ω－６多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物 ４－羥基壬烯醛的研究進(jìn)展

馬晶晶　孫沖　張牧焓　耿志明　王道營　徐為民

摘要：4-羥基壬烯醛（HNE）是ω-6 多不飽和脂肪酸（PUFAs）的氧化產(chǎn)物，研究表明HNE具有生理和病理學(xué)作用，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。就HNE的形成機(jī)制、形態(tài)分布、代謝、病理和生理學(xué)意義、檢測方法、安全問題等進(jìn)行綜述，并對提升食品營養(yǎng)風(fēng)味、減少HNE形成的新型食品加工方法進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：4-羥基壬烯醛;ω-6 多不飽和脂肪酸;氧化;HNE形成機(jī)制;病理學(xué)意義;生理學(xué)意義;HNE檢測

中圖分類號： TS201.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0057-07

生物膜磷脂的多不飽和脂肪酸（PUFAs）在酶、自由基等作用下，發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一系列復(fù)雜產(chǎn)物，如氫過氧化物、醇、酮、醛等[1]。內(nèi)源性4-羥基壬烯醛（HNE）來源于生物體內(nèi)ω-6 PUFAs的氧化，是體內(nèi)脂質(zhì)氧化最具代表性的醛類產(chǎn)物[2]?，F(xiàn)有研究表明，HNE具有降低或抑制酶活、修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)胞正常功能、損傷細(xì)胞組分等作用[3];內(nèi)源性HNE與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如炎癥、動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、帕金森綜合癥和阿爾茲海默病等[4]。因此，HNE相關(guān)研究一直是病理和生理學(xué)研究的熱點。

除了內(nèi)源性HNE，外源性HNE也廣泛存在于富含油脂的食品中[5]。研究表明，通過食物攝取進(jìn)入體內(nèi)的HNE，能夠發(fā)揮內(nèi)源性HNE同等的生理作用[6]。近年來，隨著食品中HNE的發(fā)現(xiàn)，其形成機(jī)制、形態(tài)分布及潛在的安全危害也引起了人們廣泛關(guān)注。本文就HNE的形成機(jī)制、形態(tài)分布、代謝、病理和生理學(xué)意義、檢測方法等進(jìn)行簡要綜述，并對食品中HNE的相關(guān)研究作一些展望。

1HNE的形成機(jī)制

自發(fā)現(xiàn)以來，科研工作者陸續(xù)提出HNE的多種形成機(jī)制和途徑。研究表明，HNE是ω-6 PUFAs的氧化產(chǎn)物，ω-6 PUFAs首先氧化形成氫過氧化物，然后再進(jìn)一步降解產(chǎn)生HNE[7-8]。

亞油酸（LA）是哺乳動物體內(nèi)含量最多、也是HNE相關(guān)研究中最常用的ω-6 PUFA，本文選擇LA來闡述HNE的形成機(jī)制。LA氧化形成HNE主要分為兩大步驟：第1步，LA轉(zhuǎn)變?yōu)闅溥^氧化十八碳二烯酸（HPODEs）;第2步，HPODEs降解形成HNE。

