黃綠葉突變體冀麥5265yg的光合生理特性分析

鄭偉，師箏，龍美，廖允成

黃綠葉突變體冀麥5265yg的光合生理特性分析

鄭偉，師箏，龍美，廖允成

西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100

【】葉色突變體是研究葉綠素合成、葉綠體發(fā)育和光合作用的理想材料，探索小麥黃綠葉突變體的光合生理特性，旨在闡明其光合作用調(diào)控機(jī)理，為小麥黃綠葉突變體的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。以野生型冀麥5265和突變體冀麥5265yg為試驗(yàn)材料，對(duì)葉色表型進(jìn)行觀察，采用分光光度計(jì)和試劑盒法測(cè)定色素含量和酶活性，并利用Li-6400便攜式光合儀和PAM100葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定。表型觀察和色素含量結(jié)果表明，突變體苗期葉片表現(xiàn)為黃綠色，抽穗后葉片逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色。遮陰處理可以使葉片顏色部分復(fù)綠，但比野生型略淺，屬于光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)綠型突變體。突變體葉綠素a和葉綠素b含量顯著低于野生型，葉綠素a/b的比值升高，為典型的葉綠素缺乏型突變體；光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線顯示，突變體的表觀量子效率（AQY）、光飽和點(diǎn)（LSP）、最大凈光合速率（n-max）、光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）、暗呼吸速率（Rd）、羧化效率（CE）和飽和CO2濃度（I-sat）顯著高于野生型，說明突變體葉片的光合機(jī)構(gòu)穩(wěn)定，強(qiáng)光下光合速率更高；光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)表明，突變體的凈光合速率（n）、蒸騰速率（r）、氣孔導(dǎo)度（s）、光化學(xué)量子效率（v/m）、實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSII）和光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）顯著高于野生型，說明其具有較強(qiáng)的光能轉(zhuǎn)化和CO2固定能力；突變體的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性均高于野生型，丙二醛（MDA）含量下降，可溶性糖和可溶性蛋白含量升高，說明抗氧化酶系統(tǒng)通過清除氧自由基降低了氧化損傷，突變體葉片細(xì)胞膜損害減輕，抗逆性增強(qiáng)；突變體的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性顯著低于野生型，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性顯著高于野生型，推測(cè)C4途徑光合酶PEPC活性的升高可能是突變體具有較高凈光合速率的原因之一?；ê笳陉幰约巴庠磭娛┛箟难酇sA和二硫蘇糖醇DTT處理表明，突變體對(duì)光強(qiáng)變化更敏感、葉片內(nèi)AsA含量及葉黃素循環(huán)效率更高。黃綠葉突變體冀麥5265yg葉片氣孔導(dǎo)度明顯改善、熱耗散降低、C4途徑光合酶活性升高，是其光合速率提高的主要原因。該結(jié)果為小麥葉色突變體高光合特性的分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

