)STAT1蛋白、p-STAT1蛋白和VCAM-1蛋白表達(dá)量明顯升高。與模型組相比,除古日古木-13中劑量組外,其他給藥組STAT1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05);除古日古木低劑量組外,其余給藥組p-STAT1蛋白均顯著降低(P<0.05),尤其是古日古木-13高劑量組。所有給藥組的VCAM-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05),尤其是古日古木-13高劑量組和古日古木-13低劑量組。提示藥物影響上述蛋白分子的表達(dá)方面劑量依賴性不明顯。如圖3和圖4所示。

    圖3 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blot

    *為與空白對(duì)照組比較, P<0.05;#為與模型組比較, P<0.05圖4 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blot

    4 討論

    目前鮮有針對(duì)AIH病因的治療,主要采用非特異性免疫抑制:潑尼松龍或者與免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。但約有70%應(yīng)用免疫抑制劑停藥后會(huì)再次復(fù)發(fā)[11]?;诿伤幑湃展拍竞凸湃展拍?13在肝病治療中已經(jīng)具備大量臨床成功經(jīng)驗(yàn),探索它們?cè)谧陨砻庖咝愿窝字械闹委熥饔煤妥饔脵C(jī)制,可能提供新的更為安全的治療手段。刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)的免疫性肝損傷動(dòng)物模型[12]。Con A是一種提取自刀豆的可以促進(jìn)T細(xì)胞有絲分裂的植物凝集素,它可以刺激T細(xì)胞,快速誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高和大量T細(xì)胞浸潤(rùn),繼而引發(fā)肝臟組織壞死,導(dǎo)致AIH[13]。常見的給藥劑量為10~30 mg/kg,常見取樣時(shí)間則以給藥后4~24 h[14],由前期實(shí)驗(yàn)的血清生化檢測(cè)結(jié)果可知,給予小鼠20 mg/kg Con A刺激16 h后進(jìn)行取樣可以得到理想的急性免疫性肝損傷模型。

    AIH的發(fā)病機(jī)制,較為公認(rèn)的觀點(diǎn)是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)[13]。文獻(xiàn)[15-17]發(fā)現(xiàn)TNF-α和INF-γ是自身免疫性肝細(xì)胞損傷的病原學(xué)原因,Mizuhara等[18]、Gantner等[19]發(fā)現(xiàn)Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷與TNF-α有關(guān)。Wang等[20]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TNF-α和IFN-γ都是ConA誘導(dǎo)肝炎的主要介質(zhì)。TNF-α以其可溶性形式和膜結(jié)合前體形式參與介導(dǎo)Con A肝炎,抑制細(xì)胞分裂并促進(jìn)凋亡。而IFN-γ可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活化與增殖,促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ的表達(dá),因此參與肝損傷的形成[12-13,21]。已經(jīng)上市的已經(jīng)上市的TNF-α中和抗體英夫利昔單抗對(duì)AIH具有臨床療效,但僅僅體現(xiàn)在個(gè)別病例上,尚無大規(guī)模的研究證明[22-24]。而目前已經(jīng)在使用的干擾素中和性抗體類藥物主要是IFN-α類,用于治療病毒性肝炎,在治療AIH方面鮮有報(bào)道[25]。本文研究中發(fā)現(xiàn)古日古木-13中、高劑量給藥組對(duì)TNF-α有明顯的降低作用,古日古木中、高劑量組、古日古木-13所有劑量對(duì)IFN-γ有明顯的降低作用。說明藥物對(duì)IFN-γ的影響更為顯著。提示藥物對(duì)AIH的保護(hù)作用主要是通過降低炎性細(xì)胞因子IFN-γ來實(shí)現(xiàn)的。

    肝損傷發(fā)生時(shí),細(xì)胞內(nèi)多種機(jī)制都可以參與誘導(dǎo)受損的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,如Fas介導(dǎo)、肝內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞凋亡減少導(dǎo)致的的肝細(xì)胞凋亡等[26]。原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法和流式細(xì)胞術(shù)是兩種檢測(cè)細(xì)胞凋亡常用的方法。TUNEL法能夠精確定位組織切片上的凋亡細(xì)胞,敏感性極高,但它只能標(biāo)記中、晚期凋亡細(xì)胞,且凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)易受主觀因素的影響;而流式細(xì)胞術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的有點(diǎn),但它不能區(qū)分晚期凋亡與壞死細(xì)胞[27]。本文研究中利用兩種方法檢測(cè)給與Con A后小鼠肝細(xì)胞的凋亡情況,互相印證、補(bǔ)充。結(jié)果表明古日古木、古日古木-13各個(gè)劑量組均能夠明顯抑制Con A引起的肝細(xì)胞的凋亡,尤其是古日古木高劑量組和古日古木-13的三個(gè)劑量組。但這4組間的細(xì)胞凋亡率并不存在顯著差異,與預(yù)想的劑量依賴趨勢(shì)并不符合。這說明,提高濃度也許并不能增加古日古木-13的抗凋亡效果。

    IFN-γ受體由IFNGR1和IFNGR2兩個(gè)亞單位組成,與IFN-γ結(jié)合后,它們分別引起JAK1和AK2活化。活化的JAKs磷酸化IFN-γ受體的胞內(nèi)部分,進(jìn)而引起STAT1的Tyr-701殘基磷酸化。磷酸化的STAT1自受體結(jié)合部位釋放入細(xì)胞形成二聚體之后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄,包括一氧化氮合酶(iNOS)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)和IFN-γ誘生的單核因子(Mig),以及干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1)[28-29]。IRF-1是一種可以調(diào)控若干抗病毒和抗凋亡基因、調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)病原體的固有免疫及適應(yīng)性免疫的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn),Con A肝炎發(fā)生時(shí),小鼠體內(nèi)的IRF-1表達(dá)明顯增加[30],且IRF-1-/-小鼠對(duì)Con A敏感度降低[31]。INF-γ/STAT1/IRF-1信號(hào)通路可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞間黏附分子-1(ICM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、CC類趨化因子配體-20(CCL-20),上皮來源的中性粒細(xì)胞活化肽-78 (ENA-78),干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞α趨化因子(I-TAC)、Mig以及IP-10等多種趨化因子和黏附分子,它們促進(jìn)白細(xì)胞的浸潤(rùn),發(fā)揮促炎作用參與AIH的形成[32]。結(jié)果表明,古日古木和古日古木-13對(duì)INF-γ/STAT1信號(hào)通路有影響,尤其是古日古木-13高劑量組最為明顯,抑制INF-γ/STAT1信號(hào)通路并減少其下游分子VCAM-1的表達(dá)很有可能是藥物抑制AIH的作用機(jī)制之一。

    5 結(jié)論

    綜上所述,古日古木和古日古木-13均能不同程度的保護(hù)Con A導(dǎo)致的小鼠急性自身免疫性肝損傷,其機(jī)制可能是通過降低炎癥因子的釋放、減輕肝臟組織學(xué)改變、抑制INF-γ/STAT1信號(hào)通路及其下游效應(yīng)分子VCAM-1,進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng),同時(shí)減輕肝細(xì)胞凋亡來發(fā)揮保護(hù)肝臟作用的。

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