第1步，LA轉(zhuǎn)化為HPODEs，可以借助酶促或自由基誘導(dǎo)的方式，HPODEs主要包括9-HPODE和13-HPODE這2種異構(gòu)體（圖1）。研究表明，大豆脂氧酶可以選擇性地促進(jìn)LA生成13-HPODE，而番茄脂氧酶作用時主要得到9-HPODE[9];自由基誘導(dǎo)氧化條件下，2種異構(gòu)體生成的比例接近 1 ∶1[10]。第2步，HPODEs降解形成HNE，主要以自由基誘導(dǎo)為主，9-HPODE和13-HPODE這2種異構(gòu)體在自由基誘導(dǎo)體系下降解形成HNE的機(jī)制并不相同，9-HPODE有2種途徑形成HNE（圖2）：一種是9-HPODE發(fā)生氫氧均裂，得到的過氧自由基進(jìn)攻鄰位的碳碳雙鍵，形成9，10-二氧環(huán)丁烷自由基，該自由基結(jié)合一分子氧后，裂解形成4-過氧化壬烯醛（HPNE），HPNE是HNE的前體物質(zhì)，在適宜的還原體系中，可轉(zhuǎn)變?yōu)镠NE[11];另一種是在酸性條件下，經(jīng)Hock重排，裂解形成相應(yīng)中間體3Z-壬烯醛（3Z-NA），3Z-NA可經(jīng)氧化、還原形成HNE[12]。與9-HPODE相比，13-HPODE降解形成HNE的途徑要復(fù)雜一些，可分為4種途徑（圖3）：第1種是13-HPODE的8號碳結(jié)合一分子氧，轉(zhuǎn)變?yōu)?，13-DHPODE，經(jīng)Hock重排得到5-過氧化癸二烯醇，該化合物的烯醇端碳碳雙鍵經(jīng)氧化斷裂，可得到相應(yīng)的甲酸和HPNE，HPNE可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為HNE[13];第2種是13-HPODE的10號碳受到氧進(jìn)攻，轉(zhuǎn)變?yōu)?0，13-DHPODE，該中間體經(jīng)Hock重排、裂解形成HPNE，再還原得到HNE[14];第3種是在形成10，13-DHPODE的基礎(chǔ)上，繼續(xù)結(jié)合一分子烷氧自由基，形成相應(yīng)的二聚體，在二價鐵離子的作用下，經(jīng)β裂解、還原形成HNE[15];第4種是13-HPODE形成環(huán)氧中間體，在金屬離子及氧氣作用下，形成不對稱的二環(huán)氧碳酰自由基，碳碳鍵斷裂后，形成相應(yīng)的產(chǎn)物4-羰基-2-壬烯醛（ONE）和HNE[16]。除了自由基途徑，在植物脂氧酶（9-LOX）和過氧化氫裂解酶的共同作用下，LA也能夠通過酶促途徑降解形成HNE[15]。

HNE的形成受諸多因素干擾，形成過程復(fù)雜，是否還存在其他形成途徑還有待進(jìn)一步探究。

2HNE的形態(tài)分布

HNE分子結(jié)構(gòu)中含有3種官能團(tuán)，即醛基、碳碳雙鍵和羥基，其化學(xué)性質(zhì)活潑，除了游離形態(tài)外，HNE還能與多種其他化合物作用，形成結(jié)合形態(tài)。

蛋白質(zhì)是HNE作用的主要對象，邁克爾（Michael）加成反應(yīng)和形成席夫（Schiff）堿是HNE和蛋白質(zhì)結(jié)合的2種主要方式。HNE與蛋白質(zhì)上多種氨基酸（包括半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸等）殘基的側(cè)鏈結(jié)合，以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[17]。Xu等報道了HNE通過和蛋白質(zhì)上的賴氨酸結(jié)合，形成具有熒光性的共價偶聯(lián)產(chǎn)物[18]。2001年，Gardner等報道了HNE與血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）側(cè)鏈上的組氨酸形成Michael加成產(chǎn)物，屏蔽了鐵離子結(jié)合位點，從而降低酶活[19]。

作為巰基化合物的代表，谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)一種重要的水溶活性物質(zhì)。在生理條件下，HNE能夠和GSH形成復(fù)合物，加劇氧化應(yīng)激的程度[20]。

磷脂是細(xì)胞膜的重要組成部分，也能夠和HNE結(jié)合，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等分子中含有活潑的伯胺基團(tuán)，通過Michael加成反應(yīng)或形成Schiff堿的方式與HNE結(jié)合[21]。

HNE和核酸類物質(zhì)形成復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄，對細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性[22-23]。DNA中的鳥嘌呤是HNE攻擊的主要對象，Chen等分別報道了HNE和鳥嘌呤的結(jié)合方式及形成的相應(yīng)產(chǎn)物[24-25]。

除了這些結(jié)合形態(tài)，HNE還能與內(nèi)源性的多肽結(jié)合，如含組氨酸的肽段、胰島素、血管緊張素等[26-29]。此外，HNE 還能與一些小分子結(jié)合，如輔助因子、維他命、H2S等[30-32]。

3HNE的代謝

健康人體內(nèi)HNE能夠維持一定的水平，離不開代謝作用。體內(nèi)HNE的代謝可以分為第Ⅰ相代謝和第Ⅱ相代謝2種方式，前者主要借助氧化還原酶將HNE轉(zhuǎn)化為無毒化合物，后者主要通過與GSH結(jié)合來清除HNE。

