基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)探討茵陳蒿湯調(diào)節(jié)阻塞性黃疸氧化應(yīng)激的作用機(jī)制

陳帥，劉軍艦，尚海濤，張井虹，李忠廉

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰第二外科，天津300100）

阻塞性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是指由膽道內(nèi)或膽道鄰近部位的良、惡性病變阻礙膽汁經(jīng)由膽道流入十二指腸引發(fā)膽道內(nèi)壓力增高，膽汁由肝細(xì)胞和毛細(xì)膽管逆流入血竇、竇周，使血中結(jié)合膽紅素水平升高引起的黃疸[1]。阻塞性黃疸可以引起機(jī)體發(fā)生炎癥、內(nèi)毒素血癥、肝臟血流動(dòng)力學(xué)改變、氧自由基增多等，從而造成肝損傷[2-3]。目前利用外科手段積極處理病因是西醫(yī)治療的首要方法，但中藥方劑對(duì)保守治療、術(shù)前減黃及解除梗阻后加快黃疸消退、改善肝功能有較大作用[4]。茵陳蒿湯由茵陳、大黃、梔子三味藥組成，是治療濕熱黃疸的常用方。氧化應(yīng)激是肝損傷病理過(guò)程中的一個(gè)重要因素，眾多研究證實(shí)茵陳蒿湯可以改善OJ引起的肝損傷，但對(duì)其作用機(jī)制缺乏系統(tǒng)的研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，這與復(fù)方中藥多成分、多途徑和多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸[5]。

1 材料與方法

1.1 茵陳蒿湯的有效成分及靶點(diǎn)的收集與篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索茵陳蒿湯中藥物（茵陳、大黃、梔子）的化學(xué)成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到茵陳蒿湯的有效化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取 通過(guò)Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“obstructive jaundice”，得到OJ的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 茵陳蒿湯和OJ的靶點(diǎn)交集 運(yùn)用Excel中VLOOKUP函數(shù)以及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)茵陳蒿湯中化學(xué)成分的靶點(diǎn)蛋白的基因名稱進(jìn)一步規(guī)范。利用R4.0.2軟件將茵陳蒿湯的作用靶點(diǎn)與OJ的靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，獲得茵陳蒿湯和OJ的交集靶點(diǎn)，并繪制Venny圖。并通過(guò)Cytoscape軟件，對(duì)茵陳蒿湯中有效成分和交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觥?/p>

1.4 交集靶點(diǎn)蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將蛋白種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，去除孤立的靶點(diǎn)蛋白，其余參數(shù)均保持默認(rèn)，獲得茵陳蒿湯與OJ交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治觥?/p>

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析 將Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入R軟件，利用R軟件對(duì)茵陳蒿湯與OJ的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將其結(jié)果繪制成柱狀圖與氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)出茵陳蒿湯主要成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式，利用Autodock Tools4.2.6軟件調(diào)整電荷、判定配體的root、選擇配體可扭轉(zhuǎn)的鍵，并保存為pdbqt格式。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得eNOS和iNOS的蛋白結(jié)構(gòu)，通過(guò)PyMol2.4.1軟件去除水分子及原配體，然后利用Autodock Tools給蛋白加氫、計(jì)算電荷、添加原子類型，并保存為pdbqt格式。再通過(guò)Autodock Tools獲得活性位點(diǎn)中心及盒子大小等對(duì)接信息，默認(rèn)設(shè)置為energy_range=3，exhaustiveness=100。最后運(yùn)用Autodock-vina1.1.2執(zhí)行分子對(duì)接計(jì)算，通過(guò)PyMol軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果可視化，建立分子對(duì)接模式圖。

1.7 免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 藥材、試劑 依據(jù)《傷寒論》中茵陳蒿湯劑量組成折合：茵陳180 g，梔子150 g，大黃60 g，共計(jì)390 g中藥購(gòu)于天津市南開(kāi)醫(yī)院中藥制劑室，取2次煎煮液濃縮至390 mL，每mL含生藥量1 g。

免疫組化試劑：4%多聚甲醛、多聚賴氨酸、抗原修復(fù)液、山羊血清封閉液、一抗：NOS3（A-9）:sc-376751，NOS2（C-11）:sc-7271（購(gòu)自SANTA CRUZ生物公司）；二抗：IgG；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB顯色試劑盒；蘇木素等。

