中鏈化學品微生物制造

朱志偉，譚亞娣，張喬馨，薛 闖,2

(1.大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學 寧波研究院，浙江 寧波 315016)

1 中鏈化學品

一般認為，含6～12個碳原子的直鏈脂肪酸為中鏈脂肪酸，相應的衍生物被稱為中鏈化學品，廣泛用作生物燃料、材料單體、日用化學品和精細化學品[1]。中鏈脂肪酸可作為除草劑、抗菌劑和潤滑劑的中間體；中鏈酮和中鏈烷基酯是香精香料，中鏈酯也可以用作車用生物燃料；中鏈醇可用作表面活性劑、塑化劑、生物燃料和醫(yī)藥中間體；中鏈烷烴是汽油和航空燃油的理想替代品；中鏈烯烴可用于生產(chǎn)表面活性劑、塑化劑和特種塑料；中鏈二元酸是生產(chǎn)聚酰胺塑料(尼龍)的單體；ω-羥基酸可用作聚合物單體?，F(xiàn)有中鏈化學品大多源自煤和石油化工原料，使用可再生原料合成中鏈化學品是實現(xiàn)其可持續(xù)綠色制造的必然選擇。小部分中鏈化學品可使用動植物油脂為原料合成，例如椰油和棕櫚仁油含70%～80%的中鏈脂肪酸，其中主要組分為月桂酸(C12)；蓖麻油富含的蓖麻油酸(Ricinoleic acid，12-羥基油酸)經(jīng)裂解轉(zhuǎn)化后，可合成聚酰胺PA11的單體ω-氨基十一酸。然而植物油料來源的中鏈脂肪酸供應受土地、水肥和天氣等因素的影響和限制，無法滿足產(chǎn)業(yè)鏈需求。而微生物發(fā)酵生產(chǎn)不受上述因素影響，使用代謝工程改造的微生物細胞工廠合成中鏈脂肪酸，以木質(zhì)纖維素為原料、或直接通過光合作用捕獲CO2和光能、或使用可再生電能進行CO2轉(zhuǎn)化，將為中鏈化學品生產(chǎn)提供一條可持續(xù)的綠色合成路線，也有助于“碳達峰、碳中和”目標的實現(xiàn)。過去5～10年內(nèi)，代謝工程、合成生物技術、過程工程等技術的融合，已經(jīng)催生了許多驚喜的成果，本文著重討論中鏈化學品合成的酶學基礎及細胞工廠改造策略，探討存在的主要問題和挑戰(zhàn)，并提出后續(xù)工作的方向。

2 碳鏈延伸途徑

中鏈化學品的合成依賴碳鏈延伸途徑，絕大多數(shù)微生物其天然的碳鏈延伸途徑并不形成中鏈產(chǎn)物，因此細胞內(nèi)中鏈化合物的濃度很低。隨著對碳鏈延伸反應機制的理解及研究不斷深入，現(xiàn)在可以操縱碳鏈延伸途徑合成中鏈羧酸，這些途徑包括脂肪酸合成途徑、逆β-氧化途徑、聚酮合成途徑、α-酮酸延伸途徑等。

2.1 脂肪酸合成途徑

除少數(shù)古細菌外，地球上的生物均使用攜帶酰基的磷脂分子作為細胞膜的組分，且酰基碳鏈長度一般為C16和C18。原核生物、真核生物線粒體和葉綠體使用II型脂肪酸合酶系統(tǒng)，每種酶活性由單個基因編碼。而I型脂肪酸合酶是多酶復合物，其亞基包含多個酶催化結構域。動物細胞的胞漿中存在二聚體、分子量約為540 kD的I型脂肪酸合酶；真菌和部分放線菌中存在分子量高達2.5 MD的另一種I型脂肪酸合酶。不同脂肪酸合酶系統(tǒng)催化的化學反應高度類似(圖1a)，針對不同脂肪酸合酶系統(tǒng)，引入短鏈硫酯酶(Thioesterase)，或突變催化縮合反應的酮酰合酶(Ketoacyl synthase)和參與產(chǎn)物釋放的丙二?；?棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(Malonyl/palmitoyl transferase)，可以調(diào)控脂肪酸產(chǎn)物鏈長(圖1a)[2]。

2.2 逆β-氧化途徑

輔酶A(Coenzyme A，CoA)依賴的碳鏈延伸途徑與脂肪酸β-氧化途徑方向相反，常稱為逆β-氧化途徑。產(chǎn)溶劑梭菌利用逆β-氧化途徑合成丁醇，該途徑被改造后可以合成C≥6醇[3-4]。通過合成生物學手段和系統(tǒng)生物學分析，已確認大腸埃希菌逆β-氧化途徑的核心組分，該途徑發(fā)生的關鍵是替換?；?CoA脫氫酶為反式-烯酰-CoA還原酶[4]，而硫解酶(Thiolase)的底物鏈長特異性對實現(xiàn)多輪迭代逆β-氧化循環(huán)并合成C≥6產(chǎn)物起關鍵作用，另外硫酯酶(Thioesterase)也能顯著影響產(chǎn)物的鏈長(圖1b)[5]。逆β-氧化途徑不依賴ATP，且使用NADH為還原力，這些特征有助于提高產(chǎn)物得率。盡管真核微生物(如釀酒酵母)可采用類似途徑合成丁醇，但進一步延長碳鏈合成中鏈產(chǎn)物仍相當困難[6]。