小麥；黃綠葉突變體；光合氣體交換參數(shù)；葉綠素?zé)晒鈪?shù)；酶活性

0 引言

【研究意義】葉色突變體是一類具有明顯性狀的突變體類型，它在高等植物葉綠素生物合成與代謝、葉綠體分化與發(fā)育等研究中具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，在水稻[1]、小麥[2-4]、大豆[5-6]、玉米[7]、棉花[8-9]、油菜[10-11]、大麥[12-13]等多種作物中鑒定出葉色突變體。Awan等[14]將葉色突變體分為黃化、黃綠、綠黃、綠白、白化、淺綠、白翠和條紋8種類型，其中黃綠葉突變體因?yàn)槠浞侵滤佬郧揖哂腥~色標(biāo)記應(yīng)用潛力被深入研究。關(guān)于作物中的黃綠葉突變基因也被報(bào)道，例如水稻的、、基因[15-17]、玉米的、、基因[18-20]、谷子的基因[21]、油菜的基因[22]、大麥的和基因[23-24]、小麥的和基因[25-26]。對(duì)于大多數(shù)葉色突變體來說，葉綠素合成代謝受阻、葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，會(huì)導(dǎo)致葉綠素含量下降，光合生理特性的改變甚至光合速率的不可逆降低，從而限制其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。茹廣欣等[27]對(duì)泡桐黃化突變體的研究表明，突變體葉綠素含量顯著降低，凈光合速率和蒸騰效率降低，丙二醛含量和抗氧化酶活性升高。楊小苗等[28]發(fā)現(xiàn)番茄黃化突變體的光合色素含量及葉綠素a/b比值均顯著降低，其光合參數(shù)指標(biāo)均顯著低于野生型。胡亮亮等[29]發(fā)現(xiàn)黃瓜黃綠葉突變體的光合色素和凈光合速率顯著降低，胞間CO2濃度顯著升高，葉綠素?zé)晒鈪?shù)0、m、0/m、ETR和NPQ均顯著降低。曹莉等[30]研究發(fā)現(xiàn)，小麥黃綠突變體0、m、v、qP、qN均顯著低于親本，光合效率顯著降低。但結(jié)果也不盡相同，少數(shù)水稻突變體雖然光合色素含量降低，光合速率卻顯著升高，光能轉(zhuǎn)化效率顯著增強(qiáng)。Dai等[31]研究發(fā)現(xiàn)，水稻突變體葉綠素b含量降低，雖然減少了光系統(tǒng)截獲的光能, 但相對(duì)提高了光能利用率，減少了活性氧對(duì)突變體的破壞，使其具有較強(qiáng)的耐強(qiáng)光特性。Zhou等[32]對(duì)水稻黃葉突變體研究表明，突變體表現(xiàn)較強(qiáng)的光合速率和耐光抑制的能力，PSII有效光化學(xué)量子產(chǎn)量、實(shí)際利用量子產(chǎn)額、非環(huán)式電子傳遞速率都顯著高于野生型。Deng等[33]研究發(fā)現(xiàn)，水稻黃綠突變體的光合色素較野生型降低，但其光合效率略有升高。【本研究切入點(diǎn)】目前為止，關(guān)于光合性能明顯改善的小麥葉色突變體還未見報(bào)道，試驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)突變體冀麥5265yg的光合色素比野生型降低近50%，但其凈光合速率卻顯著高于野生型，表明該突變體在小麥葉色標(biāo)記和高光效育種中具有較大的應(yīng)用價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以野生型冀麥5265和黃綠突變體冀麥5265yg為材料，分析光合色素、光合速率、熒光參數(shù)以及光合關(guān)鍵酶活性，闡明突變體高光合速率的生理機(jī)制，為小麥高光效育種實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用的突變體冀麥5265yg是小麥品種冀麥5265幼胚愈傷組織培養(yǎng)得到的再生系。經(jīng)過連續(xù)多代自交，冀麥5265yg的黃綠葉性狀能穩(wěn)定遺傳。本試驗(yàn)所用材料為M7代，因此黃綠突變體冀麥5265yg除了葉色改變之外，其他遺傳背景與親本冀麥5265完全相同。大田試驗(yàn)于2017—2018年小麥生長(zhǎng)季種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)管村試驗(yàn)站，試驗(yàn)田地力均一、肥力及水澆條件好。野生型和突變體各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積為 1.5 m×6.0 m，行距25 cm，每行60粒種子。生育期內(nèi)按常規(guī)栽培措施進(jìn)行管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光合色素含量測(cè)定 參照Lichtenthaler[34]研究方法，用LAMBDA 25紫外/可見分光光度計(jì)（Perkin Elmer）測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。取4周幼苗的第2片頂葉，將葉片剪碎混勻，稱取0.2 g置于研缽中，加入96%的乙醇5 ml充分研磨勻漿，將勻漿液移入離心管中，反復(fù)沖洗3次直至勻漿液無色，3 000×離心10 min。以96%乙醇作為對(duì)照，在649 nm波長(zhǎng)下測(cè)定葉綠素a的OD值，665 nm波長(zhǎng)下測(cè)定葉綠素b的OD值，在470 nm下測(cè)定類胡蘿卜素的OD值。葉綠素a的濃度Ca（μg·mL-1）= 13.95×A665-6.88×A649；葉綠素b的濃度Cb（μg·mL-1）= 24.96×A649-7.32×A665；類胡蘿卜素的濃度Cc（μg·mL-1）=（1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb）。

