孔板空化強(qiáng)化制備京尼平-殼聚糖載藥納米微球的工藝研究

徐云，張昆明，黃永春，陸麗金，段超，余慧群

摘? 要： 以5-氟尿嘧啶（5-Fu）為模型藥物，京尼平為交聯(lián)劑，采用幾何孔板空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備殼聚糖納米微球，考察了孔板結(jié)構(gòu)、入口壓力、出口壓力、交聯(lián)溫度、交聯(lián)時(shí)間對空化數(shù)及其對微球平均粒徑的影響，并與傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了比較.結(jié)果表明：空化強(qiáng)度對微球的粒度大小存在顯著影響;開孔率小，比周長大的幾何孔板更有利于制備出超細(xì)粒度的納米級微球.優(yōu)化工藝參數(shù)為：單孔且孔徑為3.0 mm的孔板，孔板入口壓力0.28 MPa，孔板出口壓力0 MPa，交聯(lián)溫度60 ℃，交聯(lián)時(shí)間40 min，制得的微球粒度最小為292.6 nm，孔板空化強(qiáng)化制備的微球粒度明顯小于傳統(tǒng)工藝制備的微球粒度.紅外光譜（FT-IR）結(jié)果表明，在孔板空化作用下，模型藥物 5-Fu成功負(fù)載于殼聚糖微球中，且其結(jié)構(gòu)未被破壞，說明孔板空化適用于強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備可負(fù)載藥物的納米級殼聚糖微球.

關(guān)鍵詞：孔板空化;京尼平;殼聚糖微球;粒徑;空化數(shù);工藝參數(shù);正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中圖分類號：TQ463.25? ? ? ? ? ? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.04.002

0? ? 引言

殼聚糖作為一種天然弱堿性多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性，且安全無毒，常被加工制備成具有一定功能用途的殼聚糖微球[1- 2].殼聚糖微球可作為一種新型藥物載體，用來負(fù)載一些活性成分，如蛋白質(zhì)[3]、維生素[4]、茶多酚[5]、抗癌藥物[6-7]等，其制備過程已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn).目前，乳化交聯(lián)過程是制備殼聚糖微球最常用的方法之一[8]，此法制備過程中通常采用機(jī)械攪拌的方式，所制備的殼聚糖微球粒度較大（微米級）[9-10]，且微球粒度均一性差，影響后續(xù)應(yīng)用[11].然而，小粒徑的納米載藥系統(tǒng)比大粒徑微球具有更大優(yōu)勢，如：具有靶向性、控制藥物釋放和延長藥效等特點(diǎn)[12-13].納米微球是一種粒度尺寸小于1.0 μm 的? ? 顆粒[14].

目前，已有采用高壓膜乳化[15]、靜電乳化[16]和超聲乳化[17]等技術(shù)對傳統(tǒng)乳化交聯(lián)制備殼聚糖微球的過程進(jìn)行改進(jìn)或強(qiáng)化的報(bào)道，但這些技術(shù)尚存在工藝耗時(shí)長、生產(chǎn)效率低、能耗高等缺點(diǎn)[14-16].因此，開發(fā)新技術(shù)強(qiáng)化傳統(tǒng)乳化交聯(lián)過程對制備得到納米級的殼聚糖微球具有重要意義.水力空化作為一種新型的過程強(qiáng)化技術(shù)，通常這樣實(shí)現(xiàn)：當(dāng)流體流經(jīng)一個(gè)節(jié)流元件（如：幾何孔板）時(shí)產(chǎn)生壓降，當(dāng)壓力低于飽和蒸汽壓時(shí)，液體內(nèi)部會產(chǎn)生空化泡，空化泡在遇到周圍壓力增大時(shí)發(fā)生潰滅，在潰滅瞬間可產(chǎn)生高溫（1 000 K～5 000 K）、高壓（1 MPa～50 MPa）等極端環(huán)境效應(yīng)，且會產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波、微射流和劇烈湍動等機(jī)械效應(yīng)，同時(shí)水溶液中可產(chǎn)生羥自由基等活化效應(yīng)[18].這些效應(yīng)可用于強(qiáng)化物理過程和化學(xué)過程[19-22].例如：Sonawane等[19]采用孔板空化制備碳酸鈣納米粒，所得納米粒的粒徑比傳統(tǒng)機(jī)械攪拌減小了63.4%.張昆明等[20]使用文丘里管空化強(qiáng)化離子交聯(lián)法制備殼聚糖抗菌納米微球，所得殼聚糖微球的粒徑比傳統(tǒng)機(jī)械攪拌小21.1%以上.占葉勇等[21]使用水力空化強(qiáng)化大豆油脫臭餾出物酯化脫酸反應(yīng)，在相同原料配比下，與機(jī)械攪拌相比，酯化率提高了12.1%.截至目前，尚未見采用孔板空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備殼聚糖納米微球的研究報(bào)道.