圖1 中鏈化學品合成相關的碳鏈延伸途徑

2.3 聚酮合成途徑

聚酮合成途徑與脂肪酸合成途徑類似，但聚酮合成途徑可使用的起始單元和延伸單元更加多樣，如丙酰-CoA、甲基丙二酰-CoA等；此外聚酮合成途徑往往缺乏酮酰還原、脫水或烯酰還原等步驟，最終產(chǎn)物骨架上保留了羰基、羥基或烯基基團，再加上環(huán)化和后續(xù)修飾，聚酮產(chǎn)物的結構非常多樣[7]。通過改造聚酮合酶，可以合成中鏈化學品(圖1c)。Keasling課題組利用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素Borrelidin合成相關的延伸模塊1，替換其酮酰還原結構域和脫水酶結構域，并表達合適的硫酯酶，獲得雜合的聚酮合酶可催化琥珀酰-CoA和丙二酸-CoA合成己二酸[8]。而對LipPks1聚酮合酶進行多輪的結構域替換與突變，可以合成多種酮類化合物(C6和C7乙基酮，C5和C6甲基酮)[9]。也有研究表達聚酮合酶SgcE與硫酯酶SgcE10來合成C15的直鏈烯烴[10]，而改變硫酯酶SgcE10的特異性，將可能獲得中鏈烯烴。目前，相當多的研究聚焦于次級代謝產(chǎn)物相關的聚酮合酶的發(fā)現(xiàn)與表征，改造與重設計聚酮合酶的研究尚不多，主要原因是聚酮合成機制較復雜，理性改造的難度較大。

2.4 α-酮酸延伸

該碳鏈延伸途徑(圖1d)與氨基酸合成有關，天然α-酮酸延伸途徑通常只催化一輪反應，使底物增加一個亞甲基[11]。由于異丙基蘋果酸合酶(Isopropylmalate synthase)的底物混雜性，該酶可使用氨基酸代謝產(chǎn)生的C6支鏈α-酮酸為底物，經(jīng)一輪延伸反應，合成C7產(chǎn)物[12]。而通過蛋白質(zhì)工程擴大其底物結合口袋，可使延伸循環(huán)次數(shù)增加，進而合成C6-8直鏈醇[13]。α-酮酸延伸使用乙酰-CoA為延伸單元，但每輪反應只增加一個碳原子，另一個碳原子經(jīng)脫羧反應損失，因此該途徑的碳原子利用效率不高，從而限制其應用。

2.5 其他途徑

異戊烯合成途徑使用C5單元，其中以香葉基焦磷酸為中間體，可形成10碳支鏈產(chǎn)物，例如香葉醇。另外脂肪酸β-氧化途徑可對高碳鏈底物進行裁剪，但該途徑依賴于長鏈脂肪酸，原子經(jīng)濟性較差。

3 鏈長控制

利用不同的碳鏈延伸途徑，并且調(diào)控產(chǎn)物鏈長，是合成中鏈產(chǎn)物的關鍵。與產(chǎn)物鏈長控制相關的酶包括硫酯酶、酮酰合酶、硫解酶和?；D(zhuǎn)移酶。

3.1 硫酯酶

酰基-?；d體蛋白(Acyl Carrier Protein，ACP)硫酯酶催化水解酰基與ACP的磷酸泛酰巰基乙胺之間的硫酯鍵，釋放出游離脂肪酸，使ACP再生并用于下一輪脂肪酸合成，而?；?ACP硫酯酶的鏈長特異性決定脂肪酸產(chǎn)物鏈長。從加州月桂(Umbellulariacalifornica)中找到的中鏈?；?ACP硫酯酶BTE，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥積累大量C12脂肪酸[14]，且高產(chǎn)C12脂肪酸的轉(zhuǎn)基因油菜已商業(yè)化種植[15]。在缺失脂肪酸降解途徑(敲除fadD或fadE基因)的大腸埃希菌中表達酰基-ACP硫酯酶BTE，可使該細菌大量分泌C12脂肪酸，表明通過硫酯酶調(diào)控脂肪酸鏈長具有可行性[16]。使用木質(zhì)纖維素作為底物，以大腸埃希菌等微生物為底盤合成脂肪酸及其衍生燃料化學品(如脂肪酸乙酯、脂肪醇等)，是生物燃料綠色制造的重要路線[17-18]，且通過表達中短鏈硫酯酶來調(diào)整產(chǎn)物鏈長，有望生產(chǎn)出可替代汽油(平均碳鏈長度C8)及航空煤油(平均碳鏈長度C11)的生物燃料分子[19-20]。

?；?ACP硫酯酶大多兼具?；?CoA硫酯酶活性，可用于逆β-氧化途徑的鏈長控制，如過表達大腸埃希菌內(nèi)源硫酯酶tesA和ydiI，可顯著提高中鏈脂肪酸合成水平[4-5，21]。最近報道細菌硫酯酶AtTE(源自Anaerococcustetradium)可能更偏好?；?CoA底物，使表達的逆β-氧化途徑與內(nèi)源脂肪酸合成途徑正交[22]。