1.2.2 光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線的測(cè)定 開花期，在晴天上午9：00—11：00，利用LI-6400便攜式光合作用測(cè)定儀（Li-Cor Inc，USA），每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取3株小麥旗葉，3個(gè)小區(qū)即3次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行測(cè)量。使用紅、藍(lán)光源，光強(qiáng)從0—2 000 μmol·m-2·s-1設(shè)置14個(gè)光照強(qiáng)度（0、25、50、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 μmol·m-2·s-1），CO2濃度恒定為 400 μmol·mol-1，濕度為大氣中的濕度，進(jìn)行光合速率對(duì)光強(qiáng)的響應(yīng)。設(shè)置13個(gè)CO2濃度梯度（25、50、100、150、200、250、300、350、400、600、800、1 000、1 200 μmol·mol-1），光強(qiáng)恒定為1 200 μmol·m-2·s-1，測(cè)量光合速率對(duì)CO2濃度的響應(yīng)。用葉子飄[35]的方法模擬計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn)等特征參數(shù)。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 采用PAM-100便攜式葉綠素?zé)晒鈨x（WALZ，Germany）測(cè)定旗葉的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線和快速光響應(yīng)曲線。材料需暗適應(yīng)30 min后進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)測(cè)定6片旗葉，計(jì)算平均值。參照黃小輝等[36]的方法，m/0是PSⅡ的電子傳遞速率、v/0表示PSⅡ的潛在活性，v/m表示PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率，ΦPSII為實(shí)際光化學(xué)效率，qP為光化學(xué)淬滅系數(shù)，NPQ為非光化學(xué)粹滅系數(shù)。其中，v/m=(m-0)/m；ΦPSII=(m'-s)/m'；qP=(m'-s)/ (m'-0')；NPQ=(m-m')/m'。測(cè)定葉綠素?zé)晒饪焖夙憫?yīng)曲線時(shí)，光強(qiáng)設(shè)置為0、20、60、100、300、500、600、800、1 000、1 200、2 000、3 000 μmol·m-2·s-1，時(shí)間20 s。

1.2.4 主要生理指標(biāo)與光合關(guān)鍵酶活性測(cè)定 于拔節(jié)期、開花期和灌漿期，分別對(duì)野生型冀麥5265和黃綠突變體冀麥5265yg葉片生理指標(biāo)（丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、可溶性糖、可溶性蛋白），以及光合作用關(guān)鍵酶（Rubisco、PEPCase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活性）進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)材料5—10株，取主莖穗上的新展葉稱0.2 g，洗凈用濾紙擦干剪碎，按照m/v=1﹕9比例加入生理鹽水，冰浴研磨后2 500×離心10 min，收集上清液稀釋至2%濃度的組織勻漿待測(cè)。采用商用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定（南京建成生物工程研究所，江蘇，中國(guó)），參照說明書進(jìn)行操作，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 可溶性糖的HPLC測(cè)定 稱取拔節(jié)期小麥完全展開葉0.1 g，加入1 mL 50%的乙醇溶液（含0.1 mmol·L-1HCl），用研磨棒勻漿，12 000 r/min 離心15 min。取上清液用0.22 μm 濾膜過濾備用，每個(gè)樣品設(shè)置基因型10個(gè)重復(fù)。使用LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜分析儀進(jìn)行分析。液相色譜分離柱為IntertsilOSD- 3C18，流動(dòng)相A為5%乙腈水溶液含0.1%甲酸；流動(dòng)相B為100%乙腈含0.1%甲酸。梯度洗脫法，流速0.3 mL·min-1，質(zhì)譜在陽離子電噴霧模式下運(yùn)行（電壓為4.5 kV）。碎片化和掃描采用Full MS/MS 法，數(shù)據(jù)采集和處理使用Xcalibur 2.1軟件。定量由已知濃度的外部標(biāo)準(zhǔn)糖混合物計(jì)算。

1.2.6 遮陰及外源噴施抗壞血酸（AsA）和二硫蘇糖醇（DTT）處理的具體方法 處理時(shí)期為抽穗期至開花期。遮陰處理：以自然光為對(duì)照，搭建透光率為30%的黑色遮陽網(wǎng)處理，確保光照強(qiáng)度小于500 μmol·m-2·s-1。遮陽網(wǎng)距地面1.6 m，通風(fēng)條件良好，網(wǎng)內(nèi)外無溫差。處理時(shí)長(zhǎng)10 d，采集葉片光合指標(biāo)，后恢復(fù)光照3 d，再次測(cè)定。外源AsA和DTT噴施處理：采用AsA（1.5 mmol·L-1）和DTT（3 mmol·L-1）噴施小麥葉面，以清水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。噴施時(shí)間為下午5：00，連續(xù)處理3 d。于第4天早上9：00采集光合指標(biāo)，每個(gè)處理選取5株小麥旗葉葉片，清洗、表面晾干后進(jìn)行測(cè)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel或 SAS8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行；作圖采用Excel軟件。

