珍稀瀕危植物堇葉紫金牛扦插和組培繁殖

劉守贊　葉建豐　王江銘　饒盈　馬丹丹　夏國華

摘要：為了更好地保護和開發(fā)利用堇葉紫金牛（Ardisia violacea W.Z.Fang et K.Yao）這一優(yōu)良的珍稀瀕危野生植物，采用帶葉莖段和不帶葉莖段進行扦插繁殖，建立組培快繁體系，重點研究TDZ、6-BA和KT對莖段增殖培養(yǎng)的影響，優(yōu)化增殖培養(yǎng)條件。結果表明，堇葉紫金牛帶葉莖段扦插成活率及后期生長情況顯著優(yōu)于不帶葉莖段，成活率、開花植株率、結實植株率分別為93.8%、76.12%和73.17%，結實植株平均果實數為3.63粒。建立了堇葉紫金牛組培快繁體系，優(yōu)化了不定芽增殖的培養(yǎng)條件，發(fā)現TDZ增殖培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，當TDZ濃度到達0.5 mg/L時，莖節(jié)部膨大增粗至原來的2倍以上，腋芽也明顯膨大，增殖倍率達314。堇葉紫金牛扦插和組培繁殖有效地解決了繁殖材料稀缺的問題，對保護珍稀瀕危種質資源提供了一條新途徑，同時為產業(yè)化開發(fā)提供技術儲備。

關鍵詞：堇葉紫金牛;扦插繁殖;組培繁殖;細胞分裂素

中圖分類號： S793.905文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0084-05

生物多樣性是人類賴以生存的生物資源，是經濟得以持續(xù)發(fā)展的基礎。珍稀瀕危植物是生物多樣性的重要組成部分，也是生物多樣性中最為脆弱、最容易消失的物種。我國是世界上植物物種多樣性最豐富的國家之一，現有高等植物3.1萬種，約占世界總數的10%，但我國高等植物受威脅物種已達4 000～5 000種，占總種數的15%～20%，高于世界10%～15%的水平[1]。浙江省有5%～8%的植物不同程度地遭受到生存的威脅。為此，浙江省陸續(xù)開展了珍稀瀕危植物調查[2-3]、致瀕機理[4]、繁育和解瀕技術[5]以及遺傳多樣性研究[6-8]，并取得了顯著成效。

堇葉紫金牛（Ardisia violacea W.Z.Fang et K.Yao）屬于紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia Swartz），產于我國的浙江、臺灣[9-10]和安徽[11]，其株型緊湊，葉脈紋理清晰，葉綠果艷，果期長，具有極高的觀賞價值。目前對堇葉紫金牛的研究主要集中在分類學[12-13]和生物生態(tài)學特性[14]方面。劉博文等調查了舟山本島的堇葉紫金牛所在群落的物種組成并分析其群落特征[15]。馬凱等用標準樣地法和每木調查法調查了堇葉紫金牛群落和結構特征，并且研究了各個樣地內的物種多樣性[16]。而堇葉紫金牛的繁殖技術方面研究較少[17-18]。本試驗研究了堇葉紫金牛扦插繁殖和組培繁殖的相關情況，旨在為堇葉紫金牛的繁育提供技術儲備，有利于該物種脫離瀕危的現狀，為珍稀瀕危植物多樣性保護提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料與試驗地概況

堇葉紫金牛植株引自浙江省建德綠河塘林場。試驗時間為2018年10月至2019年10月，試驗地點設在浙江農林大學珍稀瀕危植物專類園。臨安地處浙江省西北部天目山區(qū)，氣候溫暖濕潤，光照充足，雨量充沛，屬中亞熱帶季風氣候。年平均氣溫16.4? ℃，1月平均氣溫為3.4 ℃，7月平均氣溫28.1 ℃，年降水量1 613.9 mm，年平均相對濕度82%，年日照時數1 847.3 h，平均無霜期237 d。

1.2試驗方法

1.2.1扦插繁殖以54 cm×28 cm育苗盤為扦插容器，下部鋪設泥炭約6 cm、上部覆蓋珍珠巖約 4 cm 作為扦插基質，插條設2個處理：帶葉莖段和不帶葉莖段，插穗具2節(jié)，長約0.8 cm，插條基部 1/3 用NAA 300 mg/L浸泡5 min。處理30根插條，重復3次。在光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照度約為250 μmol/（m2·s），光照時間為16 h/d。扦插60 d后，統計成活率，并移栽到一加侖塑料盆（口徑16 cm，底徑13 cm，高度 175 cm）中，栽培基質配比為田園土 ∶泥炭 ∶珍珠巖=1 ∶1 ∶1（體積比）。2015年5月統計開花植株比例，8月統計結實植株比例和結實植株果實數，統計平均值。