3.1第Ⅰ相代謝

第Ⅰ相代謝主要包含氧化和還原2種途徑。HNE氧化代謝途徑主要通過醛脫氫酶（ALDH）來實現(xiàn)，該酶是緩解及預(yù)防產(chǎn)生細(xì)胞毒性的一類酶，能夠選擇性地將HNE分子中的醛基轉(zhuǎn)化為羧基，形成無活性的烯酸（HNA）[33]。HNA經(jīng)β氧化，可轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2和H2O[34];在細(xì)胞色素P450（CYP450）的作用下，經(jīng)ω氧化進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為二醇和三醇，端位的醇羥基可繼續(xù)氧化為相應(yīng)的羧酸[35]。乙醇脫氫酶（ADH）、醛酮/還原酶（AKR）以及烯醛/烯酮氧化還原酶（AOR）是HNE還原代謝常用的酶。ADH和AKR能夠選擇性地將醛基還原成醇羥基，形成無活性的二醇產(chǎn)物（DHN）[36]。而AOR是一類具有還原碳碳雙鍵能力的酶。近期的研究表明，AOR過度表達(dá)，可以將體內(nèi)堆積的HNE轉(zhuǎn)化4-羥基壬醛（HN），從而保護(hù)細(xì)胞免受HNE的侵害[37]。

3.2第Ⅱ相代謝

第Ⅱ相代謝主要由HNE和GSH形成無活性大分子（GS-HNE）來完成，在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羰基還原酶（CBR1）等催化下，GSH與HNE通過Michael加成反應(yīng)，保留的醛基可以繼續(xù)與分子內(nèi)的巰基形成環(huán)化產(chǎn)物，所得環(huán)化產(chǎn)物和直接加成產(chǎn)物的比例接近于1 ∶1[3]。在氧化或還原酶作用下，GS-HNE可進(jìn)一步形成GS-HNA、GS-ONA、GS-DHN等化合物[38-40]。在γ谷氨酸轉(zhuǎn)移酶以及胱氨酸S-聚合-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，GS-HNE、GS-DHN、GS-HNA等的GS端可進(jìn)一步水解、?；?，轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼寄蛩幔∕A），形成的 HNE-MA、HNA-MA和DHN-MA可直接排出體外[41]。

4HNE的病理和生理學(xué)意義

健康人體血漿中HNE的平均含量約為 11.62? μg/L[42]，體內(nèi)HNE的濃度與細(xì)胞種類及代謝環(huán)境等因素有關(guān)，胞內(nèi)HNE的濃度對細(xì)胞有明顯影響。圖4展示了HNE濃度由較低的生理水平逐漸升高后，細(xì)胞內(nèi)的生化過程及狀態(tài)變化：生理水平HNE在各種酶作用下，被完全代謝，不影響細(xì)胞的存活;低濃度HNE能夠發(fā)揮重要的信號傳導(dǎo)作用，如刺激基因表達(dá)、促進(jìn)抗氧化能力、提高應(yīng)激能力等;中等水平的HNE，能夠發(fā)出蛋白質(zhì)受損信號，影響蛋白質(zhì)和細(xì)胞器正常功能，引發(fā)自噬、衰老及細(xì)胞周期停滯;高濃度和極高濃度的HNE，能夠繼續(xù)和蛋白質(zhì)、DNA等形成復(fù)合物，引發(fā)細(xì)胞毒性和基因毒性，產(chǎn)生病理作用，引發(fā)細(xì)胞程序性凋亡[43]。

氧化應(yīng)激和不斷積累的脂質(zhì)過氧化是多種疾病發(fā)病和病變的重要影響因素，HNE作為活潑的脂質(zhì)氧化標(biāo)志物，在地中海貧血、瘧疾、維生素E缺乏、B16黑色素瘤、低血容量性休克和創(chuàng)傷患者的相關(guān)組織中均能檢測到[44-49]。此外，HNE與心臟疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，擴(kuò)張型心肌病患者體內(nèi)HNE修飾蛋白的表達(dá)量比健康人群高5倍[50]。除了心臟疾病，HNE對癌癥發(fā)生及發(fā)展有重要的影響。HNE不僅能夠修飾DNA的結(jié)構(gòu)，還能夠干預(yù)DNA的修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致DNA受損，促進(jìn)癌癥的形成[51]。神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富的ω-6 PUFAs、金屬離子，參與頻繁的氧化還原轉(zhuǎn)換，是形成HNE的重要場所。帕金森綜合征是第二大神經(jīng)退行性疾病，HNE不僅能夠修飾大腦路易斯體中α-突觸核蛋白的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)該蛋白