2 結(jié)果

2.1 黃綠葉色性狀的表型及光合色素含量差異

冀麥5265yg是由小麥品種冀麥5265的幼胚愈傷組織培養(yǎng)得到的再生系，該突變體除了葉色改變之外，其他遺傳背景與野生型完全相同。突變體葉片從萌發(fā)即表現(xiàn)黃色，分蘗期幼苗的葉片為淺黃色（圖1-A），隨著生長(zhǎng)發(fā)育葉片由淺黃色轉(zhuǎn)變成黃綠色，一直持續(xù)到收獲期（圖1-B）。

A：野生型冀麥5265（左）和突變體冀麥5265yg（右）苗期表型。B：突變體冀麥5265yg（左）和野生型冀麥5265（右）灌漿期表型。標(biāo)尺為1.0 cm

為了進(jìn)一步明確突變表型，試驗(yàn)測(cè)定光合色素含量。正常光照條件下，突變體的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量為野生型的61.3%、41.9%和57.3%，類胡蘿卜素含量差異不顯著。由于突變體Chlb含量降低的程度大于葉綠素a，因此Chla/b比值明顯高于野生型（表1）。結(jié)果表明，冀麥5265yg主要是由于葉綠素含量降低而表現(xiàn)出葉片顏色變淺。

2.2 光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線比較

CO2濃度恒定為400 μmol·m-2·s-1，一定光強(qiáng)范圍內(nèi)，野生型冀麥5265和突變體冀麥5265yg的光合速率隨光強(qiáng)增大呈上升趨勢(shì)。當(dāng)光強(qiáng)達(dá)500 μmol·m-2·s-1前，突變體光合速率低于野生型，而光強(qiáng)在500至2 200 μmol·m-2·s-1范圍內(nèi)，突變體的光合速率高于野生型，光照強(qiáng)度越大兩者差異越顯著（圖2-A）。在溫度為25℃、光照強(qiáng)度恒定為1 500 μmol·m-2·s-1下，野生型冀麥5265和突變體冀麥5265yg的光合速率隨CO2濃度的增加呈上升的趨勢(shì)，且在相同CO2濃度下突變體光合速率始終高于野生型（圖2-B）。說明突變體的光合機(jī)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，對(duì)強(qiáng)光更敏感，在強(qiáng)光下的光合速率更高。

表1 冀麥5265和冀麥5265yg葉片光合色素含量測(cè)定（鮮重）

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，3次重復(fù)。同列數(shù)據(jù)后，不同小寫字母表示處理間差異顯著（＜0.05）。下同

Data are means ± SD. In the same columns, different small letters indicate significant difference after pairwise comparisons according to Duncan’s multiple test (＜0.05). The same as below

圖2 開花期冀麥5265和冀麥5265yg的光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線

通過響應(yīng)曲線計(jì)算特征參數(shù)（表2），突變體的表觀量子效率（AQY）、最大凈光合速率（n-max）、光飽和點(diǎn)（LSP）、光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）和暗呼吸速率（Rd）等特征參數(shù)分別比野生型高7.47%、55.96%、15.69%、50.97%和56.56%。較高的表觀量子效率和光飽和點(diǎn)，說明冀麥5265yg在光合作用中具有較強(qiáng)的光能轉(zhuǎn)換能力，對(duì)強(qiáng)光的適應(yīng)性更強(qiáng)。同時(shí)，較高的光補(bǔ)償點(diǎn)和暗呼吸速率說明突變體對(duì)弱光的利用能力較差。同時(shí)，突變體的羧化效率（CE）、飽和CO2濃度（I-sat）和光呼吸速率（Rp）均高于野生型，說明冀麥5265yg的光合電子傳遞和磷酸化活性、加氧酶活性較高，對(duì)CO2的同化能力和利用效率增強(qiáng)。

2.3 光合氣體交換參數(shù)分析

突變體在各生育時(shí)期的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均高于野生型（表3）。突變體的凈光合速率在拔節(jié)期、開花期和灌漿期分別比野生型高29.52%、22.34%和6.54%，且顯著差異。氣孔導(dǎo)度比野生型高7.69%、73.68%和18.52%，胞間CO2濃度比野生型高1.63%、6.86%和11.35%，蒸騰速率比野生型高9.59%、12.52%和19.93%。隨著生育時(shí)期的推進(jìn)，二者的光合特性指標(biāo)呈先上升后下降的趨勢(shì)，開花期達(dá)到最大值。

表2 開花期冀麥5265和冀麥5265yg旗葉的特征參數(shù)