由于硫酯酶在產(chǎn)物鏈長控制方面的重要作用，通過家族序列特征挖掘硫酯酶或通過蛋白質(zhì)工程手段提高硫酯酶活性或特異性，都有許多成功的例子。例如，根據(jù)序列親緣關系和來源物種的脂肪酸組成，選擇31條硫酯酶基因，表征并歸類這些硫酯酶的底物特異性，發(fā)現(xiàn)多個合成中短鏈脂肪酸的硫酯酶[23]。硫辛酸合成缺陷菌株(ΔlipB)的生長依賴辛酸(C8)，使用該宿主篩選CpFatB1基因的隨機突變文庫，可獲得高特異性合成辛酸的突變體[24]。使用迭代蛋白重設計算法指導大腸埃希菌tesA改造，也改變了該硫酯酶的鏈長特異性[25]；另外根據(jù)tesA蛋白結構，對底物結構口袋進行改造，使該酶對酰基-ACP(C8)的底物選擇性提高了133倍，而表達RD-2突變體(E142D、Y145G、M141L、L146K)使C8脂肪酸的合成量提高了10倍[26]。針對酵母和細菌來源的I型脂肪酸合酶，筆者研究發(fā)現(xiàn)其反應活性空腔存在富余空間，可嵌入中短鏈硫酯酶以劫持中間體，并證明重設計的脂肪酸合酶可合成中鏈脂肪酸[27-28]，且已利用該重設計的脂肪酸合酶為下游中鏈化合物合成提供前體[29]。

3.2 酮酰合酶

酮酰合酶催化?；?CoA/ACP與丙二酰-ACP發(fā)生Claisen縮合反應，該酶底物結合口袋空間是影響鏈長的重要因素。大腸埃希菌含3個酮酰合酶編碼基因(FabH、FabB和FabF)，并具有不同的底物特異性。FabH對乙酰-CoA具有選擇性，特異性催化脂肪酸鏈延伸的起始反應形成乙酰乙酰-ACP，而FabB和FabF則催化后續(xù)Claisen縮合反應[30]。FabF底物結合口袋存在特定異亮氨酸殘基I108，可根據(jù)?；兼滈L度調(diào)整構象，而突變該氨基酸為苯丙氨酸，可使FabF催化C6以上底物的活性顯著減弱[31]，從而限制長鏈脂肪酸合成。線粒體II型脂肪酸合成系統(tǒng)和真菌I型脂肪酸合酶的酮酰合酶也存在相似的Gatekeeper殘基，例如酵母Fas2蛋白的M1251殘基，如果突變其鄰近的G1250為絲氨酸，限制M1251側鏈旋轉(zhuǎn)，或直接突變M1251為大側鏈色氨酸，可使酵母脂肪酸合酶催化產(chǎn)生中短鏈脂肪酸[2，27，32]，引入類似突變到細菌I型脂肪酸合酶，也能獲得合成中鏈脂肪酸的突變體[28，33]。

3.3 硫解酶

硫解酶可分為合成型(如乙酰乙酰-CoA硫解酶)和分解型(如β-酮酰-CoA硫解酶)。分解型硫解酶熱力學上偏好于催化β-酮酰-CoA裂解，但是在偶聯(lián)下游熱力學偏好反應(如烯酰-CoA還原)情況下，可催化兩種酰基-CoA發(fā)生Claisen縮合反應[4，34]。硫解酶的底物特異性對產(chǎn)物鏈長起決定性作用，然而該酶的鏈長控制機制尚不清楚。篩選并測試不同來源的硫解酶有助于獲得可特異性催化合成特定鏈長產(chǎn)物的硫解酶，通過序列相似性網(wǎng)絡(Sequence Similarity Network)分析，找到了區(qū)別于聚羥基烷酸和脂肪酸降解途徑的硫解酶，該酶可用于合成C8和C10脂肪酸[22]。蛋白質(zhì)工程改造也能提高硫解酶的鏈長選擇性，模型指導的底物結合位點重設計，使硫解酶合成產(chǎn)物中C6/C4的比例提高10倍[35]。近期研究發(fā)現(xiàn)，硫解酶介導的碳鏈延伸也可以接受β-酮酰-CoA為底物，實現(xiàn)聚酮化合物合成[36]，硫解酶在碳鏈延伸反應過程中的底物混雜性，有望用于擴展生物合成化學品的結構多樣性[34，37]。