發(fā)生降解、聚集，還能夠作用于多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)器，抑制多巴胺吸收，降低體內(nèi)多巴胺水平，這二者均能加重帕金森綜合征病情[52-53]。阿爾茨海默病是研究最為廣泛的神經(jīng)退行性紊亂病，研究表明患者體內(nèi)的HNE水平顯著高于健康人群，HNE通過修飾β-淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)、促進(jìn)自由基形成，加劇該病的發(fā)展[54-55]。

5HNE的檢測方法

HNE具有的病理生理學(xué)作用引起了研究人員廣泛關(guān)注，體內(nèi)HNE水平被認(rèn)為是脂質(zhì)代謝最重要的指標(biāo)之一。HNE本身容易揮發(fā)、分解，當(dāng)pH值>9或pH值<1，或者溫度高于50 ℃時，HNE容易分解;HNE在氮?dú)獯祾?、真空濃縮等過程中也容易揮發(fā)，這給HNE的提取工作帶來了極大挑戰(zhàn)。此外，HNE具有紫外、熒光檢測響應(yīng)低，質(zhì)譜離子化效率不高等特性，須借助衍生試劑來提高檢測靈敏度。目前，按照HNE的形態(tài)，檢測方法可以分為游離形態(tài)和結(jié)合形檢測方法。

5.1游離形態(tài)HNE的檢測方法

光譜分析法和質(zhì)譜法是游離形態(tài)HNE常用的檢測方法。這2種方法常借助衍生試劑來完成，因此衍生試劑的選擇是一個關(guān)鍵因素，應(yīng)滿足衍生速度快、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、容易分離和檢測等要求。光譜法常用的衍生試劑有肼和酮類。2，4-二硝基苯肼是最常用的肼類衍生試劑，它能與HNE結(jié)合形成穩(wěn)定的苯腙，該衍生產(chǎn)物具有良好的紫外吸收能力，可以通過高效液相-紫外檢測器（HPLC-UV）進(jìn)行檢測分析，適用于油脂、肉品、水產(chǎn)、蔬菜等樣本[56]。1，3-環(huán)己二酮是酮類常用的衍生試劑，在銨鹽的作用下，它與HNE作用形成的產(chǎn)物具有熒光性，可通過高效液相-熒光檢測器（HPLC-FLD）來進(jìn)行定量分析[57]。質(zhì)譜技術(shù)的成熟，使得HNE的分析更加精準(zhǔn)，通過質(zhì)荷比的特異性，可對相應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)是HNE常用的檢測手段，羥胺類衍生試劑與HNE經(jīng)醛胺縮合、羥基衍生操作后，形成的產(chǎn)物適合采用GC-MS技術(shù)分析[58]。近年來，食品中HNE的分析方法取得了較多關(guān)注，植物油脂富含不飽和脂肪酸，是HNE形成的重要來源，Globisch等采用兩步衍生法，先將HNE轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的肟醚，再對羥基進(jìn)行硅烷基化，采用GC-MS法對多種植物油的HNE進(jìn)行普查[59-60]。苯肼類衍生結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)也是食品中HNE常用的檢測方法，適應(yīng)于多種油脂、油炸食品中HNE含量的分析[61-64]。最近，筆者所在課題組就肉制品中HNE的提取及分析方法進(jìn)行研究，開發(fā)了液氮速凍制樣、同位素內(nèi)標(biāo)添加、低溫液提取的方法，提升了肉制品中HNE分析方法的靈敏度和精密度[65]。盡管游離形態(tài)HNE的分析技術(shù)研究取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些問題：（1）游離態(tài)HNE提取方法不完善，提取過程中難以控制HNE的形成、轉(zhuǎn)化以及分解;（2）樣品重復(fù)性差，回收率不高。

