鯉mstn 基因RNA 干涉載體構(gòu)建與檢測分析

閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

mstn（Myostatin，肌肉生長抑制素）基因是動物肌肉生長發(fā)育的負調(diào)控基因，敲除或抑制其表達，可使動物的肌肉快速大量增長。動物肌肉發(fā)育不僅依靠激素調(diào)節(jié)，某些組織特異性效應(yīng)因子也影響肌肉的發(fā)育。肌肉生長抑制素是目前所知最強的肌肉生長抑制因子，它通過抑制成肌細胞的增殖而發(fā)揮作用[1,2]。Myostatin 抑制肌肉生長發(fā)育的功能在“比利時藍?！焙汀氨说旅商嘏！敝械玫搅蓑炞C，他們是2個經(jīng)過長期遺傳選育得到的雙肌牛品種。“比利時藍?！本哂惺謴妷训墓趋兰。涔趋兰?shù)量是其他品種牛的4 倍；而在“彼德蒙特牛”中檢測到2 個點突變，導(dǎo)致Myostatin 功能全部或幾乎全部喪失[3-5]。以上研究結(jié)果表明，肉牛的“雙肌”現(xiàn)象是由于在骨骼肌細胞中缺少Myostatin 蛋白抑制作用的緣故。自Mcpherron 等發(fā)現(xiàn)小鼠mstn 基因以來[6]，相繼克隆了真鯛（Pagrosomus major）[7]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[8]、松江鱸（Trachidermus fasciatus）[9]、淇河鯽（Carassius auratus）[10]、加州鱸（Micropterus salmoides）[11]（Elopichthys bambusa）[12]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[13]、鱖（Siniperca chuatsi）[19]、斑鱖（S.scherzeri）[14]、鯉（Cyprinus carpio）[15]、斑馬魚（Danio rerio）[16]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[17]、大西洋鮭（Salmo salar）[18]和莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）[20]等魚的mstn 基因，說明魚類中mstn 基因分布廣泛，且都參與了肌肉的生長和發(fā)育調(diào)控。

RNA 干擾（RNA interference,RNAi）是由小片段siRNA（Small interfering RNA）介導(dǎo)的誘導(dǎo)同源mRNA 降解，從而導(dǎo)致基因表達抑制的現(xiàn)象[21]。siRNA是RNA 干涉的中間產(chǎn)物，在靶序列的識別上具有高度特異性，只降解與其序列互補配對的mRNA[22]。本研究以鯉mstn mRNA 為靶序列，篩選有效抑制鯉Myostation 基因的siRNA 分子，構(gòu)建siRNA 質(zhì)粒pzu6p-siMSTN，目的是將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)到鯉細胞內(nèi)，讓轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抑制鯉mstn 基因表達或阻斷與該基因相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA 能夠增加阻斷基因的表達時間[ 23 ]。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用受精卵取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗場性成熟的鯉親魚。轉(zhuǎn)基因鯉的飼養(yǎng)管理、樣品處理和檢測程序等均與對照組相同。

1.2 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒pzu6p-siMSTN 構(gòu)建

在鯉mstn 基因的CDS 區(qū)（GenBank:GQ214770.1）上，通過金斯瑞公司的設(shè)計軟件設(shè)計了一條含有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的干涉片段（含有BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點），長度為70 bp。合成的干涉片段構(gòu)建在puc57載體上，為puc57-siMSTN。

用限制性內(nèi)切酶Ase Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切PEGFP-C1 質(zhì)粒載體，切除質(zhì)粒上的CMV 啟動子、egfp 表達區(qū)域和sv40 終止子，獲得3 100 bp 的框架結(jié)構(gòu)，獲得帶有Ase Ⅰ和Mlu Ⅰ粘性末端的啟動子片段。通過T4 DNA 連接酶連接。獲得質(zhì)粒pzu6p-siRNA。

用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ分別雙酶切puc57-siMSTN 和pzu6p-siRNA，經(jīng)T4 連接酶連接，并轉(zhuǎn)入top 10 感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，測序驗證獲得pzu6p-siMSTN（鯉U6 啟動子干涉載體）轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒（圖1）。

圖1 鯉U6 啟動子干涉載體圖譜Fig.1 The transgenic donor plasmid of U6 promoter for common carp Cyprinus carpio