本研究以5-氟尿嘧啶（5-Fu）為模型藥物，京尼平為交聯(lián)劑，采用基于幾何孔板的水力空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備載藥殼聚糖納米微球，考察孔板結(jié)構(gòu)、入口壓力、出口壓力、交聯(lián)溫度、交聯(lián)時(shí)間對空化數(shù)以及微球粒徑的影響規(guī)律，并和傳統(tǒng)工藝進(jìn)行比較，以期為幾何孔板空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備殼聚糖納米微球提供一定的理論依據(jù).

1? ? 材料與方法

1.1? ?材料與儀器

1.1.1? ? 材料與試劑

殼聚糖（CS，分子量為500 kDa，脫乙酰度為90%），購自廣東省深圳市中發(fā)源生物科技有限公司;京尼平（純度[>]98%），購自廣西山云生化科技股份有限公司;棕櫚油，購自天津市聚龍糧油有限公司;Span 80為化學(xué)純（CP），購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;冰醋酸、無水乙酸鈉均為分析純（AR），購自廣東西隴科學(xué)股份有限公司.所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，電導(dǎo)率≤ 4.0 μS/cm.

1.1.2? ? 主要儀器

孔板空化裝置（自行研制），DF-101T集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），Nano-ZS90型激光納米粒度分析儀（英國Malven公司），DZ-2AII 真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），JXN-26 冷凍高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司），UPH-IV-20T純水/超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）.

1.2? ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? ?實(shí)驗(yàn)裝置與流程

孔板空化實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示，孔板結(jié)構(gòu)如圖2所示，其結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示.殼聚糖納米微球制備方法如下：1）稱取適量殼聚糖溶于pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，配制成10 g/L的殼聚糖溶液;2）稱取適量5-Fu溶于配制好的殼聚糖酸性溶液中;3）稱取適量京尼平溶于70%乙醇中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的京尼平溶液;4）量取2 455 mL棕櫚油（油相），加入90 mL Span-80，攪拌5 min，使其混合均勻;5）將367 mL殼聚糖酸性溶液以40 mL/min的速度加入含Span-80的油相中，邊滴加邊攪拌至均勻，形成負(fù)載殼聚糖的油包水型（W/O）粗乳液;6）重復(fù)上述操作，量取480 mL棕櫚油，加入18 mL Span-80和72 mL京尼平溶液，攪拌均勻，形成負(fù)載京尼平的油包水（W/O）乳液;7）將上述負(fù)載殼聚糖的油包水型（W/O）粗乳液倒入孔板空化裝置的料液槽中，開啟驅(qū)動泵，通過調(diào)節(jié)閥門V2和V3來控制孔板入口壓力（P1），調(diào)節(jié)閥門V4來控制孔板出口壓力（P2），連續(xù)操作20 min，形成負(fù)載殼聚糖的油包水型（W/O）細(xì)乳液;8）以20 mL/min的速度將負(fù)載京尼平的油包水（W/O）乳液加入上述負(fù)載殼聚糖的油包水型（W/O）細(xì)乳液中，與殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)固化，控制合適的交聯(lián)溫度與交聯(lián)時(shí)間，待反應(yīng)結(jié)束后，取出料液，迅速冷卻至室溫，進(jìn)行離心;9）將離心后的沉淀用石油醚和無水乙醇進(jìn)行洗滌，真空干燥，即可得到載5-Fu藥物的殼聚糖納米微球.

1—料液槽;2—驅(qū)動泵;3—空化元件（孔板）;4—渦街流量計(jì);

5—恒溫水槽;V1、V2、V3、V4—閥門;P1、P2—壓力計(jì).

1.2.2? 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）孔板結(jié)構(gòu)對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的 影響

實(shí)驗(yàn)保持孔板入口壓力0.28 MPa，出口壓力? 0 MPa，交聯(lián)溫度60 ℃，交聯(lián)時(shí)間40 min不變，以1.2.1節(jié)所述3種孔板結(jié)構(gòu)進(jìn)行強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，探討不同孔板結(jié)構(gòu)對殼聚糖納米微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響.

