室內外培養(yǎng)對大溪地等鞭金藻細胞生長和色素含量的影響

呂布 ，葉丙聰 ，周建聰 ，李曦 ，王愛民 ，顧志峰 *，鄭興

（1.海南大學海洋學院，海南 ?？?570228；2.海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 ?？?570228）

大溪地等鞭金藻（Isochrysis galbana）是一種微小的金黃色金藻，其個體較?。ㄖ睆? μm），且無細胞壁，其營養(yǎng)物質豐富，富含多種不飽和脂肪酸和蛋白質，并具有易被消化吸收等特點[1]。大溪地等鞭金藻作為海產雙殼動物幼蟲的理想餌料，已廣泛應用于大珠母貝、扇貝、牡蠣和泥蚶等養(yǎng)殖，并被認為是人工育苗的優(yōu)質餌料[2-5]。在細巧華哲水蚤人工規(guī)模培養(yǎng)中，大溪地等鞭金藻也是其較優(yōu)餌料[6]。

大溪地等鞭金藻是微藻的一種，微藻中光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，其具有吸收和傳遞光能的功能[7]，是細胞光合作用的主要參與者。光合色素的含量對微藻的碳、氮代謝十分重要，可直接影響微藻的生長發(fā)育及產量[8]。在微藻的培養(yǎng)中，培養(yǎng)條件影響著微藻的生長速度、高效擴繁及活性物質的積累[9]。養(yǎng)殖戶在室內培養(yǎng)微藻的過程中，由于空間有限，影響其生長和繁育，同時室內培養(yǎng)需要光照，在此過程中消耗大量的電力，因此，調整培養(yǎng)模式和條件對微藻的培育十分重要[10]。目前，室外條件下規(guī)模培養(yǎng)微藻具有極大的應用價值[11]。掌握微藻的生長規(guī)律及最優(yōu)培養(yǎng)條件，對于提升微藻生長速度和擴大產量有較大意義[12]。現將大溪地等鞭金藻于室內和室外條件下開展培養(yǎng)試驗，對比分析其生長規(guī)律、光合色素含量、水分含量及灰分含量的差異，以探究最適培養(yǎng)條件，為大溪地等鞭金藻的開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大溪地等鞭金藻取自海南大學海洋學院保種室。試驗前對藻種進行純化擴培，提取快速生長期的藻液。使用過濾并滅菌的自然海水及“寧波3#”微藻培養(yǎng)液，海水的鹽度為30，培養(yǎng)基成分為ρ（NaNO3）=100 mg/L，ρ（NaH2PO4）=10 mg/L，ρ（FeSO4）=2.5 mg/L，ρ（MnSO4）=2.5 mg/L，ρ（EDTA－Na）=10 mg/L，ρ（維生素 B1）=6×10-3mg/L，ρ（維生素B12）=5×10-7mg/L[4]。

1.2 試驗方法

包括室內和室外兩種培養(yǎng)條件。其中室內試驗培養(yǎng)條件：溫度為（25±1）℃，光照強度為（119±1）μmol/（m2·s），光暗周期為12 h∶12 h；室外試驗培養(yǎng)條件：溫度為（22±3）℃，光照強度為（442±94）μmol/（m2·s），光暗周期為12 h∶12 h。每種條件設置3 個平行培養(yǎng)組，于5 L 三角錐形瓶中進行培養(yǎng)，藻細胞接種密度為1.00×103cells/L，培養(yǎng)過程中不充氣，每天搖動幾次。以藻種與培養(yǎng)液充分混合后為時間起點，每隔24 h 取樣1 次，取樣前將培養(yǎng)瓶中的藻液搖勻，分別取3 個樣品檢測藻類密度、干重、濕重、灰分和色素含量。

1.3 測定項目及方法

（1）藻細胞數目。采用血球計數板法測定[13]。

（2）藻細胞干重。烘干并預先稱量Whatman GF/C 膜的質量，將20 mL 大溪地等鞭金藻的藻液于該膜過濾，經過沖洗除營養(yǎng)鹽后，放入105 ℃烘箱中烘72 h 后稱取質量，以前后兩次質量差不超過2 mg為準，通過烘干前后質量的差值來計算干重[14]。

（3）水分含量。培養(yǎng)結束后，將20 mL 藻液通過Whatman GF/C 膜抽濾，于105 ℃烘箱中干燥至恒重，稱取質量，直至前后兩次質量差不超過2 mg，干燥后的質量記為m1。同時，取20 mL 藻液4 000 r/min，離心10 min，收集藻細胞，樣品的質量記為m2[14]。