1.7.2 動(dòng)物模型制備及分組給藥 成年Sprauge-Dawley（SD）大鼠36只，體重200～230 g，雄性，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK京2014-0004；動(dòng)物倫理委員會(huì)通過(guò)編號(hào)：NKYY-DWLL-2019-081）。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、茵陳蒿湯組（C組），每組12只。B組和C組于大鼠膽總管中上1/3行雙重結(jié)扎，手術(shù)3 d后觀察大鼠小便顏色變黃即說(shuō)明OJ模型建立成功。A組游離上段膽總管后關(guān)腹。大鼠自建模后第3天起C組每日給予茵陳蒿湯劑3.6 mL/kg（相當(dāng)于生藥1 g/mL）灌胃，A組和B組每日給予等量生理鹽水灌胃。于術(shù)后10 d處死大鼠，并留取肝組織進(jìn)行IHC檢測(cè)。

1.7.3 免疫組化 取A組、B組、C組大鼠肝組織，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗，取少量組織塊；用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，多級(jí)脫水、包埋成石蠟組織塊，按5μm切片，附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過(guò)夜；將切片經(jīng)二甲苯及多級(jí)乙醇脫蠟；放入抗原修復(fù)液、正常山羊血清封閉液，進(jìn)行eNOS及iNOS免疫組化，最后加入DAB試劑和蘇木素染色，顯微鏡下觀察，進(jìn)行400×的顯微照相，選擇有意義的組織相進(jìn)一步分析。

1.7.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS26.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，且符合方差齊性就采用LSD檢驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s及柱狀圖表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茵陳蒿湯有效成分篩選 通過(guò)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，獲得44個(gè)有效成分。茵陳、大黃、梔子分別篩選到13、16、15種有效成分（表1），其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）為茵陳、大黃、梔子三者的共有成分，槲皮素（quercetin）為茵陳和梔子的共有成分。

表1 茵陳蒿湯主要有效成分及相關(guān)參數(shù)Tab 1 Main effectivecomponentsand related parametersof Yinchenhao Decoction

2.2 茵陳蒿湯和OJ的靶點(diǎn)交集分析 將茵陳蒿湯中41個(gè)化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，運(yùn)用Excel中VLOOKUP函數(shù)以及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)剔除重復(fù)項(xiàng)并規(guī)范基因名稱，得到29個(gè)化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)的177個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索OJ相關(guān)靶點(diǎn)，共得到2 183個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將茵陳蒿湯的作用靶點(diǎn)與OJ的靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，得到123個(gè)交集靶點(diǎn)基因，如圖1。將茵陳蒿湯化學(xué)成分和交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，篩選出前5個(gè)主要化合成分，見(jiàn)表2。

表2 前5個(gè)與交集靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的主要化合物Tab 2 The first five main compounds corresponding to the intersection targets

圖1 茵陳蒿湯和OJ的交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venny diagram of intersection target of Yinchenhao Decoction and OJ

2.3 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蛋白互作信息（其中有1個(gè)蛋白未參與互作）。將蛋白互作信息導(dǎo)入到Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治觯玫揭痍愝餃蚈J交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)，該網(wǎng)絡(luò)由122個(gè)節(jié)點(diǎn)組成，其中節(jié)點(diǎn)的大小與Degree成正比，Degree越大顏色越紅，表示靶點(diǎn)作用途徑更多。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree繪制出前15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的條形圖（圖3）。

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析 為進(jìn)一步探討茵陳蒿湯作用于OJ的機(jī)制，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。根據(jù)P＜0.05，確定了135個(gè)GO條目和162個(gè)KEGG通路，分別將靶點(diǎn)富集個(gè)數(shù)前20的GO條目和KEGG通路繪制成條形圖（圖4）和氣泡圖（圖5），并利用Cytoscape軟件繪制主要通路-靶點(diǎn)-化合物的網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。通過(guò)對(duì)圖6分析發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)蛋白NOS3和NOS2參與氧化應(yīng)激過(guò)程中的多條通路，并與茵陳蒿湯中多個(gè)化合物有關(guān)（圖7）。

圖4 茵陳蒿湯治療OJ作用靶點(diǎn)的GO富集條形圖Fig 4 Bar graph of GO enrichment of targetsof Yinchenhao Decoction in thetreatment of OJ

圖5 茵陳蒿湯治療OJ作用靶點(diǎn)的KEGG富集氣泡圖Fig 5 Bubblechart of KEGG enrichment of targetsof Yinchenhao Decoction in thetreatment of OJ

圖6 主要通路-靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)Fig 6 Main pathway-target-compound network

