竹筍殼提取物對膜璞畢赤酵母及其生物膜的抑制作用

龔川杰，胡容，呂遠平，何強，遲原龍

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，如四川泡菜，在貯藏期間經(jīng)常出現(xiàn)“生花”現(xiàn)象?！吧ā笔窃谂莶吮砻嫘纬傻纳锬ぃе蔓}水渾濁、菜品軟爛和餿臭[1]，造成原材料浪費和經(jīng)濟損失。已有研究表明膜璞畢赤酵母是導致發(fā)酵食品表面形成生物膜的主要菌株之一[2]。竹筍殼是食品加工中的下腳料，產(chǎn)量大、價值低，多廢棄[3]。竹筍殼提取物已被證實具有抑菌活性[4-6]，但其對于“生花”酵母及生物膜的抑制作用報道較少[7]。本研究以膜璞畢赤酵母為目標菌，考察了3種竹筍殼提取物的抑菌特性和抑制生物膜特性，探討了竹筍殼對四川泡菜生花的影響。本文研究結(jié)果可為竹筍殼類天然防腐劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)，為竹筍殼資源的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛竹筍：收獲于2020年5月，購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；膜璞畢赤酵母：分離自四川泡菜鹽鹵表面膜璞，實驗室自存；蘆丁、福林-酚試劑、考馬斯亮藍G250、沒食子酸：購于成都市科隆化學品有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)：購于青島海博生物技術(shù)有限公司；其他化學試劑：均為國產(chǎn)分析純；蘿卜、食鹽：購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 主要實驗儀器

SpectraMax M2型微孔板測讀儀 Molecular Devices儀器(上海)有限公司；Nikon Ts2型倒置顯微鏡 上海千欣儀器有限公司；Biosafer-10C型冷凍干燥機 美國Labconco公司；UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 竹筍殼提取物的制備

將新鮮的竹筍殼清洗、切塊，采用組織粉碎機打漿，經(jīng)紗布過濾后收集竹筍殼渣，再采用冷凍干燥得到竹筍殼打漿物(DJ)；取50 g竹筍殼渣加入至500 mL蒸餾水中，在40 ℃下攪拌提取2 h，過濾后收集提取液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后得到竹筍殼水提物(ST)，稱重并計算得率；采用無水乙醇替代水作為提取溶劑，其他提取工藝和條件同上，得到竹筍殼醇提物(CT)，上述3種提取物置于干燥器中貯藏，備用。

1.3.2 竹筍殼提取物中主要化學成分的測定

采用蒽酮比色法測定提取物中可溶性糖的含量[8]，采用考馬斯亮藍比色法測定可溶性蛋白質(zhì)的含量，采用硝酸鋁顯色法測定黃酮的含量[9-10]，采用福林酚比色法測定多酚含量。

1.3.3 竹筍殼提取物對膜璞畢赤酵母抑制作用的測定

配制濃度為2×103CFU/mL膜璞畢赤酵母菌懸液和100 mg/mL 3種竹筍殼提取物水溶液，分別取適量菌懸液和提取物水溶液至96孔板中混合均勻，使其中目標菌濃度為103CFU/mL，且竹筍殼提取物濃度為6.25～50 mg/mL，以濃度為103CFU/mL的菌液為空白對照。在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，通過肉眼觀察孔板中混合液是否出現(xiàn)渾濁確定3種提取物的最低抑菌濃度(MIC)。將培養(yǎng)后的提取物——目標菌混合液涂布于YPD固體平板，在28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后計數(shù)，則抑菌率(%)=[(對照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)]×100。

分別取適量菌懸液和提取物水溶液至96孔板中混合均勻，使其中目標菌OD值為0.15，且3種竹筍殼提取物濃度為各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液為空白對照，測定3種提取物對目標菌的抑菌動力學曲線。

