磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPT4影響水稻氮磷積累與利用的機(jī)理研究

孫雅菲 宋科 秦秦 孫麗娟 薛永

磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPT4影響水稻氮磷積累與利用的機(jī)理研究

孫雅菲#宋科#秦秦 孫麗娟 薛永*

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所/上海市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403；#共同第一作者；*通信聯(lián)系人，E-mail：exueyong@163.com)

【】磷酸鹽(Pi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPT4是水稻Pht1家族成員之一，負(fù)責(zé)Pi吸收以及向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。探究超表達(dá)對(duì)不同Pi條件下水稻氮(N)和磷(P)積累與利用的影響及其機(jī)理具有重要意義。以日本晴背景的超表達(dá)株系為研究材料，通過設(shè)置正常供Pi與缺Pi的水培與桶培實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)生殖生長(zhǎng)階段不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，探究不同Pi處理?xiàng)l件下不同組織(葉片、葉鞘、莖稈、稻殼、穗柄和糙米)中的N和P濃度，并計(jì)算Pi吸收率及N和P利用效率，同時(shí)分析株高、單株產(chǎn)量、千粒重和結(jié)實(shí)率等產(chǎn)量構(gòu)成因素。在水稻生殖生長(zhǎng)階段的根系中相對(duì)表達(dá)豐度較高，超表達(dá)使水稻劍葉、葉鞘、莖稈、稻殼、穗柄和糙米中的總P濃度不同程度提高，并顯著提高了不同Pi處理?xiàng)l件下的Pi吸收與利用效率。同時(shí)，的超表達(dá)可顯著提高正常供Pi與缺Pi土壤條件下的單株產(chǎn)量與千粒重，以及缺Pi土壤中生長(zhǎng)的結(jié)實(shí)率。除此之外，的超表達(dá)使缺Pi條件下癟殼與糙米中總N濃度平均升高16.8%和19.8%，N利用效率平均升高6.6%。超表達(dá)不僅顯著提高Pi吸收與利用效率，同時(shí)對(duì)不同Pi條件下的生理氮素利用率起促進(jìn)作用。

磷；氮；；磷素利用率；氮素利用率

磷(phosphorus, P)是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，也是制約水稻產(chǎn)量形成的重要因素。植物獲取的磷形態(tài)主要包括三種可溶性磷酸根離子，即H2PO4?、HPO42?和PO43?[1, 2]。磷酸鹽的化學(xué)特性導(dǎo)致其容易被酸性土壤中的鐵鋁氧化物以及石灰性土壤中的碳酸鈣化合物等固定，難以被植株吸收和利用[3, 4]。水稻(L.)是供給世界一半以上人口的主要糧食作物。中國作為世界上水稻種植面積最大的國家，目前種植面積達(dá)3100萬hm2,占全國糧食作物總種植面積的27.4%，產(chǎn)量約占全國糧食總產(chǎn)的36.1%，供全國60%人口食用[5]。然而，我國大約2/3的耕地土壤呈現(xiàn)缺磷狀態(tài)，研究磷素利用率對(duì)提高水稻產(chǎn)量意義重大。

