基于QuEChERS的UHPLC-MS/MS同時檢測雞蛋中19種農藥殘留量

黃小波 劉維平

(長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院，湖南 長沙 410004)

中國是禽蛋生產和消費大國，產量約占全世界40%，連續(xù)多年位居世界第一；其中，雞蛋產量占禽蛋總量的70%以上[1]。雞蛋富含蛋白質、脂質、維生素等多種營養(yǎng)要素、且價格低廉、易于獲得，是人類飲食的重要組成部分[2-3]。然而，雞蛋中檢出有機類農藥或除草劑的情況時有發(fā)生[3-4]。長期食用農殘超標的雞蛋，可誘發(fā)多種慢性疾病甚至癌癥，嚴重影響了禽蛋食用安全[5]。

目前，關于有機磷、硫、氯類農藥殘留的檢測方法主要集中于氣相色譜、液相色譜[6-7]以及氣相色譜—質譜聯(lián)用和液相色譜—質譜聯(lián)用等[8-9]。但是，這些方法常需消耗大量昂貴試劑和(固相萃取)耗材，樣品前處理步驟繁瑣，且效果不盡如人意[10]。有研究[11]表明，采用氯化鈉鹽析輔助乙腈提取農殘，結合無水硫酸鎂吸附脫水、乙二胺基-N-丙基(PSA)除雜的QuEChERS技術，成功地實現(xiàn)了食品基質中農殘的簡便、高效提取。

近年來，QuEChERS結合色譜—質譜已被廣泛應用于農副產品中農殘的檢測，如茶油中有機磷類[10]、柑桔中毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威[11]、高硫蔬菜中16種氨基甲酸酯類等農藥殘留量檢測[12]。鄭容等[13]曾采用QuEChERS-氣相色譜—質譜聯(lián)用(GC-MS)同時測定了雞蛋中19種有機氯及菊酯農藥殘留；王瓊妹等[14]建立了基于QuEChERS前處理結合GC-MS，多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)掃描同時鑒定雞蛋中48種農藥殘留。而有關QuEChERS結合液相色譜—質譜聯(lián)用(HPLC-MS)檢測雞蛋中農藥殘留的研究尚未見報道。

試驗擬構建基于QuEChERS-UHPLC-MS/MS同時多反應監(jiān)測(MRM)檢測雞蛋中19種有機磷、硫、氯類農藥殘留的檢測方法，并進一步運用該方法對湖北省不同地區(qū)雞蛋樣品進行檢測，以期提供一種快速、高效的禽蛋農殘檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

殺蟲或除草劑(殺蟲單、吡蟲啉、苯線磷亞砜、安硫磷、氯蟲酰胺、乙拌磷砜、烯酰嗎啉、螺旋藻胺、伏蟲脲、異菌脲、異稻瘟凈、氯芬磷、惡唑菌酮、吡嘧磷、辛硫磷、茚蟲威、毒死蜱、丙硫磷)標準品：純度95%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

雞蛋樣品：隨機購于湖北武漢(10批次)、鄂州(12批次)、孝感(8批次)、荊門(13批次)、荊州(8批次)、黃岡(22批次)等地區(qū)的零售市場；

乙腈、甲醇和醋酸銨：色譜純，美國Tedia公司；

超純水：美國Millipore 超純水儀制備；

乙酸：色譜純，德國CNW公司；

甲酸：色譜純，美國Scientific公司；

MgSO4、NaCl等：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀：1200 SL型，配備SB-Aq色譜柱(100 mm×3.0 mm×1.8 μm)，美國安捷倫科技有限公司；

三重四級桿串聯(lián)質譜儀：6460型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

氮吹儀：N-ECAP45型，美國Organomation公司；

渦旋混合器：SK-1型，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

(1)農殘標準儲備液：準確稱取一定量農殘標準品，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成濃度約為1 g/L標準儲備液，-20 ℃避光保存。