1.3 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒DNA 的提取

采用堿法裂解法提取轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒。提取單個菌落接種到含有卡娜霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃強烈震蕩培養(yǎng)過夜，離心，向沉淀物中依次加入50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉、25 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷、溶菌酶4 mg/mL、0.2 mol/L 氫氧化鈉、1%十二烷基硫酸鈉、和醋酸鉀等溶液；離心，向上清液中加入等體積酚/氯仿，混合，離心，向上清液中加入2 倍體積無水乙醇沉淀，再用70%乙醇清洗，離心，加RNA 酶和TE 溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外源基因?qū)?/h3>

在6 月繁殖季節(jié)，采用腦垂體和類似物的混合物人工催產(chǎn)，分別采集鯉卵子和精液，放入4℃冰箱中備用。每次注射時，取少量的卵子和精液授精，讓受精卵分散粘附在培養(yǎng)皿上，用國產(chǎn)可三維移動的顯微操作儀，在受精卵分裂之前進行外源基因的導(dǎo)入，每個細胞注射轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒（pzu6p-siMSTN）1 nL，供體質(zhì)粒的注射劑量為40 pg，對照鯉注射生理鹽水。注射后的受精卵放在23～24℃水簇箱中孵化。

1.5 轉(zhuǎn)基因鯉總DNA 提取

裂解液為蛋白酶K（200 μg/mL），十二烷基肌氨酸鈉（0.5%），乙二胺四乙酸二鈉（200 mmol/L，pH8.0）。幼魚整體勻漿，加入100 μL 裂解液，55℃消化，用酚、氯仿、異戊醇混合液，抽提3 次，無水乙醇沉淀，自然干燥后溶解于TE 中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 外源基因整合率的檢測

根據(jù)鯉MSTN 干涉載體序列設(shè)計引物。上游引物：CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG；下游引物：GCAAAGGCGGTGCGGGAT。

引物由上海生物工程有限公司合成。以鯉轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒pzu6p-siMSTN 為陽性對照，以對照鯉為陰性對照，進行PCR 分析。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，93℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，38 個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)程序在PE9700 上進行。擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，goldview 染色，GDS8000（UVP 公司）凝膠成像系統(tǒng)拍攝，回收轉(zhuǎn)基因陽性鯉中的目標條帶，進行測序驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的構(gòu)建

通過將真核表達載體PEGFP-C1 的啟動子進行改造，得到斑馬魚U6 啟動子的質(zhì)粒pzu6p-siRNA。然后將干涉片段siMSTN 與載體相連接，得到pzu6p-siMSTN（鯉MSTN 干涉載體）。

2.2 鯉mstn 外源基因的轉(zhuǎn)基因效果

共進行了5 批鯉受精卵的轉(zhuǎn)基因注射，共注射受精卵1 225 粒，孵出后存活720 尾，轉(zhuǎn)基因顯微注射平均存活率為58.6%，注射生理鹽水的對照組的存活率為92%（表1）。

2.3 PCR 檢測

對50 尾轉(zhuǎn)基因魚個體的基因組DNA 進行擴增，擴增片段大小在400 bp 左右（圖2）。將與供體片段一致的基因片段切下，對其中5 尾樣品的陽性擴增產(chǎn)物進行回收、克隆和測序驗證，測序結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，鯉外源基因成功插入鯉基因組中，轉(zhuǎn)基因鯉外源基因的平均整合率為36.2%（表1）。

圖2 轉(zhuǎn)鯉mstn 基因鯉的PCR 檢測分析Fig.2 The detection results of PCR for transgenic carp

圖3 轉(zhuǎn)mstn 基因鯉片段序列與供體質(zhì)?；蛐蛄斜葘ig.3 Sequence alignment of mstn gene between transgenic common carp and donor plasmid of mstn gene

表1 轉(zhuǎn)mstn 基因鯉幼魚存活率和陽性率檢測Tab.1 Survival and transgenic positive rates in common carp juveniles via microinjection with mstn gene