2）孔板入口壓力對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)采用單孔且孔徑為3 mm的孔板，保持空化出口壓力0 MPa，交聯(lián)溫度60 ℃，交聯(lián)時(shí)間? ? ? 40 min不變，以孔板入口壓力分別為0.12 MPa、0.16 MPa、0.20 MPa、0.24 MPa、0.28 MPa進(jìn)行強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，探討不同孔板入口壓力對殼聚糖納米微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響.

3）孔板出口壓力對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)采用單孔且孔徑為3 mm的孔板，保持孔板入口壓力0.28 MPa，交聯(lián)溫度60 ℃，交聯(lián)時(shí)間40 min不變，以孔板出口壓力分別為0 MPa、0.02 MPa、0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa 進(jìn)行強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，探討不同空化出口壓力對殼聚糖納米微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響.

4）交聯(lián)溫度對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的 影響

實(shí)驗(yàn)采用單孔且孔徑為3 mm的孔板，保持孔板入口壓力0.28 MPa，出口壓力0 MPa，交聯(lián)時(shí)間 40 min不變，以交聯(lián)溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃ 進(jìn)行強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，探討不同交聯(lián)溫度對殼聚糖納米微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響.

5）交聯(lián)時(shí)間對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的 影響

實(shí)驗(yàn)采用單孔且孔徑為3 mm的孔板，保持孔板入口壓力0.28 MPa，出口壓力0 MPa，交聯(lián)溫度60 ℃不變，以交聯(lián)時(shí)間分別為30 min、40 min、50 min、60 min 進(jìn)行強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，探討不同交聯(lián)時(shí)間對殼聚糖納米微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響.

上述每個(gè)因素在各個(gè)水平條件下，分別平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值.

1.2.3? ? 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取孔板入口壓力（A）、出口壓力（B）、交聯(lián)溫度（C）、交聯(lián)時(shí)間（D）這4個(gè)因素，以殼聚糖納米微球的平均粒徑為評價(jià)指標(biāo)，按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定制備微球的優(yōu)化工藝和配方.正交實(shí)驗(yàn)因素和水平見表2.

1.2.4? ? 殼聚糖納米微球的粒徑表征

取適量微球，將其分散于去離子水中，取1.0 mL懸浮液于專用比色皿中，采用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進(jìn)行測量，測定微球平均粒徑，每個(gè)樣品測3次，取平均值.

1.2.5? ? 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）表征

取干燥樣品1～2 mg，采用KBr壓片，將壓片后的樣品放入儀器進(jìn)行紅外光譜分析，以分析5-Fu殼聚糖微粒的主要官能團(tuán).測定條件：掃描次數(shù)64次，分辨率4 cm-1，掃描波數(shù)范圍4 000～500 cm-1.

1.2.6? ? 空化數(shù)的計(jì)算

空化數(shù)（[Cv]）是一個(gè)無量綱參數(shù)，通常用來反映空化強(qiáng)度.一般來說，當(dāng)空化數(shù)[<]1時(shí)，空化現(xiàn)象比較明顯，且空化數(shù)越小，空化強(qiáng)度越大[23].空化數(shù)計(jì)算公式為：

[Cv=2（P2-Pv）/ρV2]

式中：[P2]表示孔板下游的恢復(fù)壓強(qiáng)，Pa;[Pv]表示操作溫度下液體的飽和蒸氣壓，Pa;[ρ]表示液體的密度，kg/m3;[V]表示液體通過孔板的平均流速，m/s.

1.2.7? ? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行圖表繪制.

2? ? 結(jié)果與討論

2.1? ?單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1? ? 孔板結(jié)構(gòu)對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