1.3.4 竹筍殼提取物對膜璞畢赤酵母菌生物膜的抑制和消除作用的測定

依據(jù)Perpetuini等[11]的方法測定3種提取物對目標菌生物膜的抑制和消除作用。生物膜抑制實驗：配制濃度為106CFU/mL膜璞畢赤酵母菌懸液和100 mg/mL 3種竹筍殼提取物水溶液，分別取適量菌懸液和提取物水溶液至96孔板中混合均勻，使其中目標菌濃度為105CFU/mL，且3種提取物濃度為各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液為空白對照。在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色、無菌水洗滌、冰乙酸洗脫后，測定洗脫液于600 nm處的吸光度值。

生物膜消除實驗：取適量菌懸液與無菌水混合使目標菌濃度為105CFU/mL，在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，菌液表面形成生物膜后，再加入適量提取物水溶液至菌液中混勻，使3種提取物濃度為各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液為空白對照。再于28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)固定、染色、洗滌、洗脫后，測定洗脫液于600 nm處的吸光度值。生物膜抑制率或消除率(%)=[(對照組OD值-處理組OD值)/對照組OD值]×100。

利用光學倒置顯微鏡觀察生物膜抑制實驗中竹筍殼水提物(25 mg/mL)對膜璞畢赤酵母生物膜的抑制作用，放大倍數(shù)為10×40，以未加入提取物的菌液為對照樣。

1.3.5 竹筍殼對四川泡菜“生花”的抑制實驗

取500 g蘿卜洗凈、切分，浸漬于裝有煮沸冷卻食鹽水的4 L泡菜壇中，加入40 mL老泡菜母液并混勻，通過添加適量食鹽使泡菜鹽水的平衡鹽度為4%(W/V)，壇口加水密封后于室溫條件下存放2 d，此時泡菜已發(fā)酵成熟(pH約為3.5)。實驗組將膜璞畢赤酵母菌懸液加入成熟泡菜中，同時加入200 g竹筍殼小塊2 cm2；對照組僅加入膜璞畢赤酵母菌懸液。兩組樣品均在室溫條件下放置14 d，比較觀察竹筍殼對四川泡菜“生花”的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，顯著性水平P<0.05，應(yīng)用Origin 9.0進行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種竹筍殼提取物的得率和主要化學成分

竹筍殼打漿物、水提物和醇提物的得率分別為5.71%、3.72%、4.02%。其中竹筍殼醇提物具有較高的黃酮和多酚含量，竹筍殼水提物中多酚含量最高(P<0.05)。營養(yǎng)物質(zhì)可溶性糖和可溶性蛋白在竹筍殼打漿物中分別達到了55.73 mg/g和24.52 mg/g[12]，與其余兩種提取物相比差異顯著(P<0.05)。

表1 3種竹筍殼提取物的主要化學成分Table 1 The main chemical components of three extracts from bamboo shoot shells

2.2 3種竹筍殼提取物的抑菌活性

3種竹筍殼提取物對膜璞畢赤酵母均表現(xiàn)出一定的抑制作用，見圖1。

圖1 3種提取物在不同濃度下對目標菌的抑菌率Fig.1 The inhibition rates of the three extracts with different content against P. membranifaciens

由圖1可知，隨著提取物濃度的增加，3種提取物的抑菌作用逐漸增強。當提取物濃度達到12.5 mg/mL及以上時，3種提取物的抑菌率均達到50%以上，其中竹筍殼醇提物的抑菌活性最強，其在濃度高于25 mg/mL時可以達到對目標菌的完全抑制，3種提取物的抑菌動力學曲線見圖2。

圖2 3種提取物對目標菌的抑菌動力學曲線Fig.2 The inhibitory kinetics curves of the three extracts against P. membranifaciens