3 討論

不同物種之間存在種屬差異，要想啟動不同基因的表達需要種屬較為特異的啟動子啟動基因的轉(zhuǎn)錄。據(jù)文獻報道[24]，干涉片段的表達用U6 啟動子或者H1 啟動子能有效表達干涉片段，為了實現(xiàn)mstn 基因在鯉體內(nèi)沉默，使用鯉U6 啟動子最為理想。但鯉的U6 啟動子序列未知，所以本文選用了種屬差異較近的斑馬魚U6 啟動子，它具有明確的起始和終止序列，在細胞中可以表達很多小分子RNA。siRNA 表達載體依賴U6 啟動子，可控制一段45～50 nt 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin RNA，shRNA）在鯉細胞中的表達，而shRNA 在鯉細胞內(nèi)可以自動被加工成為siRNA，引發(fā)目標基因的沉默或其表達受到抑制。如劉萱等[25]利用人H1 啟動子構(gòu)建了哺乳動物細胞siRNA（small interference RNA，小干擾RNA）表達質(zhì)粒pBS/HIPS。該質(zhì)粒約有19 bp 的siRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，能夠在細胞內(nèi)自主合成，對細胞內(nèi)源性目標RNA 起到了特異性抑制作用。Sui 等[26]利用U6 啟動子構(gòu)建了可操縱的siRNA表達載體，該載體質(zhì)粒成功抑制了多種外源和內(nèi)源基因的表達。說明利用U6 啟動子引導(dǎo)產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒載體，可在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA，抑制mstn 基因的表達，可達到較高的RNAi 效應(yīng)。本研究主要是針對鯉myostatin 基因序列，構(gòu)建以斑馬魚U6 為啟動子的鯉myostatin 基因的RNA 干擾質(zhì)粒載體pzu6p-siMSTN（鯉MSTN 干涉載體）。通過酶切和測序驗證載體構(gòu)建正確性。為了能確定鯉myostatin 雙鏈RNA 是否能夠插入鯉基因組中，用人工合成的鯉MSTN 干涉載體通過顯微注射技術(shù)將pzu6p-siMSTN 基因?qū)胍磅幨芫褍?nèi)，獲得了一批轉(zhuǎn)基因鯉，PCR 檢測和測序驗證表明，外源供體基因成功插入鯉基因組中，轉(zhuǎn)基因鯉外源基因的整合率平均為36.2%。

隨著鯉基因組測序的完成，生物學(xué)研究從單個基因進入到基因組時代，利用siRNA 介導(dǎo)的RNA干擾手段，或者結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將有望成為探索魚類特定基因的功能、疾病致病機理及其防治的新途徑。Acosta 等[27]利用顯微注射技術(shù)，將具有siRNA的mstn 基因質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi)，使其MSTN 蛋白的表達受抑制，最終獲得了體形巨大的斑馬魚。Thomas 等[28]體外合成的具有發(fā)卡RNA 表達載體質(zhì)粒，利用顯微注射技術(shù)導(dǎo)入到大鼠內(nèi)，使大鼠的纖維大小增加34%，肌肉重量增加10%。在魚類育種中，雖然分子輔助育種技術(shù)和基因敲除技術(shù)（反義核苷酸技術(shù)、基因打靶技術(shù)等）較傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳育種有較多的優(yōu)點，但研究過程中投入大，群體大，耗時、效率低等缺點也有待解決。RNA 干擾技術(shù)已成為解決這些問題的重要手段。與其他方法相比，RNA 干擾技術(shù)在基因功能研究具有簡單易行、試驗周期短、成本低、可進行高通量基因功能分析及具有高度特異性等許多優(yōu)點。為了解除mstn 基因?qū)∪饧毎囊种谱饔?，本研究利用RNA 干擾技術(shù)干擾mstn mRNA 的表達，來提高養(yǎng)殖魚類肌肉含量，改善肉質(zhì)性狀，促進養(yǎng)殖魚類生長。

綜上所述，RNA 干擾技術(shù)能達到基因敲除的結(jié)果，是研究這些基因功能的良好工具。RNA 干擾技術(shù)在充滿挑戰(zhàn)的后基因時代將有廣闊的應(yīng)用前景，它將會在水產(chǎn)動物，尤其是在魚類研究中帶來一次新的技術(shù)革命。研究結(jié)果表明，這種阻礙肌肉生長抑制素的方法將有助于鯉肌肉再生能力的增強,為獲得具有特殊功能的轉(zhuǎn)基因鯉提供了新的手段，也進一步證實了轉(zhuǎn)鯉mstn 基因RNA 干擾質(zhì)粒技術(shù)是可行的育種技術(shù)之一[29]。