愈風(fēng)寧心滴丸預(yù)防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用及機(jī)制研究

蔣曉萌，楊代剛，高永耀，鄒庭峰，施存元，江 宏，段亞君，楊瀟瀟*

愈風(fēng)寧心滴丸預(yù)防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用及機(jī)制研究

蔣曉萌1，楊代剛2，高永耀2，鄒庭峰2，施存元1，江 宏1，段亞君2，楊瀟瀟2*

1.浙江尖峰藥業(yè)有限公司，浙江 金華 321000 2.合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230001

觀察愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛小鼠的影響，探索愈風(fēng)寧心滴丸預(yù)防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用及機(jī)制。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，以愈風(fēng)寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）及葛根素（50 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)，收集細(xì)胞。將野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成照組、模型組以及愈風(fēng)寧心滴丸低、中、高劑量（200、360、600 mg/kg）組和葛根素組（37.8 mg/kg），給予藥物進(jìn)行干預(yù)，于第3、5、7、9、11天ip硝酸甘油溶液（10 mg/kg）建立小鼠偏頭痛模型，第3天開(kāi)始進(jìn)行痛覺(jué)敏感（機(jī)械壓痛和熱敏耐受）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取小鼠血清和腦組織。檢測(cè)各組BV2細(xì)胞活性氧含量；采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）、SOD2蛋白表達(dá)以及各組小鼠三叉神經(jīng)脊束尾核（trigeminal nucleus caudalis，TNC）區(qū)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、c-Fos、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）及促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）蛋白表達(dá)；采用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞、、、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）mRNA表達(dá)以及小鼠TNC區(qū)、mRNA表達(dá)；采用免疫熒光檢測(cè)各組小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos表達(dá)；采用生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。愈風(fēng)寧心滴丸顯著上調(diào)BV2細(xì)胞抗氧化酶、mRNA和蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001），降低活性氧水平（＜0.01、0.001），抑制炎癥因子和mRNA表達(dá)（＜0.001）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠基礎(chǔ)痛閾值顯著降低（＜0.05、0.001），TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001），TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠基礎(chǔ)痛閾值顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性；愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)偏頭痛小鼠血清中ALT、AST和ALP活性無(wú)顯著性影響。愈風(fēng)寧心滴丸可能通過(guò)抑制血管擴(kuò)張、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)等多重途徑發(fā)揮預(yù)防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用。

愈風(fēng)寧心滴丸；偏頭痛；神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞；血管擴(kuò)張；神經(jīng)炎癥

腦血管的舒縮功能受阻會(huì)導(dǎo)致偏頭痛[1]。當(dāng)顱內(nèi)血管收縮時(shí)，引起偏頭痛先兆癥狀的產(chǎn)生，隨后出現(xiàn)顱內(nèi)外血管擴(kuò)張。這一過(guò)程使得血管周?chē)M織持續(xù)產(chǎn)生血管活性多肽，進(jìn)一步造成顱內(nèi)外血管過(guò)度擴(kuò)張，引起搏動(dòng)性的頭痛[2]。具有收縮血管作用的藥物麥角胺能夠緩解偏頭痛為此提供了有力證明[3]。此外，有臨床研究報(bào)道，發(fā)作性神經(jīng)-血管功能障礙引起的陣發(fā)性血管痙攣是偏頭痛發(fā)生的主要機(jī)制[4]。目前較多研究表明中樞敏化增加了偏頭痛患者的發(fā)病頻率，即逐漸演變?yōu)槁云^痛，表現(xiàn)出患者頭面部、肢體或其他皮膚部位的痛覺(jué)過(guò)敏[5]。偏頭痛中樞敏化的主要區(qū)域?yàn)橥从X(jué)通路中三叉神經(jīng)脊束尾核部位（trigeminal nucleus caudalis，TNC），該區(qū)域異常神經(jīng)元信號(hào)調(diào)控引起中樞敏化[6]。隨著人們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞及其分泌的炎癥因子參與了慢性偏頭痛中樞敏化的調(diào)節(jié)[7-8]。