(2)農殘標準工作液配制：準確吸取一定體積1 g/L農殘標準儲備液至10 mL容量瓶中，利用乙腈適當稀釋，制備含有10 mg/L每種農藥或除草劑的標準工作溶液，并在-20 ℃下避光保存。

1.3.2 樣品制備(提取和凈化) 準確稱取5.00 g充分混勻的雞蛋樣品至50 mL具塞離心管；隨后加入4 mL去離子水，旋渦混勻1 min，再加入10 mL(含1%乙酸)乙腈溶液，磁力攪拌20 min混勻。加入4 g MgSO4和1 g NaCl，密封旋渦震蕩1 min；4 ℃下，5 000 r/min離心5 min。準確吸取400 μL上清液(乙腈層)于2 mL離心管中，同時加入5 mmol/L 醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)200 μL，混勻，過0.2 μm微孔濾膜，備用待測。

1.3.3 UHPLC-MS/MS參數(shù)

(1)色譜條件：柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流量0.25 mL/min；流動相A：甲醇溶液，流動相B：5 mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序：0～3 min采用5% A進行洗脫，3～5 min線性增至95%，并維持2 min；7～10 min線性降低至5% A；最后，重新平衡8 min，總運行時間18 min。

(2)質譜條件：電噴霧離子源正離子(ESI+)模式；氣體溫度300 ℃；氣體流速7 L/min；離子氣壓275.8 kPa；去溶劑溫度300 ℃；保護氣體流速10 L/min；毛細管電壓3 000 V；離子噴嘴電壓500 V；駐留時間20 ms；多反應監(jiān)測模式，其他質譜參數(shù)見表1[15]。

1.3.4 檢出限和定量限測定 為消除(或減少)基質效應對檢測結果所造成的影響或干擾，將空白樣品經提取和純化(凈化)所得的溶液，作為混合標準溶液的溶劑。用基質溶液將農藥標樣配置成2.5，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/kg系列基質混合標準溶液10 mL；按照1.3.3中優(yōu)化條件進行色譜和質譜分析，以混合標樣溶液的濃度(X，μg/kg)為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。將3倍信噪比(S/N=3)作為檢出限，10倍信噪比(S/N=10)作為定量限[10,12]。

1.3.5 回收率和精密度測定 向制備的雞蛋樣液中，分別添加低濃度(1 μg/kg)、中濃度(5 μg/kg)和高濃度(20 μg/kg)待測農藥標樣，進行3次重復，計算(不同濃度)各種農藥標準品的回收率和相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 方法學構建(考察)

2.1.1 UHPLC-MS/MS條件優(yōu)化 以流動注射方式分別對19種農藥(單)標準溶液進行正離子電噴霧母離子(ESI+)掃描，確定各目標化合物的母離子，再對母離子進行二級質譜掃描(MS2)，每種農藥選擇兩對響應值高的特征離子對作為定性和定量離子對，并對MRM參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化結果見表1。采用SB-Aq色譜柱分離，甲酸—醋酸銨混合溶液和甲醇梯度洗脫的分離度、靈敏度(離子響應)較好，且能在一定程度上減緩色譜峰拖尾。

表1 19種農殘的保留時間及MRM參數(shù)

2.1.2 線性范圍、檢出限和定量限 由表2可知，除惡唑菌酮(R2=0.532 5)外，殺蟲單等18種農藥在2.5～50.0 μg/L的質量濃度范圍內，擬合方程的相關系數(shù)R2為0.965 0～0.999 5。所建方法的檢出限(LOD)為0.01～2.89 μg/kg；定量限(LOQ)為0.03～9.54 μg/kg。說明在此范圍內，所構建方法具有良好的線性關系；對雞蛋中氯蟲酰胺(LOD=0.01 μg/kg，LOQ=0.03 μg/kg)、吡嘧磷(LOD=0.01 μg/kg，LOQ=0.03 μg/kg)、伏蟲脲(LOD=0.02 μg/kg，LOQ=0.07 μg/kg)、毒死蜱(LOD=0.03 μg/kg，LOQ=0.10 μg/kg)等農藥的檢測靈敏度較高；對安硫磷(LOD=2.89 μg/kg，LOQ=9.54 μg/kg)、殺蟲單(LOD=1.09 μg/kg，LOQ=3.60 μg/kg)的檢測靈敏度相對較低。

