液氮冷凍聯(lián)合光動(dòng)力療法治療男性包皮尖銳濕疣的療效觀察及HPV檢測(cè)分析

吳美樂(lè)，呂新翔，于希軍，李東霞，馬元龍，賀 偉

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

基于5-氨基酮戊酸的光動(dòng)力療法（photodynamic therapy with 5-aminolaevulinic acid,ALA-PDT）是一種利用光化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行疾病診斷和治療的新技術(shù)，其主要的原理是增生活躍的細(xì)胞可以大量吸收光敏劑ALA，而正常細(xì)胞吸收得很少，在特定光源激發(fā)下，導(dǎo)致特定細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到靶向治療作用[1]。無(wú)論是最早的病例報(bào)道還是病例對(duì)照研究的文獻(xiàn)，均報(bào)告ALA-PDT在尖銳濕疣的治療有效性、降低復(fù)發(fā)率方面均有顯著的優(yōu)勢(shì)，并且在清除HPV感染方面也具有突出的效果[2]。為進(jìn)一步探討光動(dòng)力治療男性包皮尖銳濕疣的效果及可能的治療機(jī)理，選取80例未經(jīng)治療的男性包皮尖銳濕疣患者，觀察尖銳濕疣的治療效果和復(fù)發(fā)情況，并在治療前后對(duì)患者皮損區(qū)域進(jìn)行HPV基因檢測(cè)（HPV6或HPV11），分析其對(duì)HPV感染清除的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月～2019年6月就診于本院皮膚性病科門診的男性尖銳濕疣患者作為研究對(duì)象（皮損位于包皮部位），經(jīng)臨床、醋酸白試驗(yàn)或組織病理確診，并且HPV基因檢測(cè)陽(yáng)性（HPV6或HPV11陽(yáng)性）。對(duì)所有患者在治療前結(jié)合病史及檢查化驗(yàn)進(jìn)行篩查，排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并其他傳染性疾?。òㄆ渌詡鞑ゼ膊。?；② 合并免疫功能低下的其他疾病（如HIV感染、糖尿病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑、接受放療或化療等）。共有80例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，對(duì)其進(jìn)行治療觀察。將所有患者隨機(jī)分為兩組，即治療組和對(duì)照組，每組各40例?；颊吣挲g（19～65）歲，平均（36.5±12.8）歲。所有患者的皮損直徑＜1cm，皮損數(shù)目（3～20）個(gè)。治療組先給予冷凍治療一次，次日開(kāi)始光動(dòng)力治療，每周1次，連續(xù)治療4次。對(duì)照組僅選擇冷凍治療，每周1次，連續(xù)治療（3～4）次（根據(jù)皮損清除情況決定治療次數(shù)）。本研究經(jīng)過(guò)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NO.YJ2019073），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 光動(dòng)力治療方法：0.1%新潔爾滅溶液常規(guī)消毒皮損區(qū)域皮膚后，將用5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司）配制成的20%的凝膠，立即均勻涂于疣體及其周邊1cm范圍外觀正常的皮膚黏膜上。涂藥劑量按照38mg/cm2計(jì)算，即直徑2cm（3.14cm2）皮膚范圍應(yīng)用118mg ALA藥物，保鮮膜封包，避光3h。封包結(jié)束后，用輸出波長(zhǎng)635nm，能量密度（100～120）J/cm2的LD600-A型半導(dǎo)體激光治療機(jī)照射（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司提供），每個(gè)光斑照射20min。

冷凍治療：常規(guī)使用0.1%新潔爾滅溶液消毒皮損區(qū)域后，用醫(yī)用棉簽蘸取液氮點(diǎn)涂于疣體處，根據(jù)疣體大小進(jìn)行（2～3）個(gè)凍融周期。

1.3 復(fù)發(fā)情況評(píng)估及HPV基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法 所有患者隨訪至第8周末進(jìn)行療效評(píng)估，利用醋酸白試驗(yàn)觀察疣體復(fù)發(fā)情況。皮損區(qū)域在治療前（基線）和治療后第8周末分別進(jìn)行HPV基因檢測(cè)（HPV6/11）。取材方法：利用無(wú)菌取材刷反復(fù)刷疣體表面（3～5）次，以取得脫落的角質(zhì)表皮細(xì)胞。治療8周后，利用同樣方法在疣體或原疣體部位進(jìn)行取材。HPV基因檢測(cè)采用商業(yè)化的HPV基因分型試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，深圳），具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，依次進(jìn)行HPV-DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交及結(jié)果判斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用（%）表示，F(xiàn)isher's確切概率法檢驗(yàn)比較兩組間的差異。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨訪至第8周末評(píng)估結(jié)果顯示 治療組40例患者中有35例未見(jiàn)新發(fā)疣體（87.5%），未見(jiàn)疣體復(fù)發(fā)，5例有新疣體復(fù)發(fā)（12.5%）；對(duì)照組40例患者中有22例未見(jiàn)新發(fā)疣體（55%），未見(jiàn)疣體復(fù)發(fā)，18例有新疣體復(fù)發(fā)（45%）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），患者治療前后復(fù)發(fā)率比較見(jiàn)表1。