愈風(fēng)寧心滴丸是根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新技術(shù)，以葛根為原料研制而成的一種高效、速效的純中藥滴丸劑。大量實(shí)驗(yàn)證明，葛根及其提取物葛根素能改善微循環(huán)，增加腦和冠狀動(dòng)脈血流量，改善缺鐵新機(jī)代謝，對(duì)高血壓、頭痛、項(xiàng)強(qiáng)癥狀、冠心病、心絞痛等均有顯著療效[9]。此外，相關(guān)研究表明葛根素具有治療慢性神經(jīng)性疼痛的作用，但其具體機(jī)制尚不清晰[10]。葛根素作為愈風(fēng)寧心滴丸的重要成分，表明愈風(fēng)寧心滴丸具有治療血管痙攣性偏頭痛的潛在作用。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞水平的研究，確定愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)血管痙攣性偏頭痛的作用，并闡明可能的作用機(jī)制，為其臨床推廣提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性野生型C57BL/6J小鼠，8周齡，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0008。小鼠分籠飼養(yǎng)于合肥工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自然光照，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，自由進(jìn)食飲水。在開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之前，小鼠于實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)HFUT20200901005）。在治療期間，每日記錄小鼠體質(zhì)量，沒(méi)有觀察到因?qū)嶒?yàn)操作產(chǎn)生的不良影響。

1.2 細(xì)胞

BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.3 藥品與試劑

愈風(fēng)寧心滴丸（批號(hào)200303）由浙江尖峰藥業(yè)有限公司提供，每丸含葛根素6.3 mg；葛根素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)2114090）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）單克隆抗體（批號(hào)A5328）、c-Fos單克隆抗體（批號(hào)A0236)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）單克隆抗體（批號(hào)A4782）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）單克隆抗體（批號(hào)A17361）、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）單克隆抗體（批號(hào)A0274）、SOD2單克隆抗體（批號(hào)A1340）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；磷酸化ERK（p-ERK）單克隆抗體（批號(hào)A80031-1-RR）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）單克隆抗體（批號(hào)13171-1-AP）、HRP標(biāo)記的α-Tubulin抗體（批號(hào)HRP-66031）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)LK2001）購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)RL241930）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（批號(hào)KFS344）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；總RNA提取試劑（批號(hào)70087434）購(gòu)自Biosharp公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)R123-01）購(gòu)自南京維諾贊生物科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)200722103）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)200818101）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)201120101）購(gòu)自美康生物科技股份有限公司。

1.4 儀器

電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；微量高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；超純水系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）；超微量檢測(cè)儀（美國(guó)Pultton公司）；qRT-PCR儀（瑞士Roche公司）；冰凍切片機(jī)、激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi公司）；YLS-12S型鼠尾光照測(cè)痛儀、YLS-3E型電子壓痛儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

基于文獻(xiàn)中葛根素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)研究報(bào)道[11]，確定體外實(shí)驗(yàn)中葛根素濃度為10～100 μmol/L。將BV2細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入葛根素（50 μmol/L）以及愈風(fēng)寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）預(yù)處理1 h，隨后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，最后加入MTT溶液（0.5 mg/mL），孵育4 h，加入DMSO溶解后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處的吸光度（）值。

2.2 細(xì)胞ROS檢測(cè)

用不同濃度的愈風(fēng)寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）及葛根素（50 μmol/L）處理BV2細(xì)胞1 h，然后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，最后加入10mmol/L DCFH-DA探針進(jìn)行反應(yīng)，并于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm及發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.3 動(dòng)物造模、分組與給藥

根據(jù)愈風(fēng)寧心滴丸說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)，基于成人1 d內(nèi)用藥劑量，利用體表面積法換算成小鼠1 d用藥劑量約為360 mg/kg（以此劑量作為中劑量組）；在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中小鼠給藥劑量一般按照2倍左右劑量差（約200 mg/kg）進(jìn)行遞增/減，因此選擇200 mg/kg作為低劑量組給藥劑量；在此基礎(chǔ)上，為避免給藥劑量過(guò)大，以200 mg/kg劑量差設(shè)計(jì)了高劑量組給藥劑量（600 mg/kg）；本研究所用愈風(fēng)寧心滴丸中葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.5%，因此設(shè)計(jì)了與中劑量組劑量相應(yīng)的葛根素組給藥劑量為37.8 mg/kg。

綜上，將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組以及愈風(fēng)寧心滴丸低、中、高劑量（200、360、600 mg/kg）組和葛根素（37.8 mg/kg）組，每組8只。造模組及給藥組于第3、5、7、9、11天ip硝酸甘油溶液（10 mg/kg）建立小鼠偏頭痛模型[12]，ip硝酸甘油溶液幾分鐘后，可觀察到小鼠耳朵發(fā)紅、鎮(zhèn)靜、不定時(shí)有撓頭現(xiàn)象；對(duì)照組ip等體積0.9%氯化鈉溶液。各給藥組小鼠每日喂食含相應(yīng)劑量藥物的食物，對(duì)照組和模型組正常飲食。