孔板結(jié)構(gòu)對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響見表3.由表3可知，在孔板空化作用過程中，孔板結(jié)構(gòu)對所制備的微球粒徑以及空化數(shù)有著重要的影響.當(dāng)孔板的開孔數(shù)不同，比周長相同時(shí)，采用開孔率小的孔板，空化數(shù)更?。?.10），空化強(qiáng)度更大，所制備的微球平均粒徑更?。?92.6 nm）;當(dāng)孔板的開孔數(shù)不同，開孔率相同，采用比周長大的孔板，空化數(shù)更?。?.94），空化強(qiáng)度更大，所制備的微球平均粒徑更?。?41.3 nm）.這一結(jié)果說明空化強(qiáng)度對微球的粒度大小存在顯著影響，采用開孔率小、比周長大的孔板更有利于制備出粒徑小的殼聚糖微球.這主要是由于在管道流量相同的情況下，根據(jù)流體連續(xù)性方程可知：開孔率小時(shí)，流經(jīng)孔板孔口時(shí)的流速變大，空化數(shù)減小，空化強(qiáng)度增大，空化效果好[23-25];當(dāng)開孔率相同時(shí)，比周長大的孔板，由于其孔徑小，相同流量時(shí)通過孔板流速變大，小孔的射流會產(chǎn)生很強(qiáng)的剪切力、強(qiáng)大的沖擊波和微射流，從而加劇了空化泡的潰滅，使其空化強(qiáng)度得到提高，空化效果好[23-25]，因而所制備的微球粒度更小.因此，選擇單孔且孔徑為3.0 mm的孔板為宜.

2.1.2? ? 孔板入口壓力對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

孔板入口壓力對殼聚糖微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響如圖3所示.由圖3可知，隨著孔板入口壓力的增大，空化數(shù)以及殼聚糖納米微球的平均粒徑均呈下降趨勢.當(dāng)孔板入口壓力由0.12 MPa 增大至0.28 MPa時(shí)，空化數(shù)由0.44降低至0.10，這說明入口壓力增大，空化強(qiáng)度顯著增強(qiáng).當(dāng)孔板入口壓力由0.12 MPa 增大至0.20 MPa時(shí)，微球的平均粒徑由615.3 nm降低至391.9 nm，平均粒徑減小了36.3%;當(dāng)孔板入口壓力由0.20 MPa增大至? ? ? 0.28 MPa時(shí)，微球的平均粒徑由391.9 nm降低至292.6 nm，平均粒徑減小了25.3%.這一結(jié)果說明，當(dāng)孔板入口壓力較小時(shí)，增大入口壓力，空化強(qiáng)度升高，納米微球的粒徑減小更顯著.這是因?yàn)榭装迦肟趬毫υ龃?，液體流速加快，空化數(shù)降低，空化中心壓降增大，空化強(qiáng)度增大，從而形成更多空化泡[26];且在空化過程中空化泡膨脹的幅度變大，潰滅時(shí)產(chǎn)生更多能量[27]，孔板下游湍流加劇，空化強(qiáng)度增大，碰撞更劇烈，微觀混合效果增強(qiáng)，殼聚糖納米微球的平均粒徑減小.因此，選擇入口壓力0.28 MPa為宜.

2.1.3? ?空化出口壓力對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

空化出口壓力對殼聚糖微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響如圖4所示.由圖4可知，隨著空化出口壓力的增大，空化數(shù)以及殼聚糖納米微球的平均粒徑增大.當(dāng)孔板出口壓力由0 MPa增大至0.08 MPa時(shí)，空化數(shù)由0.10增大至0.55，這說明出口壓力增大，空化強(qiáng)度減弱.當(dāng)孔板出口壓力由0 MPa 增大至 0.08 MPa時(shí)，殼聚糖納米微球的平均粒徑由? ? ? 292.6 nm增大至446.1 nm，平均粒徑增大了52.5%;當(dāng)孔板入口壓力由0.04 MPa增大至0.08 MPa時(shí)，殼聚糖納米微球的平均粒徑由446.1 nm增大至? ? ? 871.5 nm，平均粒徑增大了95.4%.這一結(jié)果表明，當(dāng)孔板出口壓力達(dá)到0.04 MPa后，繼續(xù)增大出口壓力，微球粒徑增加更加顯著.這主要是由于隨著出口壓力的增大，液體流速降低，空化數(shù)增大，空化強(qiáng)度減弱，微觀混合效果減弱，殼聚糖微球的平均粒徑增大.因此，選擇出口壓力0 MPa為宜.