1.2.2組培繁殖將種子用洗滌劑漂洗30 min，流水沖洗10 min，然后在超凈工作臺上用70%乙醇浸泡15 s，0.1% HgCl2滅菌10～15 min，無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干材料上的水分，放入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以種子無菌萌發(fā)獲得的莖段建立組培體系。研究6-BA、KT和TDZ對莖段增殖培養(yǎng)的影響，6-BA和KT的濃度分別為0.5、1.0、20、4.0 mg/L，TDZ的濃度分別為0.1、0.2、0.5、10 mg/L，以不添加細胞分裂素為對照（CK），以上培養(yǎng)基均添加IBA 0.5 mg/L。MS基本培養(yǎng)基由 30 g/L 蔗糖和6.8 g/L瓊脂組成。每個處理10瓶，每瓶接種3個莖段，重復3次，比較不同細胞分裂素在不同濃度下對不同外植體的影響。所有增殖培養(yǎng)基中，pH值均為5.8，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃;光照度約為30μmol/（m2·s），光照時間為16 h/d。

1.2.3生根培養(yǎng)與煉苗移栽叢生芽長至4～5 cm 時，轉入生根培養(yǎng)基MS+IBA 0.25 mg/L +NAA 0.25 mg/L中進行培養(yǎng)，每株苗具5～7張葉時即可移栽。待苗高約6 cm時，植株具有2～4條健壯根，將培養(yǎng)瓶蓋打開，放到全天自然光照、溫度 25 ℃ 的通風條件下煉苗7～10 d，移栽時用鑷子將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽入已滅過菌的營養(yǎng)土中，基質配比為泥炭 ∶蛭石=1 ∶1，移栽后7～10 d用塑料薄膜保濕，保持空氣濕度85%以上，噴霧頻率為1～2次/d。

1.3數據分析

所有數據均采用Excel 2016和SPSS 25.0進行統計分析。

2結果與分析

2.1堇葉紫金牛扦插繁殖

由表1、圖1可知，堇葉紫金牛帶葉莖段和不帶葉莖段扦插成活及生長結實均具有顯著性差異。帶葉莖段扦插成活率、次年開花結實植株率顯著高于不帶葉莖段。帶葉莖段插穗生根早、植株健壯，扦插成活率高達93.80%，次年開花植株、結實植株率分別達到76.12%、73.17%，結實植株平均果實數3.63粒。扦插后15 d左右開始在切口基部發(fā)生2～3條白色新根，25 d后新芽萌發(fā)，根系生長迅速，此后根系植株生長健壯。不帶葉莖段插穗生根、萌芽均較遲，植株細弱，成活率較低，為8560%，次年開花植株、結實植株率和結實植株平均果實數明顯較低，分別為18.42%、1333%和1.17粒。

2.2堇葉紫金牛組培繁殖

2.2.1堇葉紫金牛組培繁殖體系建立將由種子萌發(fā)和腋芽生長形成的莖段剪成帶2～3個芽的莖段，接入MS+6-BA 0.1～3.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L中進行培養(yǎng)，發(fā)現莖段僅頂端1個腋（頂）芽萌發(fā)。待芽長至4～6 cm時，轉入生根培養(yǎng)基MS+IBA 025 mg/L+NAA 0.25 mg/L中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)約15 d開始出現新根，生根率達95%以上，待苗長出 2～4條/株長約5 cm的健壯新根，苗高約6 cm，具葉5～7張/株時移栽（圖2）。

2.2.2不同細胞分裂素對堇葉紫金牛莖段增殖培養(yǎng)的影響由于堇葉紫金牛莖段增殖較為困難，因此采用不同細胞分裂素種類和濃度對堇葉紫金牛進行培養(yǎng)，研究對其增殖培養(yǎng)的影響。由圖3、表2可知，細胞分裂素種類對堇葉紫金牛莖段增殖培養(yǎng)存在顯著性差異。在增殖培養(yǎng)后59 d時，TDZ對堇葉紫金牛莖段增殖的作用效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，在0.1～0.5 mg/L 的濃度范圍內，隨著TDZ濃度的升高，莖段的增殖倍率增大，當濃度到達 0.5 mg/L 時，增殖倍率最高，達到3.14，同時莖節(jié)部