3.4 酰基轉(zhuǎn)移酶

?；D(zhuǎn)移酶在脂肪酸合酶和聚酮合酶中，催化?；?CoA與酰基-ACP間發(fā)生可逆的轉(zhuǎn)?；磻Ｔ撁富钚灾行拇嬖诒Ｊ亟z氨酸殘基，該絲氨酸殘基的羥基與?；纬甚ブ虚g體。不同脂肪酸合酶系統(tǒng)中，?；D(zhuǎn)移酶的催化特性與底物選擇性不一樣。例如大腸埃希菌FabD催化丙二酰-CoA為丙二酰-ACP；動物脂肪酸合酶的丙二酰/乙酰轉(zhuǎn)移酶(MAT)結構域可轉(zhuǎn)移乙酰-CoA和丙二酰-CoA兩種底物，且還能識別多種CoA硫酯[38]；而真菌I型脂肪酸合酶含有兩個?；D(zhuǎn)移酶結構域，催化乙酰-CoA的乙?；D(zhuǎn)移酶(AT)結構域和催化丙二酰-CoA與長鏈終產(chǎn)物棕櫚酰-ACP的丙二酰/棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(MPT)結構域。突變釀酒酵母脂肪酸合酶AT結構域(I306A)可增加對底物乙酰-CoA的親和力，而突變MPT結構域(R1834K)則減少對底物丙二酰-CoA的親和力，這兩種突變改變進入脂肪酸鏈延伸反應的兩種底物(乙酰-CoA和丙二酰-CoA)的比例，從而使脂肪酸合酶合成中鏈脂肪酸[32-33]。

4 前體供應

中鏈化學品合成依賴細胞代謝提供前體，并通過前述碳鏈延伸途徑合成中鏈脂肪酸等平臺化合物。乙酰-CoA和還原型輔因子是碳鏈延伸途徑的關鍵前體底物，而這兩種代謝物供應的原子經(jīng)濟性及能量轉(zhuǎn)化效率是影響產(chǎn)物合成的重要因素。

4.1 乙酰-CoA

乙酰-CoA是細胞內(nèi)重要的C2中心代謝物，是許多產(chǎn)物(如脂肪酸、聚酮、萜類化合物)的前體，并通過乙?；揎梾⑴c細胞調(diào)控過程[39]。提高乙酰-CoA的供給，對平臺細胞工廠的創(chuàng)制非常重要[40]。Nielsen課題組對釀酒酵母乙酰-CoA供給進行了系統(tǒng)改造，包括引入多條乙酰-CoA合成途徑，并結合適應性進化手段對胞內(nèi)初級代謝進行了重塑(例如阻斷乙醇發(fā)酵，消除Crabtree效應)，并用于目標產(chǎn)物的合成[40-46]。大腸埃希菌等原核微生物的丙酮酸脫氫酶位于胞漿中，上調(diào)丙酮酸脫氫酶復合物基因表達，并通過質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)諧表達水平，增加了乙酰-CoA合成，并提升脂肪酸產(chǎn)量[47]。通過提高丙酮酸合成通量、減少乙酸代謝溢流以及提升CoA合成水平，也能增加乙酰-CoA供給[48]。此外設計構建新型乙酰-CoA合成途徑，例如非氧化糖酵解途徑可保留葡萄糖的所有碳原子，有望提高碳源轉(zhuǎn)化得率[48-49]。從頭設計羥基乙醛合酶和乙酰磷酸合酶，可使甲醛經(jīng)3步反應形成乙酰-CoA，該精簡途徑不需要ATP輸入，為C1底物原料的生物煉制提供同化途徑[50]。

4.2 還原型輔因子

脂肪酸類產(chǎn)物的還原度高，其合成需要大量還原型輔因子，如逆β-氧化途徑使用NADH為輔因子[51]，而脂肪酸合成途徑則主要使用NADPH[52]，因此提升細胞內(nèi)NAD(P)H水平和可及性是改善產(chǎn)物合成效率的有效手段[53]。過表達NAD+依賴型甲酸脫氫酶，不僅促進甲酸副產(chǎn)物利用，還可以利用外加甲酸為細胞供給NADH，從而有效提高逆β-氧化途徑的中鏈脂肪酸合成能力[54]。對于脂肪酸合成途徑，為提高NADPH水平，通常過表達中心代謝途徑中產(chǎn)生NADPH的酶(如磷酸戊糖途徑、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸酶、NADP+依賴型3-磷酸甘油醛脫氫酶等)，或催化NAD(H)轉(zhuǎn)化為NADP(H)的NAD激酶和轉(zhuǎn)氫酶(如PntAB和Udh)，或改造目標途徑使用NADH輔因子。例如，使用NADH依賴型酮酰-ACP還原酶fabG(源自Cupriavidustaiwanensis)，脂肪酸產(chǎn)量提升了60%[55]。Stephanopoulos課題組系統(tǒng)評估了解脂耶氏酵母(Yarrowialipolitica)的氧化還原代謝，發(fā)現(xiàn)過表達NADP+依賴型3-磷酸甘油醛脫氫酶、NADP+依賴型蘋果酸酶可提高脂質(zhì)得率到0.28 g/g的最高水平[56]。在釀酒酵母中，過表達蘋果酸酶和磷酸戊糖途徑，并調(diào)諧磷酸葡萄糖異構酶Pgi1的表達來控制磷酸戊糖途徑與糖酵解途徑的代謝流量分配，使脂肪酸產(chǎn)量提高了28%[44-45]。