2.4 痛覺(jué)敏感行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

頭痛是偏頭痛的一個(gè)特征，異常皮膚疼痛是超敏反應(yīng)的一種表現(xiàn)。對(duì)小鼠進(jìn)行痛覺(jué)敏感性實(shí)驗(yàn)（機(jī)械壓痛實(shí)驗(yàn)和熱敏耐受實(shí)驗(yàn)），能夠初步判斷愈風(fēng)寧心滴丸是否具有治療偏頭疼的作用。在實(shí)驗(yàn)的第3、5、7、9、11天進(jìn)行痛覺(jué)敏感行為學(xué)測(cè)定，即在每次ip硝酸甘油溶液當(dāng)天測(cè)試小鼠痛閾值，作為基線痛閾值，以此反映出隨著硝酸甘油溶液注射次數(shù)以及給藥次數(shù)的增加，各給藥組小鼠基礎(chǔ)超敏反應(yīng)的差異。

2.4.1 機(jī)械壓痛實(shí)驗(yàn) 采用電子壓痛儀對(duì)小鼠尾根部1～2 cm處施加逐漸增大的壓力，待小鼠因?yàn)閴和炊饨谢蛘邟暝鷷r(shí)，記錄此時(shí)的壓力值，每次記錄3次取平均值，以此數(shù)值作為小鼠的壓痛閾值。

2.4.2 熱敏耐受實(shí)驗(yàn) 采用鼠尾光照測(cè)痛儀對(duì)小鼠尾根部1～2 cm處給予一定的光照，待小鼠因?yàn)闊嵬炊鴱楅_(kāi)尾巴時(shí)，儀器自動(dòng)記錄小鼠開(kāi)始接近光源至尾巴彈開(kāi)時(shí)的時(shí)間，每次記錄3次取平均值，以此數(shù)值作為小鼠的熱痛閾值。

2.5 Western blotting檢測(cè)BV2細(xì)胞和偏頭痛小鼠TNC區(qū)組織蛋白表達(dá)

用不同濃度的愈風(fēng)寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）及葛根素（50 μmol/L）處理BV2細(xì)胞1 h，然后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，收集細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h，分別加入SOD1、SOD2、HSP90和α-Tubulin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)二抗，常溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，采用成像設(shè)備顯影。

最后1次ip硝酸甘油溶液24 h后，小鼠安樂(lè)死，取小鼠腦TNC區(qū)組織，同裂解液研磨后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h，分別加入CGRP、c-Fos、p-ERK、ERK、IL-6、HSP90抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)二抗，常溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，采用成像設(shè)備顯影。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)BV2細(xì)胞和偏頭痛小鼠TNC區(qū)組織相關(guān)基因表達(dá)

用不同濃度的愈風(fēng)寧心滴丸（10、50、100mmol/L）及葛根素（50 μmol/L）處理BV2細(xì)胞1 h，然后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，收集細(xì)胞。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取細(xì)胞和偏頭痛小鼠TNC區(qū)組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 免疫熒光染色檢測(cè)偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP和c-Fos蛋白表達(dá)

麻醉小鼠后，依次用PBS溶液和多聚甲醛對(duì)小鼠經(jīng)心灌流處理，分離腦組織，干冰速凍，于多聚甲醛固定24 h，再依次用20%、30%的蔗糖溶液充分脫水，直至組織沉陷。OCT包埋組織后，切取10mm組織切片，于?40 ℃凍存。染色時(shí)，取出組織片于室溫放置30 min揮發(fā)OCT，經(jīng)破膜、2%BSA封閉、抗體孵育、DAPI染核、封片等步驟后使用激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.8 生化分析儀檢測(cè)偏頭痛小鼠血清中AST、ALT和ALP活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，獲取小鼠全血，靜止2 h后，于2000×條件下離心20 min，得血清。采用PBS稀釋3倍后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)指示，通過(guò)生化分析儀檢測(cè)血清中AST、ALT和ALP活性。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 愈風(fēng)寧心滴丸抑制BV2細(xì)胞中炎癥因子和活性氧水平