（4）灰分含量。將Whatman GF/C 膜放在鋁箔杯中，置于105 ℃的烘箱中，烘干至恒重，記為M2；將20 mL 藻液通過Whatman GF/C 膜抽濾后，放入鋁箔杯于500 ℃的馬弗爐中烘干至恒重，記為M3。鋁箔杯的質量記為M1[15]。

（5）葉綠素及類胡蘿卜素的測定。利用丙酮萃取法提取微藻的葉綠素[16-17]，將藻液于Whatman GF/C 膜上抽濾，離心，用分光光度計（島津UV-1700）分別測定在波長為 630，647，664，750 和 470 nm 處溶液的吸光度值并記錄，減去波長750 nm 下測得的吸光度值，得到校正后的各波長對應的吸光光度值，并計算各色素的濃度。

1.4 數據分析

試驗數據均表示為平均值±標準差（Mean±SD），采用Microsoft Excel 2016 對數據處理，用DPS 14.5軟件進行單因素方差分析，若有顯著差異，再進行二因素方差分析，以P<0.05 為差異顯著。

2 結果和分析

2.1 兩種培養(yǎng)條件對密度的影響

試驗結果顯示，在室內培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)1~7 d，藻細胞密度隨培養(yǎng)時間的延長而升高；在室外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)1~10 d，藻細胞密度隨培養(yǎng)時間的延長而升高；達到峰值后，兩種培養(yǎng)條件下的藻細胞密度均隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低并趨于平穩(wěn)。在室外培養(yǎng)條件下，藻細胞密度在第10 d 最高，為4.95×103cells/L，在室內培養(yǎng)條件下，藻類密度在第7 d 最高，為3.48×103cells/L（圖1）。第8 d 開始，兩種培養(yǎng)條件下藻類細胞密度開始出現顯著差異（P<0.05），二因素方差分析結果顯示，室外培養(yǎng)條件下藻細胞密度顯著（P<0.05）高于室內培養(yǎng)條件下。

圖1 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻密度的影響

2.2 兩種培養(yǎng)條件對色素含量的影響

試驗結果顯示，在室內培養(yǎng)條件下，葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素經過緩慢增長后快速達到最高濃度，然后逐漸降低：葉綠素a 在第7 d 達到最大質量濃度，為0.44 mg/L；葉綠素c 在第2 d 達到最大質量濃度，為 0.26 mg/L（圖2）；類胡蘿卜素在第7 d 達到最大質量濃度，為5.91 mg/L（圖3）。在室外培養(yǎng)條件下，葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素的變化趨勢與室內條件類似：葉綠素a 在第11 d 達到最大質量濃度，為 0.78 mg/L；葉綠素c 在第11 d 達到最大質量濃度，為0.28 mg/L；類胡蘿卜素在第11 d達到最大質量濃度，為14.15 mg/L。

圖2 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻葉綠素的影響

圖3 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻類胡蘿卜素的影響

兩種培養(yǎng)條件下，葉綠素a 質量濃度從第4 d開始出現極顯著差異（P<0.01），葉綠素c 質量濃度從第11 d 起開始出現極顯著差異（P<0.01），類胡蘿卜素質量濃度從第3 d 開始出現極顯著差異（P<0.01）。二因素方差分析表明，不同培養(yǎng)條件對于葉綠素a 具有極顯著的影響（P<0.01），而培養(yǎng)時間無顯著影響（P>0.05）；不同培養(yǎng)條件和時間對葉綠素c 均具有顯著的影響（P<0.05）；不同培養(yǎng)條件對于類胡蘿卜素具有極顯著的影響（P<0.01），而培養(yǎng)時間無顯著影響（P>0.05）。在室外培養(yǎng)條件下，葉綠素a 和類胡蘿卜素質量濃度均顯著（P<0.05）高于室內培養(yǎng)條件。

2.3 兩種培養(yǎng)條件對水分和灰分含量的影響

試驗結果顯示，大溪地等鞭金藻水分含量和灰分含量的變化趨勢相似，其中在室內培養(yǎng)條件下，大溪地等鞭金藻水分含量最大值為95.11%，灰分含量最大值為70.57%；在室外培養(yǎng)條件下，水分含量最大值為95.53%，灰分含量最大值為82.57%；在兩種培養(yǎng)條件下灰分含量具有顯著性差異（P<0.05）（圖4 和圖5）。二因素方差分析結果顯示，培養(yǎng)時間對大溪地等鞭金藻的水分含量和灰分含量具有極顯著的影響（P<0.01），不同培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻的水分含量無顯著影響（P>0.05），對于灰分含量有顯著的影響（P<0.05）。