5 代謝工程策略

天然菌株合成目標產(chǎn)物的能力較低，要獲得符合工業(yè)生產(chǎn)要求的生產(chǎn)菌株，大多需要對出發(fā)菌種進行多輪迭代改造，以提高底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強度。隨著合成生物學工具研究的不斷擴展，對細胞代謝的改造能力已達到前所未有的水平，并且會隨著組學大數(shù)據(jù)、自動化設施、人工智能的應用而進一步深入。針對中鏈化學品制造，使用較多的代謝工程策略包括如下幾個方面。

5.1 Pull-Bush-Block

引入高活性酶催化不可逆的產(chǎn)物形成反應(拉，Pull)、重編程中心代謝將前體導向目標產(chǎn)物合成(推，Push)，阻斷非必需反應減少副產(chǎn)物形成(阻，Block)是經(jīng)典的代謝工程策略。針對中鏈脂肪酸產(chǎn)物合成，表達硫酯酶，引入催化不可逆?；?ACP/CoA水解反應，生成游離脂肪酸產(chǎn)物，是典型的Pull策略。該反應減少?；?ACP/CoA積累，能解除脂肪酸合成途徑和逆β-氧化途徑的反饋抑制作用[57]；在酵母中，也可以敲除?；?CoA合成酶編碼基因FAA1和FAA4，使細胞積累和分泌脂肪酸[58]。除了提高乙酰-CoA和還原型輔因子的供應外，針對脂肪酸合成途徑，提高丙二酰-CoA的水平對于推動(Push)前體進入脂肪酸合成途徑有重要作用。過表達乙酰-CoA羧化酶，在原核和真核微生物中均能提高脂肪酸或脂質(zhì)產(chǎn)量[58-60]。釀酒酵母乙酰-CoA羧化酶Acc1受磷酸化修飾調(diào)節(jié)，突變主要的磷酸化位點(S659和S1157)，可以提高脂肪酸乙酯產(chǎn)量[61]。結構分析表明，S1157磷酸化位點位于非必需Loop區(qū)域(1137到1170)，該區(qū)域缺失可解除Acc1的磷酸化調(diào)節(jié)，并對脂肪酸合成有利[28，62]。脂肪酸降解途徑主要為β-氧化，為更好積累產(chǎn)物，一般均需要敲除β-氧化途徑的關鍵編碼基因，如大腸埃希菌的fadD/fadE[17，63]、釀酒酵母的POX1[44，58]、解脂耶氏酵母的MFE1[64]。對于酵母細胞，脂肪酸產(chǎn)物還可以用于合成甘油三酯、甾醇酯和磷脂，消除或減弱這些儲存脂質(zhì)的合成，可使碳流更多地導向脂肪酸產(chǎn)物形成[64-66]。此外，阻斷中心代謝途徑副產(chǎn)物形成，可實現(xiàn)代謝流匯聚，例如消除大腸埃希菌的發(fā)酵途徑，包括敲除adhE(乙醇形成)、ldhA(乳酸形成)、frdA(琥珀酸形成)和pta/poxB(乙酸形成)[51]。乙醇作為釀酒酵母的主要副產(chǎn)物，Nielsen課題組嘗試了消除乙醇形成途徑，并使釀酒酵母從醇類發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣芍舅醄45]。

5.2 蛋白改造與重設計

中鏈脂肪酸合成需要對鏈長進行控制，已有多項研究對控制鏈長的關鍵酶或催化結構域進行改造(見小節(jié)3)。合成途徑的輔因子不適配也需對酶的輔因子依賴型進行改造，與NAD(H)相比，NADP(H)的腺苷核糖環(huán)2′位連接磷酸基團，與該環(huán)2′和3′位基團相互作用的氨基酸殘基決定酶的輔因子特異性。Arnold課題組開發(fā)了一種改變輔因子特異性的通用在線分析工具CSR-SALAD，可分析蛋白結構，并預測需要改變的氨基酸位點[67]，該輔因子依賴型改造方法可用于調(diào)整輔因子不平衡問題。膜轉(zhuǎn)運子可促進底物進入細胞或產(chǎn)物分泌，是代謝工程操作的重要靶點，然而許多膜轉(zhuǎn)運子的結構及功能并不清楚。定向進化是改造膜轉(zhuǎn)運子的有效手段，針對辛酸耐受相關的膜轉(zhuǎn)運子Tpo1，筆者構建隨機突變文庫，富集并篩選出可增加酵母辛酸耐受性的突變體M49(含F(xiàn)322L、T45S和I432N突變)，該突變體能提高多種胞外中鏈酸的產(chǎn)量[28]。