圖7 NOS2、NOS3相關(guān)化合物及通路網(wǎng)絡(luò)Fig 7 Network of compoundsand pathwaysrelated to NOS2 and NOS3

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 通過(guò)Autodock_vina軟件將目的蛋白NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）分別與槲皮素、山奈酚、異鼠李素進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果示eNOS和iNOS與槲皮素、山奈酚、異鼠李素的最低結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol（表3），且分子對(duì)接模式圖中這些化學(xué)成分與eNOS和iNOS蛋白上多個(gè)氨基酸殘基相結(jié)合（圖8）。

圖8 eNOS和iNOS與主要化合物的分子對(duì)接模式圖Fig 8 Molecular docking patternsof eNOSand iNOSwith major compounds

表3 eNOS和iNOS與主要化合物的最低結(jié)合能（kcal/mol）Tab 3 The lowest binding energies of eNOSand iNOSwith major compounds（kcal/mol）

2.6 茵陳蒿湯對(duì)大鼠肝組織中NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）蛋白表達(dá)的影響 IHC結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組肝組織中eNOS平均光密度值降低，而iNOS平均光密度值升高（P＜0.05）；與模型組相比，茵陳蒿湯組肝組織中eNOS平均光密度值升高，iNOS平均光密度值降低（P＜0.01），見(jiàn)圖9、10。

圖9 各組大鼠肝組織中eNOS和iNOS表達(dá)（免疫組化，400×）Fig 9 Expression of eNOSand iNOSin liver tissueof ratsin each group（IHC，400×）

圖10 各組大鼠肝組織中eNOS、iNOS蛋白平均光密度值比較（±s）Fig 10 Comparison of the AODof eNOSand iNOSproteinsin liver tissueof ratsin each group（±s）

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為黃疸發(fā)病有濕、熱、寒、血瘀、脾虛等多種不同的病機(jī)，其中以濕邪為主。辨證分型以濕熱蘊(yùn)結(jié)為常見(jiàn)，治療均以化濕邪、利小便為治療大法，對(duì)癥選用清熱利濕、溫中補(bǔ)虛、化瘀等治法[6]。茵陳蒿湯由茵陳、大黃、梔子三味藥組成，方中重用茵陳為君藥，以其善能清熱利濕退黃，為治黃疸之主藥。臣以梔子清熱降火，通利三焦，助茵陳引濕熱從小便而去。佐以大黃瀉熱逐瘀，通利大便，導(dǎo)瘀熱由大便而下。三藥合用，以利濕與泄熱相伍，使二便通利，前后分消，濕熱得行，瘀熱得下，則黃疸自退。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲得茵陳蒿湯的41種有效化學(xué)成分，經(jīng)過(guò)篩選規(guī)范，共收集到29個(gè)有效化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)的177個(gè)靶點(diǎn)，并對(duì)這些有效成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分析。槲皮素的作用靶點(diǎn)最多，它也是茵陳、梔子共有的化學(xué)成分；其次是山奈酚，以及異鼠李素、蘆薈大黃素、β-谷甾醇等。研究表明，槲皮素是一種黃酮類化合物，具有多重生物活性，如抗氧化、抗炎、減輕肝毒性、預(yù)防肝纖維化等作用[7-8]。山奈酚是一種黃酮類化合物，通過(guò)發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，在各種化學(xué)誘導(dǎo)的肝損傷模型中發(fā)揮保護(hù)作用[9]。另外，山奈酚可以降低谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，減輕肝細(xì)胞損傷和凋亡[10]。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用[11]。此外，現(xiàn)代藥理研究表明，茵陳蒿湯的茵陳色原酮、Artepillin A、蘆薈大黃素等成分具有促進(jìn)膽汁分泌和排泄的作用[11]。通過(guò)藥物與疾病靶點(diǎn)交集得到123個(gè)交集靶點(diǎn)。其中蛋白激酶B（Akt）1、TP53、白細(xì)胞介素（IL）-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）A、CASP3、腫瘤壞死因子（TNF）、Jun、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）8是關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與PI3K、EGFR等多個(gè)通路，在炎癥、細(xì)胞增殖、遷移和纖維形成的肝損傷過(guò)程中起著獨(dú)特的作用[13]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，可以激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在肝細(xì)胞凋亡、抗炎、氧化應(yīng)激中起著重要作用[14-15]。VEGFA是具有高度內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，在血管發(fā)生和形成過(guò)程中起著主要的調(diào)控作用。VEGF的表達(dá)可以促進(jìn)血管形成，在肝臟再生和肝損傷的修復(fù)中起著重要作用[16]。