由圖2可知，加入提取物的菌懸液OD值隨著培養(yǎng)時間的延長增長較緩慢，當培養(yǎng)48 h時OD600 nm值均低于0.8(空白組OD600 nm值約為1.6)，表明3種提取物對目標菌有較強的抑制作用，其中竹筍殼醇提物的抑菌活性最強，這可能與其黃酮和多酚含量高有關(guān)。有研究證實100～200 mg/mL的竹筍殼醇提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用能達到山梨酸鉀的效果[13]。也有研究得出竹筍殼提取液對泡菜中的“生花”酵母有抑制作用。

2.3 3種竹筍殼提取物的抑制生物膜活性

表2 3種竹筍殼提取物對膜璞畢赤酵母的最小抑菌濃度(MIC)及對其生物膜的抑制與消除作用Table 2 The minimum inhibitory concentration (MIC) of the three extracts from bamboo shoot shells on P. membranifaciens and their inhibition and elimination effects on its biofilm

由表2可知，竹筍殼水提物和醇提物在其MIC濃度下對生物膜形成的抑制率均達到70%以上，但其消除生物膜的效果較差(不足或接近10%)。

對照組中成熟生物膜呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖3中B。加入濃度為25 mg/mL的竹筍殼水提物后，抑制了黏附細胞從酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相，生物膜中的孔隙和管道系統(tǒng)被破壞，菌絲的形成明顯減少，破壞了生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，見圖3中A。

圖3 添加25 mg/mL竹筍殼水提物處理組(A)和空白對照組(B)下膜璞畢赤酵母形成生物膜的形態(tài)觀察(10×40)Fig.3 The morphology observation of biofilm of P.membranifaciens in the treatment group with25 mg/mL aqueous extracts of bamboo shootshells (A) and blank control group (B)

綜合上述研究結(jié)果，推測竹筍殼提取物主要與目標菌直接作用從而抑制生物膜形成，可能的作用機理有：減少體系中浮游產(chǎn)膜菌的數(shù)量；通過修飾改變表面性質(zhì)，阻礙浮游細胞的黏附和聚集；下調(diào)生物膜主要組成物質(zhì)如菌絲、多糖、蛋白質(zhì)、核酸的相關(guān)表達基因，降低生物膜形成能力。

2.4 竹筍殼對四川泡菜“生花”的影響

表3 四川泡菜發(fā)酵過程中pH和鹽度Table 3 The pH values and salt concentration of Sichuan pickles during fermentation

圖4 竹筍殼對四川泡菜“生花”的影響Fig.4 The effect of bamboo shoot shells on the “biofilm formation” of Sichuan pickles

由表3和圖4可知，乳酸菌在發(fā)酵前2 d快速生長產(chǎn)生乳酸，對照組和實驗組的pH分別降至3.50和3.24，表明泡菜成熟。對照組在發(fā)酵至14 d的過程中，以膜璞畢赤酵母為主的微生物形成白色碎花狀生物膜，膜璞逐漸褶皺變厚，泡菜水渾濁，pH升高至4.16，泡蘿卜特有的酸香風味減弱。加入竹筍殼的四川泡菜中未出現(xiàn)生花現(xiàn)象，泡菜水清亮，泡菜酸香風味濃郁，表明竹筍殼的加入可有效抑制四川泡菜生花。此外，對照組和實驗組鹽濃度由初始的4%逐步降低至3.64%和3.48%，這可能與泡菜中的有機質(zhì)被分解，組織液滲透進鹽水中有關(guān)。

3 結(jié)論

竹筍殼水提物和醇提物對膜璞畢赤酵母具有一定的抑制作用。在最小抑菌濃度下，竹筍殼水提物和醇提物可以有效抑制膜璞畢赤酵母形成生物膜，抑制率分別達到(81.76±1.31)%和(71.31±1.56)%，但這兩種提取物對目標菌生物膜的消除作用較弱。本研究提出了一種利用竹筍加工副產(chǎn)物制備天然防腐劑的方法，可為其他農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的再利用和傳統(tǒng)發(fā)酵食品和調(diào)味品的防腐保質(zhì)提供參考。