5.3 自適應進化

中鏈化學品對細胞具有較大毒性，且理性改善細胞耐受性難度較大。自適應進化利用細胞復制產(chǎn)生的自發(fā)突變，通過施加脅迫因子富集有利突變，最終獲得耐受表型。自適應進化已廣泛應用于提高細胞工廠的耐受性，并提升產(chǎn)物的合成[68]。對大腸埃希菌進行自適應進化，提高其辛酸耐受性，所獲菌株可耐受30 mmol/L辛酸，且辛酸產(chǎn)量從32 mg/L提高到180 mg/L[69]。中鏈脂肪酸對酵母細胞的抑制作用更強，低至1 mmol/L即產(chǎn)生較大毒性[70]。筆者使用自適應進化手段，使釀酒酵母細胞在含辛酸的培養(yǎng)基中馴化約100 d，最終獲得辛酸耐受能力顯著改善的突變菌株，該菌株中鏈脂肪酸合成產(chǎn)量提高了2～3倍[28]。中鏈二羧酸可作為聚合物單體，自適應進化能提高釀酒酵母對戊二酸、己二酸和庚二酸的耐受性[71]。對進化菌株進行重測序，并與出發(fā)菌株進行比較分析，可鑒定進化菌株中的基因突變，結合CRISPR基因編輯工具，進行反向工程和表型分析，可找到主效突變[68]。然而，當存在許多中性突變時(不引起表型變化的突變)，鑒定主效突變將相當困難。酵母細胞可進行有性生殖，將進化菌株與相反交配型出發(fā)菌株雜交形成二倍體，然后減數(shù)分裂形成子代單倍體，可實現(xiàn)突變等位基因的重組與分離，對子代細胞進行表型分析，并選取目標表型子代細胞進行基因組測序分析，在具有目標表型的子代細胞中富集的突變基因?qū)⒋蟾怕蕿橹餍Щ?。酵母有性生殖特性為主效基因發(fā)現(xiàn)提供便利，是理想的生物材料。

5.4 遺傳編碼的生物傳感器

傳統(tǒng)代謝物或產(chǎn)物的檢測和定量依賴體外分析技術，如氣相色譜、液相色譜等，但這些檢測方法的通量比較低(10～1 000樣品/d)。生物傳感器可實時監(jiān)測細胞代謝物水平，通過耦聯(lián)合適的基因調(diào)節(jié)回路，還可實時對代謝途徑進行精細調(diào)節(jié)，因此生物傳感器可滿足合成細胞工廠構建過程中的高通量分析檢測和動態(tài)代謝調(diào)控需求[72]。感知脂肪酸產(chǎn)物或前體的生物傳感器已應用于脂肪酸類產(chǎn)物的生物合成調(diào)控。例如使用識別?；?CoA的轉(zhuǎn)錄因子FadR調(diào)控乙醇、?；?CoA和脂肪酸乙酯合成相關基因的表達，使脂肪酸乙酯產(chǎn)量提升，并顯著降低副產(chǎn)物積累[73]；使用FadR控制生長相關基因表達，使低產(chǎn)脂肪酸菌株的生長受抑制，對細胞群體的生產(chǎn)性能進行質(zhì)量控制，使脂肪酸產(chǎn)量提升3倍，發(fā)酵產(chǎn)量達到21.5 g/L[74]?，F(xiàn)已開發(fā)出識別中鏈脂肪酸的生物傳感器，包括基于G-蛋白偶聯(lián)受體OR1G1和PDR12啟動子的傳感系統(tǒng)[75-76]，可用于基因組過表達文庫篩選，并找到KCS1和FSH2兩個基因，其過表達提高辛酸產(chǎn)量約60%[77]。后續(xù)研究設計特異性更好、動態(tài)范圍更廣的生物傳感器，用于多種文庫的篩選，例如RNAi和CRISPRi基因表達抑制文庫，可找到以前未被認知的靶點基因[78]。

6 中鏈衍生化學品合成

以中鏈脂肪酸為前體，通過化學與生物合成方法可獲得許多衍生化學品。生物催化的衍生反應主要發(fā)生在羧基官能團，包括還原反應、脫羧反應、α-氧化、β-氧化、酯化反應等(圖2)。P450酶可催化脂肪酸不同位置的碳氫鍵活化，并擴展了脂肪酸結構多樣性，形成內(nèi)酯、ω-羥基脂肪酸等。其中ω-羥基脂肪酸是聚合物單體，可進一步形成ω-二羧酸、ω-氨基脂肪酸等。下面將對幾種重要衍生反應進行介紹。

圖2 中鏈脂肪酸衍生化學品

6.1 羧基還原

羧基還原是合成醇、烷烴和烷基乙酸酯的重要反應，由于化學惰性，羧基往往需要激活后才參與化學反應?，F(xiàn)有參與羧酸生物還原的酶都使用激活的羧酸硫酯(如?；?CoA/ACP/PCP)為底物。其中羧酸還原酶為特殊非核糖體多肽合成酶，其腺苷化結構域催化轉(zhuǎn)移羧酸到肽基載體蛋白形成硫酯中間體(?；?PCP)，然后經(jīng)還原酶結構域催化該中間體為脂肪醛[79]。羧酸還原酶整合了羧酸激活和還原兩種活性，并使用羧酸為直接底物，在催化還原脂肪酸的過程中有獨特優(yōu)勢。細胞內(nèi)?；?CoA/ACP對脂肪酸合酶有反饋抑制作用[58]，為提高脂肪酸合成的代謝通量，一般采用硫酯酶釋放游離脂肪酸來消除?；?CoA/ACP積累[63]，從而解除反饋抑制。在這種情況下，細胞內(nèi)游離脂肪酸的濃度較?；?CoA/ACP硫酯高很多，相較于酰基-CoA/ACP還原酶，羧酸還原酶催化脂肪酸還原在動力學上優(yōu)勢明顯，且評估多種脂肪酸還原酶對脂肪醇形成的影響，也表明羧酸還原酶性能最好[44]。由于羧酸還原酶底物特異性不好，筆者采用多種蛋白質(zhì)改造手段，包括理性定點突變縮小腺苷化結構域的底物結合口袋、定點飽和突變消除還原酶的構象調(diào)控、定向進化提高轉(zhuǎn)化中鏈脂肪酸的能力，最好的羧酸還原酶突變體可提高中鏈醇產(chǎn)量約3倍[80]。