2.1.4? 交聯(lián)溫度對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

交聯(lián)溫度對殼聚糖微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響如圖5所示.由圖5可知，隨著交聯(lián)溫度的增大，空化數(shù)以及殼聚糖納米微球的平均粒徑減小.當(dāng)交聯(lián)溫度由30 ℃增大至50 ℃時(shí)，殼聚糖納米微球的平均粒徑由493.9 nm減小至321.9 nm，平均粒徑減小了34.8%;當(dāng)交聯(lián)溫度由50 ℃增加至60 ℃，殼聚糖納米微球的平均粒徑由321.9 nm減小至292.6 nm， 平均粒徑減小了9.1%.這一結(jié)果表明，當(dāng)交聯(lián)溫度較小時(shí)，增大溫度，殼聚糖納米微球的平均粒徑減小更加顯著.當(dāng)交聯(lián)溫度由30 ℃增大至60 ℃時(shí)，空化數(shù)由0.44降低至0.10.這主要是由于溫度較低不利于交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)升高溫度至60 ℃時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)加快，液體的飽和蒸氣壓增大，空化數(shù)減小至0.10，空化強(qiáng)度增大，微觀混合更加均勻，殼聚糖納米微球的平均粒徑減小.當(dāng)交聯(lián)溫度超過60 ℃時(shí)，京尼平不穩(wěn)定，易分解[28].因此，選擇交聯(lián)溫度60 ℃為宜.

2.1.5? ?交聯(lián)時(shí)間對殼聚糖微球粒徑以及空化數(shù)的影響

交聯(lián)時(shí)間對殼聚糖微球平均粒徑以及空化數(shù)的影響如圖6所示.由圖6可知，隨著交聯(lián)時(shí)間的增加，微球的平均粒徑先減小，之后基本穩(wěn)定，空化數(shù)無明顯變化.當(dāng)交聯(lián)時(shí)間由30 min增加至40 min時(shí)，殼聚糖納米微球的平均粒徑由321.7 nm減小至292.6 nm，平均粒徑減小了9%;當(dāng)交聯(lián)時(shí)間由? ?40 min增加至60 min ，殼聚糖納米微球的平均粒徑由292.6 nm減小至291.0 nm， 平均粒徑幾乎不變.這一結(jié)果表明，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間小于40 min時(shí)，殼聚糖納米微球的粒徑減小顯著，繼續(xù)增加交聯(lián)時(shí)間，殼聚糖納米微球的變化趨勢不明顯.這可能是由于當(dāng)負(fù)載京尼平的W/O乳液剛加入負(fù)載殼聚糖的W/O乳液時(shí)，二者在初始水力空化下混合不夠均勻，且負(fù)載京尼平的W/O乳液的初始粒度較大，易造成局部京尼平的濃度相對過高，因而初始交聯(lián)產(chǎn)生的微球粒度較大[29].但隨著交聯(lián)時(shí)間的延長，二者在水力空化的剪切作用下逐漸混合均勻，且2種乳液的粒度更小直至不變，因此，交聯(lián)后得到的粒度逐漸降低，之后幾乎不發(fā)生變化[29].當(dāng)交聯(lián)時(shí)間超過40 min，微球的平均粒徑幾乎不變，因此，選擇交聯(lián)時(shí)間40 min為宜.

2.2? ?孔板空化制備微球的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4.由表4的極差（R）分析結(jié)果可知，出口壓力是影響微球平均粒徑大小的關(guān)鍵因素.各因素對平均粒徑影響的大小順序依次為：出口壓力（B）>交聯(lián)溫度（C）>入口壓力（A）>交聯(lián)時(shí)間（D）.由表4的各因素水平和均值（k）可知，以平均粒徑為指標(biāo)優(yōu)化得到殼聚糖納米微球制備的最優(yōu)工藝條件為A3B1C3D2，即孔板入口壓力0.28 MPa、出口壓力0 MPa、交聯(lián)溫度60 ℃、交聯(lián)時(shí)間40 min.