TNC區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而引發(fā)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞激活，增加痛覺(jué)敏感。如圖1-A所示，各組細(xì)胞存活率均無(wú)顯著差異，表明本研究所用該藥物濃度對(duì)BV2細(xì)胞細(xì)胞活性沒(méi)有影響。如圖1-B所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ROS水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組ROS水平顯著降低（＜0.01、0.001）。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖2～5、7、8同

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞、mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01、0.001）；與模型組比較，各給藥組、mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。表明愈風(fēng)寧心滴丸能夠通過(guò)調(diào)控抗氧化物酶的表達(dá)發(fā)揮抑制ROS的作用。

此外，炎癥也是誘導(dǎo)神經(jīng)元激活的另一個(gè)重要因素。如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.001）。上述結(jié)果表明，愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)BV2細(xì)胞具有很好的抗氧化、抗炎作用，提示其在體內(nèi)可能也具有較好的保護(hù)作用。

3.2 愈風(fēng)寧心滴丸改善偏頭痛小鼠的痛覺(jué)敏感

通過(guò)電子壓痛儀及光照測(cè)痛儀對(duì)小鼠尾部進(jìn)行痛覺(jué)耐受檢測(cè)，即痛覺(jué)敏感性實(shí)驗(yàn)（機(jī)械壓痛實(shí)驗(yàn)和熱敏耐受實(shí)驗(yàn)）。痛覺(jué)敏感性實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺醪脚袛嘤L(fēng)寧心滴丸是否具有治療偏頭疼的作用。如圖4所示，各組小鼠給藥前的基礎(chǔ)痛閾值無(wú)顯著差異，第1次ip硝酸甘油溶液后，與對(duì)照組對(duì)比，模型組的基礎(chǔ)痛閾值開(kāi)始降低，并且在反復(fù)ip硝酸甘油溶液后小鼠基礎(chǔ)熱痛閾值以及壓痛閾值顯著降低（＜0.05、0.001），提示痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生。給予愈風(fēng)寧心滴丸及葛根素治療后，小鼠的熱痛閾值以及壓痛閾值顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），表明愈風(fēng)寧心滴丸可以改善偏頭痛小鼠表現(xiàn)出的痛覺(jué)敏感。

圖2 愈風(fēng)寧心滴丸上調(diào)BV2細(xì)胞抗氧化酶SOD1和SOD2的表達(dá)(, n = 3)

圖3 愈風(fēng)寧心滴丸抑制BV2細(xì)胞IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)(, n = 3)

圖4 愈風(fēng)寧心滴丸改善偏頭痛小鼠的熱痛閾值(A) 及壓痛閾值(B)(, n = 6)

3.3 愈風(fēng)寧心滴丸通過(guò)降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達(dá)改善中樞敏化

血管舒張肽CGRP是神經(jīng)源性炎癥發(fā)生的主要因素之一，與c-Fos及p-ERK蛋白一樣，被認(rèn)為是中樞敏化的分子標(biāo)記物。如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001）；與模型組相比，各給藥組TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖5 愈風(fēng)寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos和p-ERK蛋白表達(dá) (, n = 6)

如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組TNC區(qū)中CGRP、c-Fos免疫反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量增加，給予愈風(fēng)寧心滴丸及葛根素干預(yù)后，CGRP、c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少。以上結(jié)果表明，愈風(fēng)寧心滴丸可能通過(guò)降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達(dá)改善小鼠中樞敏化，降低偏頭痛模型小鼠的痛覺(jué)敏感。

3.4 愈風(fēng)寧心滴丸降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)炎癥因子的表達(dá)

如圖7、8所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。表明愈風(fēng)寧心滴丸可能通過(guò)降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)炎癥因子的表達(dá)改善偏頭痛。

3.5 愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)偏頭痛小鼠血清中AST、ALT和ALP活性的影響

如圖9所示，各組小鼠血清AST、ALT、APL活性均無(wú)顯著差異，且均處于正常水平，表明愈風(fēng)寧心滴丸不會(huì)對(duì)小鼠造成肝毒性，提示其使用具有安全性。

圖6 愈風(fēng)寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP和c-Fos蛋白表達(dá)(, n = 6)

圖7 愈風(fēng)寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)(, n = 6)

圖8 愈風(fēng)寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)IL-6蛋白表達(dá)(, n = 6)