膨大增粗至原來的2倍以上，腋芽也明顯膨大;當濃度到達1.0 mg/L時，增殖倍率下降到3.10。而在未添加任何細胞分裂素的CK中，增殖倍率僅為060，植株較矮小，腋芽不明顯。

由圖3、表2還可知，6-BA、KT的培養(yǎng)基中頂端1芽萌發(fā)，其他腋芽極少萌發(fā)，增殖倍率均未達到1。在0.5～1.0 mg/L濃度范圍中，增殖倍率隨著6-BA濃度的增大而增加，當6-BA濃度達到1.0 mg/L時，增殖倍率開始下降，且下降幅度較大，當6-BA濃度達到4.0 mg/L以上，增殖倍率僅為0.1，腋芽成為極度縮短的莖，莖節(jié)部明顯膨大增粗，且植株不伸長生長。隨著KT濃度的升高（0.5～1.0 mg/L范圍），莖段的增殖倍率反而減小，當濃度達到 1.0 mg/L 后，增殖倍率又略微增加。

3討論與結論

堇葉紫金牛扦插繁殖以帶葉莖段插穗成活率較高，達到93.80%，不帶葉莖段較低，為85.60%，均能滿足生產上的應用。葉才華等對矮紫金牛進行不同留葉量扦插繁殖的試驗，發(fā)現帶葉莖段和不帶葉莖段的扦插成活率均在85%左右[19]，低于本試驗結果，這可能是受不同紫金牛物種和不同扦插條件影響。因此，在繁殖材料較少的條件下，不帶葉的堇葉紫金牛莖段也能用作插穗，但扦插成活后生長較差，開花結實推遲。

植物生長調節(jié)劑的種類和濃度是植物組織培養(yǎng)中芽誘導、增殖以及生長發(fā)育的關鍵因素，細胞分裂素、生長素能明顯促進腋芽啟動和增殖生長，常用的細胞分裂素有6-BA、NAA、TDZ等[20]。研究表明，6-BA 對不定芽誘導起主導作用，添加適量的6-BA有利于不定芽的形成[21-22]。本試驗建立了堇葉紫金牛組培快繁技術體系，發(fā)現堇葉紫金牛添加 6-BA 誘導芽增殖困難，重點研究了不同細胞分裂素種類和濃度對堇葉紫金牛莖段增殖培養(yǎng)的影響，結果表明，3種不同種類和濃度的細胞分裂素對堇葉紫金牛培養(yǎng)影響差異較大，在含有TDZ細胞分裂素的培養(yǎng)基中，莖節(jié)部和腋芽明顯膨大，增殖倍率均在2以上，增殖效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，而 6-BA 在一定濃度范圍內的增殖效果要顯著優(yōu)于KT，這與孫駿威等的研究結果[23]類似。孫英坤等對堇葉紫金牛組培快繁研究發(fā)現，最佳叢生芽誘導增殖培養(yǎng)基為改良MS（硝酸鉀含量1 200 mg/L，其他組分不變）+ TDZ 0.50 mg/L + NAA 0.10 mg/L[18]，這與本研究結果一致，也與前人在元寶楓、藍莓等增殖培養(yǎng)中TDZ的應用效果[24-26]一致。

堇葉紫金牛帶葉莖段和不帶葉莖段存在顯著性差異，帶葉莖段扦插成活率及后期生長情況顯著優(yōu)于不帶葉莖段，成活率、開花植株率、結實植株率分別為93.8%、76.12%和73.17%，結實植株平均果實數為3.63粒。建立了堇葉紫金牛組培快繁體系，并且優(yōu)化了不定芽增殖的培養(yǎng)條件，TDZ是堇葉紫金牛莖段增殖效果最佳的細胞分裂素，當TDZ濃度到達0.5 mg/L時，增殖效果最佳，增殖倍率達到3.14。

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基金項目：浙江省自然科學基金（編號：LY16C030004、LQ17C160005）;浙江省林業(yè)局林業(yè)發(fā)展和資源保護專項（編號：浙林規(guī)〔2019〕90號）。

作者簡介：劉守贊（1979—），男，河北武強人，碩士，講師，主要從事植物資源開發(fā)利用研究。E-mail：szliu@zafu.edu.cn。

通信作者：夏國華，碩士，副教授，主要從事植物資源開發(fā)利用研究。E-mail：zjfc_ghxia@126.com。