2.3? ?孔板空化與傳統(tǒng)工藝的制備效果比較

為了考察孔板空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備殼聚糖微球的效果，將基于幾何孔板的水力空化制備的微球粒度與文獻(xiàn)報(bào)道中基于傳統(tǒng)攪拌工藝制備的微球粒度進(jìn)行比較，結(jié)果見表5.由表5可知，采用單孔且孔徑為3 mm的孔板，在入口壓力0.28 MPa、出口壓力0 MPa、交聯(lián)溫度60 ℃、交聯(lián)時(shí)間? ? ? ?40 min的條件下，孔板空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備的殼聚糖納米微球平均粒徑為292.6 nm.羅美等[30]在攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min下，以京尼平為交聯(lián)劑，所制備得到的微球粒徑為34.60 μm;葉漫文等[31]在攪拌轉(zhuǎn)速850 r/min下，以京尼平為交聯(lián)劑，所制備得到的殼聚糖微球粒徑為7.84 μm;Li等[32]以甲醛為交聯(lián)劑，采用機(jī)械攪拌制備得到的殼聚糖微球粒徑為43.00 μm;Nayak等[10]在攪拌轉(zhuǎn)速1 000～1 500 r/min下，以戊二醛為交聯(lián)劑，所制備的微球粒徑為60.00 μm～210.00 μm.這說明孔板空化可強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備出納米級的殼聚糖微球，其粒徑明顯小于傳統(tǒng)攪拌工藝下所得微球的粒度.

2.4? ?紅外光譜分析

圖7為5-Fu、殼聚糖、殼聚糖微球和5-Fu殼聚糖微球在波數(shù)為4 000～5 00 cm-1的紅外光譜圖.由圖7可見，5-Fu的特征吸收峰為1 660.6 cm-1（C═O和? ? C═C伸縮振動吸收峰），1 423.4 cm-1（—CF═CH—中的C—H的面內(nèi)彎曲振動吸收峰），1 242.1 cm-1? ?（C—N伸縮振動吸收峰），875.6 cm-1（—CF═CH—中的C—H的面外彎曲振動吸收峰），813.9 cm-1和746.4 cm-1（—CF═CH—中的C—H的面外變形振動吸收峰）.殼聚糖譜圖中，3 429.1 cm-1處為—OH和? ?N—H伸縮振動重疊形成的強(qiáng)吸收峰， 2 921.9 cm-1和2 862.1 cm-1處為—C—H的伸縮振動吸收峰，? ? ? ? 1 647.1 cm-1和1 589.2 cm-1處2個(gè)特征峰分別為C═O伸縮振動（酰胺Ⅰ峰）及C—N—H的面內(nèi)彎曲振動（酰胺Ⅱ峰）.在殼聚糖與殼聚糖微球譜圖中，—OH和? ? ? N—H的重疊吸收峰產(chǎn)生了紅移，這可能是由于殼聚糖與京尼平發(fā)生了親核反應(yīng)，在殼聚糖中增加了Schiff堿π鍵，—OH與π電子云產(chǎn)生微弱締合，使 —OH伸縮振動峰紅移，說明殼聚糖與京尼平通過席夫堿反應(yīng)與親核取代反應(yīng)成功交聯(lián).5-Fu殼聚糖微球譜圖中，1 448.4 cm-1處出現(xiàn)了5-Fu中的—CF═CH—中的C—H的面內(nèi)彎曲振動吸收峰，1 249.8 cm-1處出現(xiàn)了5-Fu中的C—N伸縮振動紅移吸收峰， 887.2 cm-1處出現(xiàn)了5-Fu中的—CF═CH—中的? ? ? ? C—H的面外彎曲振動紅移的吸收峰，808.1 cm-1和756.0 cm-1處出現(xiàn)了5-Fu中的—CF═CH—中的C—H的面外變形振動吸收峰，且在2 927.7 cm-1處，? ? ? ? —C—H的伸縮振動吸收峰增強(qiáng).以上結(jié)果說明，在孔板空化作用下，模型藥物5-Fu成功負(fù)載于殼聚糖微球中，且其結(jié)構(gòu)未被破壞.

同時(shí)，在液體水力空化誘導(dǎo)含水（H2O）體系產(chǎn)生的空化效應(yīng)如：熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和自由基? ? ?（·OH）效應(yīng)等的共同作用下，一些生物大分子可發(fā)生降解作用[26，35]，或其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[36-38];苯系物在空化作用下亦會被氧化降解[39-40].例如，Huang等[35]發(fā)現(xiàn)水力空化效應(yīng)主要通過斷裂殼聚糖的? ? ? β-（1，4）糖苷鍵而促使其發(fā)生降解，但其結(jié)構(gòu)單元和基本官能團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生破壞;任仙娥等[37]發(fā)現(xiàn)渦流空化處理可改變大豆分離蛋白質(zhì)溶解性，主要是由于在空化作用下，大豆蛋白的疏水相互作用被破壞，且分子中有離子鍵生成以及分子中的二硫鍵發(fā)生斷裂;解長遠(yuǎn)等[38]也得到了相似的結(jié)論;王永杰等[41]發(fā)現(xiàn)文丘里管與孔板組合空化器可降解苯酚廢水，主要是由于空化產(chǎn)生的·OH與苯酚上的苯環(huán)發(fā)生親電加成反應(yīng)，生成中間體鄰苯二酚、對苯二酚，二者中的苯環(huán)繼續(xù)被氧化，其共軛結(jié)構(gòu)被打開，生成順丁烯二酸和乙酸[42].然而，? ? 5-Fu既不屬于生物大分子，也不具備苯環(huán)結(jié)構(gòu)，這與上述物質(zhì)存在明顯差異，這進(jìn)一步說明其分子結(jié)構(gòu)難以被水力空化作用破壞.但是，水力空化用于制備載藥殼聚糖微球時(shí)，在模型藥物的使用上具有選擇性，不宜選擇生物大分子類或苯系物類等結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜精細(xì)的藥物.