以脂肪醛為底物，經(jīng)醇脫氫酶或醛還原酶催化可合成脂肪醇。Pfleger課題組一直致力于辛醇合成，前期工作包括篩選合適的CpFatB1硫酯酶突變體[24]，通過表達特異性更好的酰基-CoA合成酶(源自Mycobacteriumtuberculosis的FadD6)和?；?CoA還原酶(源自Marinobacteraquaeolei的ACR)，其他優(yōu)化包括染色體整合型表達，提高?；?CoA合成酶基因拷貝數(shù)等，使辛醇產(chǎn)量達到1.3 g/L水平，占總脂肪醇產(chǎn)量的90%以上[81]。該課題組也在脂肪酸合成途徑和逆β-氧化途徑菌株中表達?；?CoA還原酶，使中鏈脂肪醇產(chǎn)量分別達到1.6 g/L和1.8 g/L水平[82-83]。在解脂耶式酵母中過表達中鏈硫酯酶(源自Cupheapalustris)和?；?CoA還原酶(源自Arabidopsisthaliana)，并敲除PEX10基因，獲得0.5 g/L的癸醇[84]。使用光合藍細菌為底盤，通過固定CO2和光能合成目標產(chǎn)物，是一種低碳合成策略，Jones課題組使用羧酸還原酶催化脂肪酸還原，使光合藍細菌合成0.1 g/L的辛醇和癸醇，并發(fā)現(xiàn)中鏈脂肪酸前體不足是醇類產(chǎn)量受限的主要原因。以釀酒酵母為底盤，在表達脂肪酸合酶突變體形成辛酸的基礎上，過表達羧酸還原酶，可形成約50 mg/L的辛醇[85]。筆者在前期構建的中鏈脂肪酸高產(chǎn)菌株中，過表達偏好中鏈底物的羧酸還原酶，敲除膜轉(zhuǎn)運子Tpo1減少脂肪酸前體溢出胞外，最終搖瓶發(fā)酵合成252 mg/L的中鏈醇(C6-C12)[80]。脂肪醇進一步與?；?CoA反應合成酯，且?；?CoA硫酯鍵斷裂為反應提供自由能，細胞內(nèi)乙酰-CoA是豐度最高的?；?CoA分子，合成乙酸烷基酯的反應動力學最具優(yōu)勢[86]，而且合成的乙酸酯對細胞的毒性較低[87]，因此中鏈醇乙酸酯目標分子的合成具有多種優(yōu)勢。

脂肪醛經(jīng)脫羰基反應形成烷烴分子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括脂肪醛脫甲酰加氧酶(fatty aldehyde deformylating oxygenase，ADO)、植物膜結合脫羰基酶(CER1)和昆蟲P450氧化脫羰基酶(CYP4G1)可催化脂肪醛形成烷烴。與另外兩種酶相比，ADO為可溶性蛋白，不同宿主中均可表達ADO合成烷烴[88-89]。大腸埃希菌表達硫酯酶tesA(L109P突變體)、?；?CoA還原酶(源自Clostridiumacetobutylicum)和醛脫羰基酶CER1(源自Arabidopsisthaliana)，組合其他改造，補料批式發(fā)酵可合成0.5 g/L烷烴[19]。筆者在產(chǎn)中鏈酸的酵母細胞中，表達羧酸還原酶，同時測試了10余種ADO及其偏好中鏈底物的突變體，發(fā)現(xiàn)源自嗜熱藍細菌(Thermosynechococcuselongatus)的ADO催化性能最佳[29]。由于脂肪醛中間體易被還原為脂肪醇而形成副產(chǎn)物，將烷烴合成途徑區(qū)域化到過氧化物酶體，可顯著減少醛類還原，從而增加烷烴的合成量[29，90]。前述三種酶催化烷烴合成的效率均不高，提高這些酶的催化性能是未來需要解決的主要瓶頸問題。