2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析

分析拔節(jié)期、開花期和灌漿期旗葉的熒光特性，結(jié)果顯示突變體冀麥5265yg的初始熒光0顯著低于野生型。0為光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心全部開放時(shí)的熒光水平，與葉綠素含量密切相關(guān)，分析葉綠素含量減少是導(dǎo)致0降低的主要原因。此外，突變體v/m、ΦPSⅡ和qP顯著高于野生型，表明PSll反應(yīng)中心光能轉(zhuǎn)換效率和原初光能捕獲效率較高，PSⅡ天線色素吸收光能并用于光合電子傳遞的量子產(chǎn)額較大、非環(huán)式電子傳遞速率較高。同時(shí)，突變體的NPQ明顯較低，說明其PSⅡ天線色素吸收的光能以熱形式耗散較少（表4）。

由圖3可以看出，實(shí)際光量子效率（ΦPSⅡ）和光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）隨光強(qiáng)的增加呈下降趨勢(shì)，而相同光強(qiáng)下突變體顯著高于野生型。表觀電子傳遞速率（ETR）和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）則隨著光強(qiáng)增加呈上升趨勢(shì)，相同光強(qiáng)下突變體的ETR顯著高于野生型，NPQ顯著低于野生型。結(jié)果表明突變體表現(xiàn)出電子傳遞和光能分配的優(yōu)勢(shì)，獲得較高的光能轉(zhuǎn)化效率，彌補(bǔ)了光能吸收不足且對(duì)光抑制的敏感性降低，使其區(qū)別于其他葉色突變體，表現(xiàn)出較強(qiáng)的碳同化和電子流，較高的光能利用效率，該結(jié)果與突變體冀麥5265yg具有較高凈光合速率的檢測(cè)結(jié)果一致。

表3 不同生育時(shí)期冀麥5265和冀麥5265yg旗葉的光合特性

數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異達(dá)到顯著水平（＜0.05）。下同

Data are means ±SD of 5 replicates. *, significant level at＜0.05. The same as below

表4 野生型冀麥5265和突變體冀麥5265yg的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)

數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，** 表示差異達(dá)到極顯著水平（＜0.01）

Data are means±SD of 5 replicates. ** significant level at＜0.01, test by Ducan

2.5 抗氧化酶活性和丙二醛含量分析

抗氧化酶活性和丙二醛含量檢測(cè)如圖4所示，突變體冀麥5265yg SOD的活性在拔節(jié)期、開花期和灌漿期分別為267.22、215.49和233.52 U·mL-1，比野生型高15.17%、10.33%和11.25%。CAT活性也顯著高于野生型，分別為野生型的1.14倍、1.20倍和1.26倍。拔節(jié)期和開花期突變體POD活力低于野生型，但灌漿期其活力略高于野生型。MDA的含量分析表明，突變體在拔節(jié)期、開花期和灌漿期MDA含量分別為7.68、8.73和6.09 nmol·mL-1，比野生型降低了22.03%、17.49%和20.70%，且兩者間達(dá)到顯著性差異。結(jié)果說明突變體具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能及時(shí)地清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，減少質(zhì)膜的氧化。

2.6 可溶性糖和可溶性蛋白分析

對(duì)可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著性分析表明，突變體的可溶性糖含量分別為492.00、516.04和463.88 μg·mL-1，顯著高于野生型。隨著小麥的發(fā)育進(jìn)程，突變體可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，而野生型則呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，除了開花期，突變體可溶性蛋白也顯著高于野生型（圖5）。

為了進(jìn)一步分析可溶性糖種類和含量變化，分別對(duì)拔節(jié)期突變體和野生型葉片中單糖、雙糖和三糖進(jìn)行RP-HPLC分析，結(jié)果見表5。突變體中的4種可溶性糖，包括葡萄糖、果糖、蔗糖和松三糖的含量均高于野生型。其中葡糖糖和果糖差異不顯著，松三糖和蔗糖差異顯著。可溶性糖和可溶性蛋白作為碳同化有機(jī)產(chǎn)物，其含量的增加進(jìn)一步證實(shí)了突變體葉片的高光合性能。

2.7 光合碳同化途徑關(guān)鍵酶活性分析

隨著小麥的發(fā)育進(jìn)程，Rubisco酶和PEPC酶活性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)（圖6）。與野生型相比，突變體Rubisco的活性顯著低于野生型，而PEPC酶的活性則顯著高于野生型。光合關(guān)鍵酶Ca2+-ATPase的活性變化呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，Mg2+-ATPase活性則先升高后降低。拔節(jié)期和開花期突變體Ca2+- ATPase和Mg2+-ATPase的活性顯著低于野生型，但灌漿期其Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase的活性顯著高于野生型。