3? ? 結(jié)論

本研究采用基于幾何孔板的水力空化強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備殼聚糖納米微球，考察了孔板結(jié)構(gòu)、入口壓力、出口壓力、交聯(lián)溫度、交聯(lián)時(shí)間對空化數(shù)及其對納米微球平均粒徑的影響，并與傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了比較，所得結(jié)論如下：

空化強(qiáng)度對微球的粒度大小存在顯著影響;宜選用開孔率（βo）小，比周長（α）大的孔板;在孔板空化強(qiáng)化制備微球的過程中，出口壓力是影響微球粒徑大小的關(guān)鍵性因素;采用單孔且孔徑為? ? ? ?3.0 mm的孔板，在入口壓力0.28 MPa、出口壓力 0 MPa、交聯(lián)溫度60 ℃、交聯(lián)時(shí)間40 min的優(yōu)化工藝條件下，所制備得到的納米微球平均粒徑最小為292.6 nm;孔板空化條件下制備的微球粒度明顯小于傳統(tǒng)工藝制備的微球粒度. FT-IR結(jié)果表明，在水力空化作用下，5-Fu結(jié)構(gòu)未被破壞，且成功負(fù)載于殼聚糖納米微球中.以上研究結(jié)果表明，孔板空化適用于強(qiáng)化乳化交聯(lián)過程制備粒徑更細(xì)的殼聚糖納米微球.后續(xù)可對載藥殼聚糖納米微球的包封率、載藥率及釋藥規(guī)律展開進(jìn)一步研究.

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Intensified preparation of genipin-crosslinked chitosan nanospheres by orifice plate-based cavitation

XU Yun1，2，3，4， ZHANG Kunming*1，2，3，4， HUANG Yongchun1，2，3，4， LU Lijin1，2，3，4，DUAN Chao1，2，3，4， YU Huiqun1，2，3，4

（1. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources， （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China; 3. Guangxi Liuzhou Luosifen Engineering Technology Research Center （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China; 4.Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Centre for Sugarcane Industry， Nanning 530004， China）

Abstract： Orifice plate-based cavitation was used to intensify the emulsion crosslinking process to prepare chitosan （CS） nanospheres with 5-fluorouracil （5-Fu） as the model drug and genipin as crosslinking agent. The effects of orifice plate structure， inlet pressure， outlet pressure， crosslinking temperature and crosslinking time on cavitation number and mean particle size of CS nanospheres were investigated， and it was compared with conventional process. The results showed that cavitation intensity had a significant effect on the particle size of CS nanoparticles; the orifice plate with small opening ratio （β0） and large proportion circumference （α） was more beneficial for the preparation of ultrafine CS nanospheres; under the optimized process parameters of orifice plate with single hole of 3.0 mm， inlet pressure at 0.28 MPa， outlet pressure at 0 MPa， crosslinking temperature at 60 ℃， and crosslinking time at 40 min， the mean particle size of CS nanospheres was 292.6 nm; the particle size of CS nanospheres prepared by orifice plate-based cavitation was obviously smaller than that prepared by traditional process; infrared spectroscopy （FTIR） results showed that 5-Fu was successfully loaded into the CS nanospheres， and the structure of 5-Fu was not destroyed by orifice plate-based cavitation， which demonstrated that the orifice plate-based cavitation was suitable to intensify the emulsion crosslinking process to prepare drug-loaded CS nanospheres.

Key words： orifice plate-based cavitation; genipin; chitosan nanospheres; particle size; cavitation number; process parameters; othogonal test design