圖4 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻水分含量的影響

圖5 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻灰分含量的影響

2.4 兩種培養(yǎng)條件對培養(yǎng)基pH 值的影響

試驗結果顯示，在室內培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基的pH 值為7.1~8.7，在室外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基的pH值為9~9.6，其中在室外條件下培養(yǎng)基pH 值升高的幅度較大（圖6）。從第3 d 開始，在兩種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基pH 值開始出現顯著差異（P<0.05）。二因素方差分析結果顯示，培養(yǎng)時間對培養(yǎng)基pH 值無顯著影響（P>0.05），培養(yǎng)條件對培養(yǎng)基pH 值有極顯著的影響（P<0.01）。

圖6 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻培養(yǎng)基pH 值的影響

3 討論

研究顯示，與室內嚴格的培養(yǎng)條件相比，室外培養(yǎng)條件的變化大，具有不確定性，室外培養(yǎng)條件對微藻細胞的適應能力提出了更高的要求。由于室內外的環(huán)境不同，導致培養(yǎng)條件和污染程度各不相同，藻細胞在生長方面也表現出了不同的規(guī)律。在室外培養(yǎng)條件下，藻細胞的生長環(huán)境較室內惡劣，盡管在室外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基的pH 值變化較小，但是與室內條件下存在極顯著差異（P<0.01），且室外溫度的變化也較明顯。室外培養(yǎng)條件下藻細胞密度顯著（P<0.05）高于室內培養(yǎng)條件。柳敏海等[4]研究顯示，大溪地金藻適宜生長溫度為10~35 ℃，其適合作為在高溫季節(jié)的育苗餌料。在室外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)中的部分藻細胞密度有所下降，可能與當天降雨溫度和光照變化相關。本研究中，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中積累的有機成分增多，藻液更有利于雜藻和細菌的生長，其種類和數量增加，遠超過了接種初期，這可能也是第10 d 以后藻細胞密度開始下降的重要原因。戴俊彪等[18]研究指出，過強的光照也可能是室外培養(yǎng)條件下球等鞭金藻生長緩慢的原因，當光照強度為（442±94）μmol/（m2·s）時，大溪地等鞭金藻生長得更好，其密度遠高于球等鞭金藻，相較而言，大溪地等鞭金藻適合作為高溫季節(jié)的戶外餌料。目前，大溪地等鞭金藻在室外條件下進行培養(yǎng)的研究較少，本研究中其對室外培養(yǎng)條件表現出較強的適應性，生長和繁殖速度較室內培養(yǎng)條件下快，因此認為大溪地等鞭金藻有一定承污能力，經進一步培養(yǎng)優(yōu)化后，大溪地等鞭金藻的大規(guī)模室外培養(yǎng)具有一定的可行性。

大溪地等鞭金藻屬于光合自養(yǎng)型單胞藻，光照是其生長的關鍵因素。一般而言，細胞光合速率決定了藻類生長速度，而光合速率又取決于光合色素的含量，因此光合色素含量變化能反映大溪地等鞭金藻生長發(fā)育情況[19]。研究中，在室外培養(yǎng)條件下，大溪地等鞭金藻葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素的最大質量濃度分別為0.78，0.26 和14.15 mg/L，其葉綠素a、葉綠素c 質量濃度遠低于湛江等鞭金藻，類胡蘿卜素質量濃度則更高[20]。出現該結果一方面可能是因為大溪地等鞭金藻葉綠素a 含量較低時，其將吸收的光能主要用于藻細胞數量的增加、生物質和類胡蘿卜素的積累以及必須組分的合成，光合色素可滿足光能的吸收，因此不需要進行色素的累積[21]；另一方面可能是因為室內光照強度比室外低，此外試驗采用搖瓶不充氣的方式，也可能因為曝氣不充分，使大溪地等鞭金藻的空間位置在較長時間內沒有充分置換，進而降低了光能的利用，今后在擴大培養(yǎng)中可通過補充CO2進行改良。在室內培養(yǎng)條件下大溪地等鞭金藻灰分含量顯著（P<0.05）低于室外條件下，該結果表明，室外培養(yǎng)條件更利于大溪地等鞭金藻有機物的積累。

4 結論

研究認為，大溪地等鞭金藻具有耐高溫和耐強光的特性，適宜在室外條件下培養(yǎng)，因此，該藻作為優(yōu)質餌料生物在室外規(guī)?；囵B(yǎng)方面具有一定的可行性。此外室外培養(yǎng)可減少成本投入，提高效益，具有廣闊的應用前景。pH 值、溫度和光照作為影響大溪地等鞭金藻的3 個重要環(huán)境因子，其中光照在很大程度上影響著藻細胞的生長。后期可進一步開展光照強度對藻細胞生化成分的影響研究，進一步推動大溪地等鞭金藻的室外規(guī)?；B(yǎng)殖，更好地為水生動物養(yǎng)殖提供優(yōu)質餌料。