圖4 冀麥5265與冀麥5265yg旗葉抗氧化酶活性和丙二醛含量

圖5 冀麥5265與冀麥5265yg旗葉可溶性糖和可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化

表5 冀麥5265和冀麥5265yg葉片中可溶性糖的種類和含量

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，10次重復(fù) Data are means±SD of 10 replicates

圖6 冀麥5265與冀麥5265yg旗葉光合碳同化關(guān)鍵酶的活性變化

2.8 遮陰和外源噴施抗壞血酸（AsA）及二硫蘇糖醇（DTT）處理對(duì)冀麥5265和冀麥5265yg光合特性的影響

為了研究光照強(qiáng)度對(duì)黃綠葉色的影響，抽穗期對(duì)突變體冀麥5265yg和野生型冀麥5265在大田條件下進(jìn)行遮陰處理，發(fā)現(xiàn)突變體葉片顏色逐漸復(fù)綠，但始終比野生型略淺，說明遮陰能促進(jìn)其葉綠素含量補(bǔ)償性合成。由于遮陰處理后，光照強(qiáng)度只有正常光照的1/3，因而嚴(yán)重影響了植物葉片的光合性能，凈光合速率和氣孔導(dǎo)度均顯著下降。野生型光合速率和氣孔導(dǎo)度比對(duì)照葉片降低20.72%和26.31%，突變體凈光合率和氣孔導(dǎo)度比對(duì)照葉片分別降低39.48%和66.67%，說明突變體比野生型對(duì)光強(qiáng)變化更敏感，屬于光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)綠型突變體。經(jīng)過10 d處理后恢復(fù)生長(zhǎng)3 d重新測(cè)定光合參數(shù)發(fā)現(xiàn)，突變體和野生型的光合性能明顯升高，且突變體的凈光合速率高于野生型，說明突變體的修復(fù)和代償功能較好（表6）。

葉黃素循環(huán)在作物光合作用和葉片光合色素穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，依賴于葉黃素循環(huán)的熱耗散是防御光抑制的主要途徑。為了研究野生型和突變體葉黃素循環(huán)是否存在差異，對(duì)小麥旗葉進(jìn)行外源噴施抗壞血酸（AsA）和二硫蘇糖醇（DTT）處理，測(cè)量其光合指標(biāo)。AsA作為葉黃素循環(huán)組分紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶（VDE）的輔酶，對(duì)保護(hù)光合機(jī)構(gòu)及光合調(diào)節(jié)過程起重要作用，保持較高含量的AsA能更高效地清除過量的活性氧（ROS）。AsA處理后野生型葉片的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度比對(duì)照增加了23.63%和50.00%。但突變體葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度卻比對(duì)照減少了43.50%和50.00%。外源AsA處理改善了野生型的光合特性，但抑制了突變體的光合性能，推測(cè)可能與突變體葉片內(nèi)本身含有較高的AsA有關(guān)。DTT作為VDE專一性抑制劑，抑制花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)組分的生成。外施DTT使葉黃素循環(huán)受阻，光合作用下降，氣孔導(dǎo)度降低，不能正常耗散光能，光合器官受損傷。野生型的光合速率和氣孔導(dǎo)度比對(duì)照葉片降低了45.30%和15.79%，突變體的凈光合率和氣孔導(dǎo)度比對(duì)照葉片分別降低了31.68%和27.27%。結(jié)果表明，野生型與突變體葉黃素循環(huán)效率存在差異，具體原因還需進(jìn)一步分析。

3 討論

3.1 葉色突變對(duì)冀麥5265yg的光合性能的影響

氣孔特性的改善對(duì)小麥光合作用的提高有重要作用，突變體冀麥5265yg的氣孔導(dǎo)度顯著高于野生型，開花期突變體的氣孔導(dǎo)度比野生型高73.68%。氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度的增加，為突變體同化作用提供更高的CO2供應(yīng)。雖然突變體因葉綠素含量降低限制了其對(duì)光能的捕獲，但電子傳遞速率（ETR）顯著提高，自然光下的高電子流速有利于RuBP的再生（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶催化CO2生成核酮糖-1,5-二磷酸），從而保證了較高的光合速率。研究表明，將C4作物玉米的PEPCase基因超表達(dá)轉(zhuǎn)入水稻后，轉(zhuǎn)基因水稻的氣孔導(dǎo)度增加，光合速率提高[37]。歐立軍[38]研究發(fā)現(xiàn)，水稻葉色突變體標(biāo)810S中PEPC活性顯著高于野生型，其凈光合速率和氣孔導(dǎo)度均顯著升高。與前人研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)突變體冀麥5265yg的C4光合酶PEPC也具有較高的活性，說明突變體能更有效地固定CO2，推測(cè)C4途徑的光合關(guān)鍵酶PEPC活性的升高可能是冀麥5265yg維持較高凈光合速率的原因之一。