4 討論

偏頭痛作為臨床常見(jiàn)的原發(fā)性疾病，表現(xiàn)出反復(fù)發(fā)作、搏動(dòng)樣頭痛，并可伴有惡心、嘔吐、畏光、畏聲等癥狀[12]。因其發(fā)作原因復(fù)雜多樣且發(fā)病機(jī)制不明確，大多數(shù)偏頭痛患者都不滿于現(xiàn)有接受的治療方案[13]。在對(duì)偏頭痛發(fā)病機(jī)制的研究過(guò)程中，產(chǎn)生了神經(jīng)源、血管源以及三叉神經(jīng)血管反射等多種學(xué)說(shuō)[14]。研究表明，腦部TNC區(qū)異常神經(jīng)元信號(hào)調(diào)控引起中樞敏化，反復(fù)的中樞敏化促使偏頭痛向慢性偏頭痛的轉(zhuǎn)換[6]。CGRP作為強(qiáng)大的血管舒張肽，主要表達(dá)于三叉神經(jīng)的無(wú)髓神經(jīng)纖維，當(dāng)三叉神經(jīng)興奮時(shí)會(huì)釋放大量的CGRP，促使硬腦膜血管擴(kuò)張，進(jìn)而引起神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致偏頭痛的產(chǎn)生[14]。原癌基因的激活和ERK的磷酸化已被用作神經(jīng)元激活和中樞敏化的可靠分子標(biāo)志物[15]。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元細(xì)胞信號(hào)交互通路參與了偏頭痛的病理生理機(jī)制，促炎因子IL-1β也參與偏頭痛病理過(guò)程，提示小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)其釋放的促炎細(xì)胞因子影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的興奮，參與偏頭痛的發(fā)生與維持[16-17]。

圖9 愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)偏頭痛小鼠血清中AST、ALT和ALP活性的影響(, n = 6)

愈風(fēng)寧心滴丸是由結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新技術(shù)由葛根提取加工而成的中藥滴丸，臨床上治療心絞痛、冠心病等心血管疾病效果顯著。其主要成分葛根素具有解痙升陽(yáng)、增強(qiáng)腦及冠脈血流量、祛除患者頭痛之功效[18]。葛根素可能通過(guò)抑制瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）、CGRP和P物質(zhì)預(yù)防紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠周?chē)窠?jīng)病理性疼痛[19]。以上研究為愈風(fēng)寧心滴丸防治偏頭痛提供了一定的科學(xué)依據(jù)。本研究考察了愈風(fēng)寧心滴丸對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)愈風(fēng)寧心滴丸及葛根素能夠上調(diào)BV2細(xì)胞抗氧化酶、的mRNA及蛋白表達(dá)水平，抑制LPS引起的ROS水平異常升高，改善細(xì)胞中的高氧化壓力狀態(tài)，同時(shí)通過(guò)下調(diào)IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，提示愈風(fēng)寧心滴丸具有改善偏頭痛的潛力。

一氧化氮是偏頭痛病理生理過(guò)程中的重要神經(jīng)遞質(zhì)[20]。研究證明，硝酸甘油作為一氧化氮供體給藥會(huì)導(dǎo)致健康受試者頭痛，而偏頭痛患者則會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的遲發(fā)性頭痛[21]。本研究通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行反復(fù)ip硝酸甘油溶液誘導(dǎo)慢性偏頭痛的產(chǎn)生，模擬臨床慢性偏頭痛癥狀，結(jié)果顯示，模型組小鼠的痛閾值顯著降低，表現(xiàn)出明顯的痛覺(jué)敏感。與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦部TNC區(qū)促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6以及疼痛相關(guān)蛋白CGRP、c-Fos、p-ERK的表達(dá)明顯升高；與模型組比較，各給藥組小鼠基礎(chǔ)痛閾值明顯升高，表現(xiàn)出對(duì)痛覺(jué)敏感的顯著抑制；各給藥組小鼠TNC區(qū)促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6以及疼痛相關(guān)蛋白CGRP、c-Fos、p-ERK的表達(dá)顯著降低，呈劑量相關(guān)性。

綜上所述，愈風(fēng)寧心滴丸可以降低偏頭痛小鼠腦部TNC區(qū)疼痛相關(guān)蛋白CGRP、c-Fos、p-ERK以及促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)，進(jìn)而降低痛覺(jué)敏感，緩解偏頭痛。其機(jī)制可能為通過(guò)抑制血管擴(kuò)張及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到防治血管痙攣性偏頭痛的作用。本研究為愈風(fēng)寧心滴丸防治偏頭痛的研究提供了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中藥在偏頭痛的應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Yufeng Ningxin Dropping Pills on preventive treatment of vasospasm migraine