6.2 脫羧反應

已報道多種酶可催化脂肪酸脫羧形成端位烯烴，包括P450脫羧酶OleT、非血紅素-鐵(II)-氧化酶UndA、膜結合的類脂肪酸去飽和酶UndB，以及脂肪酸光脫羧酶FAP[91]。使用這些酶催化中鏈脂肪酸脫羧形成中鏈端位烯烴也有較多報道，例如優(yōu)化OleT的氧化還原電子傳遞鏈，包括使用putidaredoxin作為電子傳遞系統(tǒng)，可以合成0.93 g/L的中短鏈烯烴(C3-C8)[92]。在大腸埃希菌中表達UndA，可合成超過5 mg/L的C11烯烴[93]，筆者在釀酒酵母中表達UndA，可合成3 mg/L的端位烯烴，其中C9和C11是主要產(chǎn)物[29]。在脂肪酸脫羧過程中，UndA的輔因子Fe(II)轉(zhuǎn)化為Fe(III)，而細胞內(nèi)再生該輔因子的還原劑尚未找到，限制了UndA的催化效率。UndB可合成不同鏈長(C9-C17)的端位烯烴[94-95]，且還可以轉(zhuǎn)化α,ω-二羧酸為α,ω-二烯烴[96]。另外在藻類中發(fā)現(xiàn)了一種光催化型脫羧酶FAP[97]，F(xiàn)AP可催化長鏈脂肪酸脫羧，通過加入不同鏈長烷烴為誘導劑，可使短鏈羧酸發(fā)生脫羧反應[98]。在大腸埃希菌中表達中鏈硫酯酶和FAP，可形成C11和C13烷烴，表明FAP具有催化中鏈脂肪酸脫羧活性[99]。與ADO相比，F(xiàn)AP催化烷烴合成的產(chǎn)量更高[100]，但藍光輸入顯著增加成本，若能改變其催化所需光的波長，實現(xiàn)自然光下烷烴高效合成，并以光合微生物為底盤合成烴類，將顯著提高經(jīng)濟性。

6.3 ω-官能團化

中鏈脂肪酸末端修飾羥基、羧基和氨基等，可用作可再生聚合物材料的單體。多種酶可以催化烷基羥基化[101]，這些酶為脂肪酸末端修飾提供基礎，例如P450單加氧酶或整合膜蛋白AlkB(烷烴單加氧酶)可催化ω-羥基化[102]。已報道能催化ω-羥基化的P450酶的種類和數(shù)量也比較多，但這些酶大多存在電子傳遞鏈復雜、底物特異性差、羥基化位點不專一等問題[103]。CYP153家族的P450單加氧酶催化ω-羥基化的位置選擇性好，且為可溶性P450酶，其結構信息豐富，酶催化機制比較清楚，有助于酶的理性改造[104-106]，使用CYP153合成ω-羥基脂肪酸將是比較理想的選擇。AlkB單加氧酶催化脂肪酸ω-羥基化的研究也比較多，由于是膜蛋白，獲得晶體結構比較困難，所以其改造和設計只能采用不依賴于結構的定向進化策略[107]。使用熱帶假絲酵母為生物催化劑，轉(zhuǎn)化烷烴或脂肪酸甲酯為二羧酸已經(jīng)商業(yè)化。而轉(zhuǎn)化細胞自身合成的脂肪酸為ω-官能團化產(chǎn)物，將創(chuàng)制出一條完全依賴可再生原料的合成路線，例如在合成中鏈脂肪酸的酵母中，表達P450單加氧酶合成8-羥基辛酸，可獲得3 mg/L的產(chǎn)物[108]，由于產(chǎn)量很低，后續(xù)仍需對酶和菌株進行大量改造工作。

6.4 其他

中鏈?；?CoA與醇類分子合成的中鏈酯可作為食用香精，例如己酸乙酯是濃香型白酒中主要的呈香成分。此外脂肪酸合成或降解途徑的中間體(α,β-不飽和脂肪酸、β-羥基脂肪酸和β-酮酸)也是重要的高值產(chǎn)物，如3-羥基脂肪酸是合成聚羥基烷酸的前體，β-酮酸脫羧可形成甲基酮。脂肪酸α-氧化使脂肪酸丟失一個碳原子形成奇數(shù)碳脂肪酸，或脂肪醇[109]，從而可擴展中鏈產(chǎn)物的鏈長多樣性。

7 結 語

與其他鏈長(長鏈和短鏈)的脂肪酸相比，中鏈脂肪酸生物合成的難度更大，主要原因：①鏈長控制困難，盡管已獲得多種硫酯酶和脂肪酸合酶突變體，或者使用逆β-氧化途徑合成中鏈脂肪酸，但精準控制脂肪酸的鏈長還比較困難，所獲得的產(chǎn)物為混合物，增加了后續(xù)分離成本；②中鏈脂肪酸的細胞毒性大，尤其是對細胞膜的擾動較強，需要提高底盤細胞的耐受能力。部分中鏈衍生物，例如中鏈烷基乙酸酯、中鏈二羧酸的毒性相對較低，以這些低毒性中鏈衍生物為目標產(chǎn)物，可以規(guī)避毒性問題。但中鏈衍生物合成過程的前體如脂肪酸、脂肪醛等容易溢出細胞外，如何調(diào)諧中間體溢出與下游途徑合成也是需要考慮的問題。例如，我們前期發(fā)現(xiàn)敲除膜轉(zhuǎn)運子Tpo1可減少胞外脂肪酸形成，同時增加了脂肪醇的產(chǎn)量[80]。由于中鏈產(chǎn)物的合成涉及蛋白、途徑和細胞生理等多個尺度的調(diào)控，亟需組合蛋白質(zhì)工程、途徑工程和細胞生理工程進行多維度優(yōu)化，并結合理性設計與非理性突變進行多尺度工程。