土壤中無機(jī)態(tài)磷(Pi)經(jīng)細(xì)胞膜由根際進(jìn)入植物體內(nèi)的過程由多個(gè)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同完成[4, 6]。磷吸收動(dòng)力學(xué)研究表明，植物中存在雙重吸收系統(tǒng)。在高P條件下啟動(dòng)低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在低P條件下啟動(dòng)高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可見高親合力磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有著在缺P條件下負(fù)責(zé)根系吸收P的功能。目前已有報(bào)道指出，植物編碼磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因分為、、和四個(gè)基因家族[7]。迄今為止，植物中被克隆的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因大多屬于家族。Pht1磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族作為細(xì)胞膜上的H2PO4?/nH+共運(yùn)體，是植物吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)P的主要通道。雙子葉植物擬南芥的Pht1家族中包含9個(gè)成員，均受缺P誘導(dǎo)，、、和只在根冠、根毛以及表皮等與土壤直接接觸的細(xì)胞中表達(dá)[8, 9]。單子葉模式植物水稻中有13個(gè)(OsPT1～13)成員[7]，除及受菌根特異誘導(dǎo)外，其他大多數(shù)成員受缺P誘導(dǎo)[10]。和在水稻根系吸收P的過程中起重要作用，其中后兩者主要在根系中表達(dá)[11-14]。磷極度缺乏的環(huán)境，對(duì)P的獲取與再分配起關(guān)鍵作用，與存在互作關(guān)系[15]。OsPT4作為高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)P的吸收與向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，并顯著促進(jìn)種子胚發(fā)育[16]。在磷素由營(yíng)養(yǎng)器官往生殖器官運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用[17]。和受缺P脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，除了負(fù)責(zé)P吸收外，在P吸收過程中還存在功能冗余[18]。由此可見，盡管家族成員眾多，但不同成員在P動(dòng)態(tài)平衡中行使的功能各有不同。

氮(N)作為組成重要大分子(如核酸、蛋白質(zhì)和葉綠素等)的關(guān)鍵成分，同樣是植物生長(zhǎng)不可或缺的大量元素[19]。近年來，植物中N和P互作研究受到人們的關(guān)注?？刂芅和P動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間普遍存在串聯(lián)和互作關(guān)系。如擬南芥中兩個(gè)基因(Nitrogen Limitation Adaption)和(Phosphate2)負(fù)責(zé)調(diào)控磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸，導(dǎo)致地上部磷素積累依賴于外界N供應(yīng)[20-22]，而HRS1將通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來控制硝酸鹽與磷信號(hào)[23]。另外，在擬南芥中PHR1控制AtNIGT1/HRS1并通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT2.1調(diào)控硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)[24, 25]。在水稻和小麥中，N平衡與穩(wěn)態(tài)依賴于NRT1.1和PHR1/ PHL1共同參與的磷酸鹽饑餓響應(yīng)[26]，磷信號(hào)抑制因子SPX4與細(xì)胞質(zhì)PHR2互作，防止其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，并與硝酸鹽傳感器NRT1.1b相互作用[27, 28]。然而，作為磷酸鹽傳感器的Pht1家族成員對(duì)N動(dòng)態(tài)平衡以及作物N利用效率的影響尚不清楚。

本研究以日本晴及其超表達(dá)株系為材料，一方面通過熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步細(xì)化編碼磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的OsPT4在生殖生長(zhǎng)階段不同組織的時(shí)空表達(dá)模式，推理OsPT4的超表達(dá)在生殖生長(zhǎng)期水稻各組織中的作用；另一方面通過創(chuàng)建的OsPT4超表達(dá)材料深入研究OsPT4的超表達(dá)對(duì)不同供磷條件下水稻產(chǎn)量、不同組織N和P的積累及其利用效率的影響，研究結(jié)果將為后續(xù)的氮磷協(xié)同高效利用并高產(chǎn)的水稻分子育種提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為日本晴(wild type, WT,L. Nipponbare)及其超表達(dá)株系(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院孫淑斌教授課題組提供)。

1.2 方法

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

水稻種子經(jīng)30% NaClO震蕩消毒30 min后用蒸餾水洗凈，37℃恒溫箱暗培3 d催芽，待種子露白后，將轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)入25 mg/L潮霉素水溶液中篩選1周，2葉1心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的水稻幼苗移栽入7 L中轉(zhuǎn)箱，每箱16穴，每穴1株，用海綿固定在塑料泡沫板的孔中。以磷酸二氫鉀為磷源,設(shè)置正常供磷(+P, 200 μmol/L)和缺磷(?P, 10 μmol/L)兩種水培處理磷濃度，以正常供磷水平為準(zhǔn)，低磷營(yíng)養(yǎng)液中用KCl補(bǔ)充相對(duì)缺失的鉀元素，其余營(yíng)養(yǎng)成分配方包括NH4NO3(1.25 mmol/L)，CaCl2(1 mmol/L)，MgSO4(1 mmol/L)，Na2SiO3(0.5 mmol/L)，K2SO4(0.35 mmol/L)，EDTA-Fe (20 μmol/L)，H3BO3(20 μmol/L)，MnCl2(9 μmol/L)，ZnSO4(0.77 μmol/L)，(NH4)6Mo7O24(0.39 μmol/L)以及CuSO4(0.32 μmol/L)，pH調(diào)至5.5。培養(yǎng)溫度及光照時(shí)長(zhǎng)為白天16 h(30℃)/黑夜8 h(22℃)。光照強(qiáng)度為40 000 lx。正常供磷與缺磷處理時(shí)長(zhǎng)為21 d，處理期間每3 d于下午4點(diǎn)更換營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.2 拷貝數(shù)鑒定方法