JIANG Xiao-meng1, YANG Dai-gang2, GAO Yong-yao2, ZOU Ting-feng2, SHI Cun-yuan1, JIANG Hong1, DUAN Ya-jun2, YANG Xiao-xiao2

1.Zhejiang Jianfeng Pharmaceutical Co., Ltd., Jinhua 321000, China 2.Hefei University of Technology, Hefei 230001, China

To observe the effect of Yufeng Ningxin Dropping Pills (愈風(fēng)寧心滴丸) on nitroglycerin-induced migraine mice, and explore the effect and mechanism of Yufeng Ningxin Dropping Pills on preventive treatment of vasospasm migraine.Lipopolysaccharide (LPS) was used to stimulate BV2 neuroglial cells, Yufeng Ningxin Dripping Pills (10, 50, 100 μmol/L) and puerarin (50 μmol/L) were used for intervention, and cells were collected.Wild-type C57BL/6J mice were randomly divided into control group, model group, low-, medium-, and high-dose (200, 360, 600 mg/kg) Yufeng Ningxin Dripping Pill group and puerarin (37.8 mg/kg) group, drugs were given for intervention, migraine model of mice was established with ip nitroglycerin solution (10 mg/kg) on 3rd, 5th, 7th, 9th and 11th day, hyperalgesia tolerance behavioral experiment (mechanical tenderness and heat sensitivity) were started on 3rd day; After experiment, the serum and brain tissue of mice were taken.The content of reactive oxygen species in BV2 cells of each group was detected; Western blotting was used to detect the expressions of superoxide dismutase 1 (SOD1) and SOD2 protein in BV2 cells and calcitonin gene-related peptide (CGRP), c-Fos, phosphorylated extracellular regulated protein kinases (p-ERK) and pro-inflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6) protein expressions in trigeminal nucleus caudalis (TNC) region in mice of each group; qRT-PCR method was used to detect,,, tumor necrosis factor-α () mRNA expressions in BV2 cells andandmRNA expressions in TNC of mice; Immunofluorescence was used to detect the expressions of CGRP and c-Fos in TNC area of mice?? in each group; Automatic biochemical analyzer was used to detect the alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) activities in serum of mice.Yufeng Ningxin Dripping Pills significantly increased antioxidant enzymeandmRNA and protein expression levels in BV2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001), reduced reactive oxygen species levels (< 0.01, 0.001), inhibited the inflammatory factorandmRNA expression (< 0.001).Compared with control group, basic pain threshold of mice in model group was significantly reduced (< 0.05, 0.001), expressions of CGRP, c-Fos and p-ERK proteins in TNC area were significantly increased (< 0.01, 0.001).The expressions of,mRNA and IL-6 protein in TNC area were significantly increased (< 0.01); Compared with model group, basic pain threshold of mice in each administration group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), expressions of CGRP, c-Fos and p-ERK proteins in TNC area were significantly reduced (< 0.05, 0.01, 0.001), expressions of,mRNA and IL-6 proteins in TNC area were significantly reduced (< 0.05, 0.01, 0.001), and showed a dose-related relationship; Yufeng Ningxin Dripping Pills had no significant effect on activities of ALT, AST and ALP in serum of migraine mice.Yufeng Ningxin Dripping Pills may play a preventive effect on vasospasm migraine by inhibiting vasodilation, inhibiting inflammation and promoting the expression of antioxidant enzymes.

Yufeng Ningxin Dropping Pills; migraine; microglia; vasodilation; neuroinflammation

R285.5

A

0253 - 2670(2021)22 - 6881 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.013

2021-05-20

安徽省重點(diǎn)研究和開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201904a07020007）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2020M681914）

蔣曉萌（1964—），男，碩士，浙江省有突出貢獻(xiàn)中青年專家，主要從事新藥研發(fā)。Tel: 17855867735 E-mail: Jxm@vip.163.com

通信作者：楊瀟瀟（1990—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事重大疾病（心腦血管疾病、腫瘤等）藥理學(xué)研究。Tel: 13920087912 E-mail: yangxiaoxiao@hfut.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]