通過(guò)對(duì)交集靶點(diǎn)的GO富集結(jié)果分析，預(yù)測(cè)茵陳蒿湯治療OJ可能涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信號(hào)受體激活劑活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、氧化還原酶活性等生物過(guò)程。通過(guò)KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯中多種成可以通過(guò)Hepatitis B、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、MAPK、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子、IL-17、肝細(xì)胞癌、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）等信號(hào)通路作用于OJ。MAPK是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過(guò)程。其中c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路是MAPK中重要的通路之一，Wang等[17]發(fā)現(xiàn)大黃酸誘導(dǎo)的活性氧簇（ROS）激活了JNK/Jun/caspase-3信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究證明，PI3K/Akt通路激活可以抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡，對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用[18]。HIF-1是低氧濃度或缺氧應(yīng)答中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)激活下游靶基因，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、能量代謝等環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)蕨麻多酚可能在血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧時(shí)通過(guò)下調(diào)HIF-1α，進(jìn)而抑制內(nèi)皮素（ET）-1的合成和分泌；上調(diào)eNOS，下調(diào)iNOS，調(diào)控一氧化氮（NO）的合成和分泌;調(diào)節(jié)NO和ET-1的動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮抗缺氧保護(hù)作用[19]。上述研究，體現(xiàn)了茵陳蒿湯多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其可能通過(guò)促進(jìn)膽汁分泌排泄、抗炎、抑制肝纖維化、抗氧化、減輕肝細(xì)胞損傷和凋亡等多個(gè)生物過(guò)程及作用通路，起到治療OJ的作用。

通過(guò)對(duì)KEGG富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)蛋白NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）參與流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt、HIF-1等多條通路，并與茵陳蒿湯中多個(gè)化合物有關(guān)，因此將eNOS和iNOS作為目的蛋白進(jìn)行分子對(duì)接和免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。兩者均是合成NO的關(guān)鍵酶，NO在OJ肝損害中具有雙重作用。在疾病發(fā)展早期，機(jī)體NO水平相對(duì)較低，可擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，改善肝臟血流；NO還具有抗氧化作用，可以與超氧陰離子等自由基結(jié)合，產(chǎn)生低毒性自由基，減輕肝損傷。隨著疾病的發(fā)展，內(nèi)毒素等各種刺激因子引起iNOS表達(dá)增加，生成大量的NO，過(guò)量的NO具有細(xì)胞毒性，加重肝損傷[20]。上述結(jié)果表明茵陳蒿湯中與交集靶點(diǎn)有關(guān)的化學(xué)成分主要有槲皮素、山奈酚、異鼠李素等，因此將eNOS和iNOS蛋白分別與這些化學(xué)成分進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)對(duì)接的最低結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，且通過(guò)分子對(duì)接模式圖可知這些化學(xué)成分可能與蛋白上多個(gè)氨基酸殘基相結(jié)合，表示eNOS、iNOS和茵陳蒿湯中的主要化合物槲皮素、山奈酚、異鼠李素有較好的結(jié)合能力。通過(guò)對(duì)大鼠肝組織免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組肝組織中iNOS蛋白表達(dá)升高，而eNOS蛋白表達(dá)降低；與模型組相比，茵陳蒿湯組肝組織中iNOS蛋白表達(dá)降低，eNOS蛋白表達(dá)升高。這可能是OJ發(fā)生時(shí)，機(jī)體炎癥和內(nèi)毒素等刺激因子引起肝組織中iNOS水平迅速增加，產(chǎn)生大量NO，造成肝損傷；而茵陳蒿湯通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS和iNOS，從而降低NO的過(guò)量表達(dá)，維持一定生理量，使其產(chǎn)生抗氧化、改善肝臟微循環(huán)的作用。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究茵陳蒿湯治療OJ的有效成分、作用靶點(diǎn)及通路，體現(xiàn)了茵陳蒿湯多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，系統(tǒng)性分析了茵陳蒿湯治療OJ的可能作用機(jī)制，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)證實(shí)茵陳蒿湯中的多種活性成分可作用于eNOS、iNOS蛋白。免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)茵陳蒿湯對(duì)OJ氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)可能與改變eNOS、iNOS蛋白的表達(dá)有關(guān)，這為進(jìn)一步研究茵陳蒿湯提供了思路和理論依據(jù)。