表1 兩組包皮尖銳濕疣復(fù)發(fā)率及HPV清除率比較（n，%）

4周后療程結(jié)束，隨訪至治療后第8周末，對(duì)57例無(wú)疣體復(fù)發(fā)的病例（治療組35例、對(duì)照組22例）進(jìn)行了再次HPV基因檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：治療組中有17例未檢測(cè)到HPV6/11（占比48.57%），對(duì)照組中有4例未檢測(cè)到HPV6/11（占比18.18%）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組和對(duì)照組HPV清除率比較見(jiàn)表1。

3 討論

尖銳濕疣是一種常見(jiàn)的性傳播疾病，是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染皮膚黏膜導(dǎo)致的疾病，常由HPV6和HPV11型感染導(dǎo)致[1、3]，臨床表現(xiàn)以皮膚黏膜疣狀增生為特征。除了肉眼可見(jiàn)的疣體，尖銳濕疣患者的皮損周圍往往存在亞臨床感染和潛伏感染。亞臨床感染是指皮膚黏膜已經(jīng)感染HPV，組織發(fā)生了病理學(xué)變化，但尚未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的疣體。通過(guò)3%～5%冰醋酸外涂（醋酸白試驗(yàn)）、皮膚鏡檢查或皮膚病理檢查可以發(fā)現(xiàn)亞臨床感染，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)方法檢測(cè)HPV。文獻(xiàn)報(bào)道正常男性生殖器HPV檢測(cè)陽(yáng)性率在1.3%～72.9%不等，可見(jiàn)HPV的潛伏感染率很高，而且會(huì)長(zhǎng)期存在。許多患者同時(shí)感染多種類型的HPV，包括高危型HPV，因此HPV潛伏感染和亞臨床感染需要更多的關(guān)注和治療。有學(xué)者利用ALA-PDT治療HPV亞臨床感染和潛伏感染的結(jié)果顯示，接受3次ALA-PDT治療后的患者的HPV病毒清除率顯著高于接受1次治療的患者。

同時(shí)有研究表明，尖銳濕疣患者的整體免疫功能低下（受合并糖尿病、結(jié)締組織病、惡性腫瘤、使用糖皮質(zhì)激素、免疫制劑等因素影響），細(xì)胞免疫功能低下亦是引起復(fù)發(fā)的重要因素。也有可能皮損局部存在免疫功能低下，導(dǎo)致皮損遷延不愈、反復(fù)復(fù)發(fā)，這也為多種方法治療尖銳濕疣提供了科學(xué)依據(jù)。目前，可用于治療尖銳濕疣方法眾多，包括物理治療（如液氮冷凍、CO2激光、手術(shù)等）、光動(dòng)力治療、外用藥物治療（如5%咪喹莫特乳膏、0.5%鬼臼毒素酊、5% 5-氟尿嘧啶乳膏等）、抗病毒治療、提高免疫功能（如干擾素、轉(zhuǎn)移因子或胸腺肽等）等。對(duì)于尖銳濕疣治療方法的選擇需要對(duì)皮損數(shù)量、大小形態(tài)、位置、疣體角化程度、病程（初發(fā)或復(fù)發(fā)）以及合并疾病等因素進(jìn)行綜合考慮。冷凍治療的優(yōu)勢(shì)在于可以快速祛除肉眼可見(jiàn)的疣體，并且簡(jiǎn)單易行，被臨床廣泛應(yīng)用，其缺點(diǎn)是皮損復(fù)發(fā)率高，以及冷凍治療后局部出現(xiàn)水皰、糜爛、疼痛、色素沉著、色素脫失等。