5.2結(jié)合形態(tài)HNE的檢測方法

與游離形態(tài)HNE檢測相比，結(jié)合形態(tài)HNE的檢測情況相對復(fù)雜一些，不僅需要找出HNE結(jié)合形態(tài)的形成部位、種類、結(jié)合方式等相關(guān)信息，還需建立合適的檢測方法。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合形態(tài)HNE檢測早期的使用方法，可將免疫反應(yīng)的特異性和組織化學(xué)的可見性巧妙結(jié)合，促進(jìn)了部分結(jié)合形態(tài)HNE的定位、定性以及定量分析，如檢測低密度脂蛋白上HNE-賴氨酸的水平、血清中HNE-多聚氨基酸的結(jié)合種類和數(shù)量、細(xì)胞裂解產(chǎn)物中HNE-組氨酸的含量以及尿液中DHN-HNE的含量等。盡管這些技術(shù)證實了HNE能以結(jié)合態(tài)的方式存在，但存在抗體制備專一性不強(qiáng)、交叉反應(yīng)率高等問題。肽段質(zhì)量指紋圖譜、質(zhì)譜序列、中性掃描損失等是質(zhì)譜常用的分析手段，用來解析HNE修飾蛋白、肽段等的種類和結(jié)合位點，這些檢測有效促進(jìn)了結(jié)合形態(tài)HNE的分析工作，但由于結(jié)合形態(tài)HNE的豐度不高，許多工作仍集中在富集方法、HNE修飾種類、結(jié)合位點等方面，結(jié)合形態(tài)HNE的分析工作仍處于起步階段，面臨的困難和需要解決的問題還有很多[14]。

6食品中HNE的安全問題

不論是新鮮食材，還是貯藏、加工等過程中的食品，脂質(zhì)氧化都不可避免。人體內(nèi)的HNE包括內(nèi)源性和外源性2種：內(nèi)源性的HNE由細(xì)胞或組織中ω-6 PUFAs分解代謝產(chǎn)生;外源性的HNE主要通過膳食攝入。通過膳食獲取的HNE含量與食品中HNE含量緊密相關(guān)，食品的種類、貯藏加工方式均會影響HNE的形成，研究人員對各類食品中的游離形態(tài)HNE含量進(jìn)行了調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)油脂、油炸土豆及肉制品中富含HNE，過多地攝取這些食物可能會影響人類的健康[66]。此外，HNE性質(zhì)比較活潑，能夠與多種大分子活性物質(zhì)形成復(fù)合物，在一定條件下，這些結(jié)合態(tài)的復(fù)合物與游離形態(tài)的HNE可互相轉(zhuǎn)化，已有研究報道尚不能提供完整、可靠的HNE含量、形態(tài)等信息，但從中可以看出，富含不飽和脂肪酸的食物普遍存在HNE。由于結(jié)合形態(tài)HNE的存在，真實HNE的含量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過檢測水平。

值得注意的是，除了膳食本身攜帶的HNE，膳食中HNE的前體物質(zhì)進(jìn)入消化器官后，能夠繼續(xù)形成HNE，提高體內(nèi)HNE水平，并可能發(fā)揮內(nèi)源性HNE相同的病理生理學(xué)作用[67-69]。迄今為止，人體內(nèi)HNE水平與多種疾病相關(guān)性的研究均未能有效區(qū)分體內(nèi)HNE的來源，因此食品中普遍含有的HNE對人體健康具有潛在的安全風(fēng)險。食品中HNE的安全隱患不容忽視，食品尤其是肉制品中HNE的形態(tài)鑒定與分布、分析技術(shù)、形成規(guī)律及機(jī)制、暴露風(fēng)險評價等值得開展進(jìn)一步研究。

7研究展望

HNE是脂質(zhì)氧化過程中ω-6 PUFAs的氧化產(chǎn)物。盡管在生理和病理學(xué)領(lǐng)域的研究取得了重大進(jìn)展，但在食品領(lǐng)域的研究尚處于起步狀態(tài)。HNE在食品貯藏及加工過程中的形成機(jī)制、形態(tài)分布及演變情況、定量分析方法、風(fēng)險評估等將受到越來越多的關(guān)注。目前食品中減少HNE形成的方法主要包括采用多酚類阻斷HNE形成、把控食物原料、控制食品加工方法等，希望開發(fā)更多的方法在提升食品營養(yǎng)價值、風(fēng)味的同時，又能抑制HNE的形成。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31901716、31671877）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項（編號：CARS-41）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20171324）;江蘇省科技計劃（編號：XZ-SZ2019）。

作者簡介：馬晶晶（1988—），女，安徽銅陵人，博士，助理研究員，研究方向為肉品安全與質(zhì)量控制。E-mail：jingjingma2017@163.com。

通信作者：耿志明，碩士，研究員，研究方向為肉品安全與質(zhì)量控制。E-mail：zmgeng@163.com。