表6 不同處理?xiàng)l件下冀麥5265和冀麥5265yg葉片光合指標(biāo)的比較

3.2 葉色突變對(duì)冀麥5265yg熱耗散（NPQ）的影響

植物光合作用吸收的光能一部分轉(zhuǎn)化成化學(xué)能貯存在體內(nèi)，還有相當(dāng)一部分通過各種形式耗散掉。當(dāng)光能被PSⅡ吸收后，一部分用于光合作用（ΦPSII），另外一部分以熒光的形式重發(fā)射（ΦNQ）和非輻射能量耗散（ΦNPQ）。非光化學(xué)猝滅（NPQ）表示以熱能途徑耗散的光能，即熱耗散。熱耗散作為植物葉片重要的光防御機(jī)制，在維持光能轉(zhuǎn)化平衡中起著重要作用[39]。熱耗散的誘導(dǎo)受跨類囊體膜ΔpH、葉黃素循環(huán)和PsbS蛋白的調(diào)控[40]。熱耗散發(fā)生在光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的捕光色素復(fù)合體（LHCⅡ）內(nèi)，葉黃素循環(huán)的激活和LHCⅡ蛋白的聚集導(dǎo)致了光系統(tǒng)II中NPQ的形成，中間經(jīng)歷跨類囊體膜質(zhì)子梯度ΔpH形成、LHCⅡ質(zhì)子化、紫黃素去環(huán)氧化、LHCⅡ構(gòu)象轉(zhuǎn)換等過程。本研究顯示，突變體冀麥5265yg在吸收能的分配上與野生型不同。突變體冀麥5265yg的v/M和ΦPSⅡ均顯著高于野生型，qP和NPQ分別是野生型的106%和52%，說明突變體 PSⅡ反應(yīng)中心將更多光能的分配用于光合作用，推測(cè)較低的熱耗散是突變體光合速率提高的另一個(gè)重要原因。此外，NPQ依賴于葉黃素的循環(huán)，利用紫黃質(zhì)去環(huán)化酶的輔助因子AsA和紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶抑制劑DTT處理突變體和野生型葉片的結(jié)果進(jìn)一步表明，二者葉黃素循環(huán)效率存在差異，推測(cè)這可能是NPQ降低的直接因素。

3.3 葉色突變對(duì)冀麥5265yg抗氧化性能力的影響

在正常條件下，植物細(xì)胞的多種代謝反應(yīng)均會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），低濃度的ROS作為重要信號(hào)分子，參與生物與非生物逆境脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)。在逆境條件下，植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，高濃度的ROS對(duì)植物產(chǎn)生毒害，造成包括DNA、蛋白和膜脂等結(jié)構(gòu)分子的氧化傷害，導(dǎo)致MDA含量的增多。為有效防止ROS的氧化損傷，植物形成了一套有效的活性氧防御機(jī)制，以維持其體內(nèi)活性氧的濃度范圍?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍椎暮坑欣谥参镌谀婢诚戮S持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能正常運(yùn)行。因此SOD活性、POD活性、MDA含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量成為植物細(xì)胞氧化損傷、植物抗性強(qiáng)弱的生理生化指標(biāo)。本研究顯示，突變體SOD和CAT活性在各個(gè)階段都高于野生型，突變體的MDA含量較野生型明顯下降，可溶性糖含量和可溶性蛋白明顯升高。說明突變體抗氧化酶SOD、CAT和POD通過清除氧自由基降低了氧化損傷，葉片細(xì)胞膜受到的傷害程度低，其抗逆性比野生型強(qiáng)。