表2 19種農藥的線性方程和相關系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.1.3 加標回收率和精密度 由表3可知，當農藥混標濃度為1 μg/kg時，其加標回收率在50.5%～126.0%(惡唑菌酮未檢出)，相對標準差(RSD)為4.5%～27.0%；當濃度為5 μg/kg時，其加標回收率在79.7%～129.0%，RSD為1.5%～21.0%；當濃度為20 μg/kg時，其加標回收率在57.4%～111.0%，RSD為1.3%～17.0%。說明當?shù)皹又修r藥殘留量較低(<1 μg/kg)時，所建方法加標回收率稍弱(1 μg/kg，79.25%)，相對標準差較高(19.54%)；而當(雞蛋)樣品中農藥殘留量稍高(>5 μg/kg)時，所構建方法的加標回收率接近100%(5 μg/kg，102.14%；20 μg/kg，92.66%)，相對標準差較低(5 μg/kg，11.27%；20 μg/kg，9.34%)。試驗所建方法的回收率和RSD與其他研究結果較為吻合[13,15-16]，且基本符合《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)對回收率和精密度的要求。說明試驗所構建的方法能夠滿足正常檢測需要，可用于實際雞蛋樣品中相關農殘的痕量檢測。

表3 不同濃度農藥的加標回收率和精密度

2.2 雞蛋樣品中農藥殘留量檢測

運用試驗所構建方法對隨機采購于湖北省境內不同地區(qū)農貿市場的73批次雞蛋進行檢測。73批次雞蛋中19種農藥總檢出頻率為2.82%。其中，辛硫磷和毒死蜱的檢出率分別為22%，15%；兩者檢出量分別為2.08～729.74，0.81～46.89 μg/kg；丙硫磷在所有雞蛋中均未檢出；其他農殘在雞蛋中檢出頻率均低于0.41%。武漢、鄂州、孝感、荊門、荊州、黃崗地區(qū)雞蛋中農殘檢出頻率分別為5.56%，4.17%，2.78%，5.13%，11.11%，1.77%。

具體來說，武漢雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(197.35±237.98)μg/kg(檢出頻率為4/10)和(4.96±3.79)μg/kg(檢出頻率為3/10)；鄂州雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(136.51±296.93)μg/kg(檢出頻率為5/12)和9.72 μg/kg(檢出頻率為1/12)；荊門雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(53.92±87.91)μg/kg(檢出頻率為3/13)和(17.67±25.32)μg/kg(檢出頻率為3/13)；荊州雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(354.63±393.70)μg/kg(檢出頻率為4/8)和(13.72±12.05)μg/kg(檢出頻率為3/8)；黃崗雞蛋中毒死蜱含量為0.92 μg/kg(檢出頻率為1/22)；孝感雞蛋中未檢出辛硫磷和毒死蜱。綜上，不同產地雞蛋中農藥殘留量和同一個雞蛋中不同農藥殘留量均存在較大差異，究其原因可能為母雞所用飼料、外出覓食和生活環(huán)境等多種因素綜合所致[13]。

3 結論

(1)研究成功構建了一種基于QuEChERS(前處理)結合UHPLC-MS/MS(MRM掃描)同時檢測雞蛋中多種農藥殘留量的方法。該方法所耗溶劑少，操作便捷，加標回收率高(79.25%～102.14%)，且具有較好的線性及較高的準確度(檢出限為0.01%～2.89%)和精密度(相對標準差為9.34%～16.72%)，基本符合和適用于禽蛋中19種農藥殘留的同時和快速定性、定量分析。

(2)湖北省境內雞蛋中農殘問題主要涉及辛硫磷(檢出率為22%)和毒死蜱(檢出率為15%)兩種。但是總體來說，檢出總頻率(2.82%)和含量較低，潛在安全風險較小。