近年來(lái)，光動(dòng)力療法（ALA-PDT）被廣泛應(yīng)用于皮膚腫瘤、皮膚癌前病變、痤瘡和尖銳濕疣等疾病的治療中，并取得良好的效果。ALA-PDT的作用機(jī)理是異常增生的組織吸收光敏劑后，經(jīng)特定波長(zhǎng)（紅光）和能量的光照射后［能量密度（100～150）J/cm2］，光敏劑受到激發(fā)發(fā)生光動(dòng)力敏化反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，進(jìn)而選擇性地破壞病變組織。另外，ALAPDT可以直接作用于HPV，抑制病毒復(fù)制，進(jìn)而清除HPV。還有研究表明，ALA-PDT可以改善患者全身和局部的免疫功能，提高機(jī)體抗HPV能力。此外，由于ALA-PDT可以誘導(dǎo)癌變或潛在的癌變細(xì)胞凋亡，ALA-PDT被證明是治療皮膚腫瘤、癌前病變有效的方法。本研究先采用冷凍治療祛除肉眼可見(jiàn)的疣體后，再聯(lián)合光動(dòng)力療法，聯(lián)合治療組在治療結(jié)束后（第8周）肉眼可見(jiàn)疣體的復(fù)發(fā)率（12.50%）明顯低于單純冷凍治療組（45.00%）。而聯(lián)合治療組HPV清除率（48.57%）明顯高于單純冷凍治療組（18.18%）。由此可見(jiàn)，光動(dòng)力療法可有效清除HPV或減少亞臨床感染和潛伏感染。光動(dòng)力治療之所以能有效降低尖銳濕疣的復(fù)發(fā)率，是因?yàn)槠浒ㄒ种萍?xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、對(duì)增生血管的直接損傷作用、誘發(fā)機(jī)體局部或（和）全身的免疫反應(yīng)、抑制病毒復(fù)制等機(jī)制。王煥麗等利用光動(dòng)力療法治療復(fù)發(fā)性尖銳濕疣患者的HPV轉(zhuǎn)陰率為42.5%，明顯高于對(duì)照組的17.5%，對(duì)HPV仍陽(yáng)性的患者，HPV病毒載量下降程度也大于對(duì)照組。Owczarek W等的研究發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力療法對(duì)整體HPV的清除率可以達(dá)到66.67%，而對(duì)于低危型的HPV6/11，病毒清除率可以達(dá)到76.92%。有研究發(fā)現(xiàn)PDT治療6個(gè)月后HPV陰轉(zhuǎn)率為66.7%。一項(xiàng)薈萃分析顯示ALA-PDT治療后尖銳濕疣患者的疣體清除率可以達(dá)到96%，顯著高于激光（69%）或外用藥物（14%）治療的患者，復(fù)發(fā)率僅為7.5%，也顯著低于利用激光（24%）和外用藥物（31%）治療的患者。這些研究結(jié)果與本研究的結(jié)果相一致，都提示ALA-PDT可以提高疣體和HPV的清除率，減少?gòu)?fù)發(fā)。冷凍治療可以快速去除肉眼可見(jiàn)疣體；此外，冷凍還導(dǎo)致皮膚黏膜的損傷，也增加了ALA的吸收，兩種治療方法結(jié)合起來(lái)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，療效顯著。既往的HPV亞臨床和潛伏感染的治療研究結(jié)果均顯示，有效的ALA-PDT（3次以上）可以有效清除HPV感染或減低病毒載量。但需要注意ALA-PDT治療局部刺激反應(yīng)發(fā)生率較高，文獻(xiàn)報(bào)道其不良反應(yīng)的發(fā)生率（69%）高于激光治療（28%）或外用藥物治療（30%）的患者。ALA-PDT治療后不良反應(yīng)與ALA藥物的配置濃度和治療次數(shù)有著明顯的關(guān)系。因此ALA-PDT治療需要按照規(guī)范流程進(jìn)行操作。文獻(xiàn)報(bào)道最佳治療次數(shù)為（3～5）次，ALA配置濃度以20%最為適宜，濃度太低治療效果差，濃度太高則局部不良反應(yīng)增加。也有研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染尖銳濕疣患者如果要達(dá)到病毒學(xué)痊愈，ALA-PDT治療次數(shù)要高于低危型患者，因此，對(duì)于尖銳濕疣患者進(jìn)行HPV亞型檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。

HPV和宿主之間的相互作用是一個(gè)漫長(zhǎng)而又復(fù)雜的生物免疫過(guò)程，如僅使用傳統(tǒng)物理療法（如冷凍治療）去除疣體，HPV亞臨床感染和潛伏感染仍然存在，易導(dǎo)致尖銳濕疣復(fù)發(fā)，而且具有傳染性，可以通過(guò)性接觸或間接接觸傳染給性伴或家人。孕婦在分娩過(guò)程中，也可通過(guò)產(chǎn)道導(dǎo)致胎兒感染HPV。部分高危型HPV的持續(xù)感染與肛門生殖器癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，尖銳濕疣的治療目標(biāo)應(yīng)達(dá)到真正的生物學(xué)治愈，完全消除HPV對(duì)人體組織的有害影響。體外細(xì)胞學(xué)研究顯示，ALA-PDT治療后可以通過(guò)Ca2+-CamKKβ-AMPK通路導(dǎo)致Hela細(xì)胞（HPV18感染）的自噬，可能是其治療HPV感染的機(jī)制之一。并且，ALA-PDT治療后的HeLa細(xì)胞后，LC3II和p62呈現(xiàn)高表達(dá)，半胱天冬酶-3（caspase-3）和裂解半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）表達(dá)上調(diào)，提示通過(guò)ALA-PDT治療可能通過(guò)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低HPV病毒載量。

綜上所述，液氮冷凍聯(lián)合光動(dòng)力療法可以顯著減少尖銳濕疣患者的HPV亞臨床感染和潛伏感染，提高HPV清除率。在選擇尖銳濕疣治療方法時(shí)，如果先選擇物理方法去除疣體（如冷凍治療），然后再進(jìn)行光動(dòng)力治療，可以更好地清除亞臨床感染和潛伏感染的HPV，進(jìn)而減少尖銳濕疣的復(fù)發(fā)，但其確切機(jī)制仍需要進(jìn)行更加深入的研究。