4 結(jié)論

對(duì)冀麥5265yg的光合生理研究發(fā)現(xiàn)，突變體葉綠素含量低于野生型，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率高于野生型；PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率和實(shí)際光化學(xué)效率高于野生型，非光化學(xué)淬滅系數(shù)低于野生型；SOD和CAT活性在各個(gè)階段都高于野生型，可溶性糖和可溶性蛋白含量明顯升高，MDA含量明顯下降；光合關(guān)鍵酶Rubisco的活性顯著低于野生型，而PEPC酶活性則顯著高于野生型。結(jié)果表明，冀麥5265yg的凈光合速率提高，抗氧化能力增強(qiáng)，為一種新型小麥黃綠葉突變體。該研究結(jié)果為小麥葉色突變體的光合生理特性研究提供了理論基礎(chǔ)，為小麥高光效育種的應(yīng)用提供參考依據(jù)。此外，突變體冀麥 5265yg 黃綠葉特性可作為標(biāo)記性狀，直接應(yīng)用于雜交小麥育種。

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Photosynthetic and Physiological Characteristics Analysis of Yellow- Green Leaf Mutant in Wheat of Jimai5265yg

ZHENG Wei, SHI Zheng, LONG Mei, LIAO YunCheng

College of Agriculture, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi

【】Leaf color mutants are ideal materials for studying chlorophyll synthesis, chloroplast development and photosynthesis.In order to clarify the regulation mechanism of photosynthesis and lay a foundation for the further utilization of wheat yellow-green leaf mutants, the photosynthetic physiological characteristics of wheat were studied.【】The wild type jimai5265 and the mutantJimai5265yg were used as test materials. The phenotype of leaf color was observed, the chlorophyll content and enzyme activity were measured by spectrophotometer and kit, respectively. The photosynthetic characteristics and chlorophyll fluorescence parameters were determined by the Li-6400 portable photosynthetic apparatus and PAM100 modulated chlorophyll fluorometer.】The results of phenotypic observation and pigment content showed that the leaves ofthe mutant were yellow-green at seedling stage, and gradually changed to light green after heading stage. Leaf color of the mutant was partly recovered by shading treatment, but it was slightly lighter than the wild type, which indicated that it belonged to the mutants of light induced to promote greening. The content of chlorophyll a and b in the mutant leaves was significantly reduced, and the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b was increased, indicating that Jimai5265yg was a typicalchlorophyll deficient mutant. The light response curves and CO2response curve displayed that surface sight-seeing quantum efficiency (AQY), light saturation point (LSP), maximum net photosynthetic rate (n-max), light compensation point (LCP), dark respiration rate (Rd), spindle efficiency (CE) and saturated CO2concentration (Isat) of the mutant was significantly higher than the wild type, indicating thatthe mutant had quite stable the photosynthetic mechanism and higher photosynthetic rate under the strong light; The photosynthetic gas exchange parameters and chlorophyll fluorescence kinetic parameters indicated that the net photosynthetic rate (n), transpiration rate (r), stomatal conductance (s), photochemical quantum efficiency (v/m), the actual photochemical efficiency (Φ PSII) and light chemical quenching coefficient (qP) of the mutant were significantly higher compared with the wild type, which showed that Jimai5265yg had the ability of strong light energy conversion and CO2fixation; The content of malondialdehyde (MDA) in mutant was decreased significantly, while the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), as well as the content of soluble sugar and soluble protein, were significantly increased. The results indicated that the antioxidant enzyme system could reduce oxidative damage by scavenging oxygen free radicals. The damage degree of cell membrane in the mutant leaf was reduced and its stress resistance was enhanced. The activity of ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) in mutant was significantly lower, while the activity of the phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) was significantly higher than that of the wild type. It was speculated that the increased activity of the C4pathway photozyme PEPC might be the key factor for the higher net photosynthetic rate of the mutant. Post-flowering shading and exogenous spraying of Ascorbic acid and dithiothreitol DTT showed that the mutants were more sensitive to change of light intensity, and the content of AsA in leaves and the efficiency of xanthophyl cycle were higher.【】Improvement of stomatal conductance, decrease of heat dissipation and increase of C4pathway photozyme activity in yellow green leaf mutant Jimai5265yg were the main reasons for the increase of photosynthetic rate. These results laid the foundation for the molecular regulation of high photosynthesis properties of wheat leaf mutants.

wheat; yellow-green leafmutant; photosynthetic gas exchange parameters; chlorophyll fluorescence parameter; enzyme activity

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.005

2021-01-25；

2021-04-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31871618）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0100706）、陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021NY-082）

鄭偉，E-mail：zwalhx@126.com。通信作者廖允成，E-mail：yunchengliao@163.com

（責(zé)任編輯 楊鑫浩）