從葉片中提取的基因組DNA(100 μg)在37℃下用RⅠ和dⅢ消化過夜。然后將其在0.01 g/mL ()瓊脂糖凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上(Amersham)。在65℃下用地高辛(DIG)標(biāo)記的潮霉素抗性基因()作為探針進(jìn)行雜交。65℃下洗滌印跡，并使用感光成像儀(Typhoon 8600)進(jìn)行分析。

1.2.3 土培實(shí)驗(yàn)

采6份土樣消煮，測(cè)定土樣總氮、總磷含量和C/N 比(分別為0.117 mg/g、9.872 mg/g和2.04 mg/g )。然后對(duì)土壤基質(zhì)進(jìn)行施肥處理，分別施40和160 mg/kg的KH2PO4，1個(gè)月后采用Olsen法測(cè)定土壤中的有效磷濃度，得到實(shí)際有效磷濃度為 13和36.8 mg/kg的土樣，分別代表低磷和正常供磷水平。水稻種子經(jīng)30% NaClO震蕩消毒30 min后用蒸餾水洗凈，37 ℃恒溫箱暗培3 d催芽，待種子露白后，將三個(gè)轉(zhuǎn)基因超表達(dá)株系轉(zhuǎn)入25 mg/L潮霉素水溶液中篩選1周，2葉1心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的水稻幼苗移栽進(jìn)行桶培(10 kg土壤)，每桶種植2株水稻，分別為野生型和三個(gè)不同的超表達(dá)材料各1株，每種處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2.4 農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)方法

在水稻完熟期，自水稻苗齊地面處至穗頂點(diǎn)測(cè)量株高。收獲后通過調(diào)查主穗飽粒與癟粒數(shù)計(jì)算結(jié)實(shí)率；并通過稱重測(cè)量單株產(chǎn)量及千粒重。

1.2.5 熒光定量PCR

用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)水稻野生型和3個(gè)超表達(dá)株系至21 d，分別取整個(gè)植株裝入小自封袋中并立即放入液氮中，以備提取RNA。剩余樣品放入?70 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的步驟參見張占田等[29]。

利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)表達(dá)量所用引物(表1)。熒光PCR 條件均為20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：95 ℃下變性3 min，然后95 ℃下10 s，60 ℃下10 s, 72 ℃下15 s，循環(huán)數(shù)40；72℃下充分延伸10 min。20 μL反應(yīng)體系包括擎科qPCR試劑盒(2×TSINGKE Master qPCR Mix)10 μL，正向(F)引物和反向(R)引物(表1)各1 μL，cDNA 模板1 μL，無菌水7 μL。配制混合物充分混勻后平均分配至96孔PCR板中。反應(yīng)條件如下：95 ℃下30 s，95 ℃下10 s，60 ℃下10 s, 72 ℃下15 s，40次循環(huán)；72 ℃下延伸5 min。設(shè)定在每個(gè)循環(huán)的變性期結(jié)束后，程序自動(dòng)記錄上一循環(huán)最后10％時(shí)間的平均熒光值。熒光種類選擇SYBR Green 490。所有設(shè)定保存后運(yùn)行程序，輸入正確的 PCR體系的體積后開始運(yùn)行。記錄值，根據(jù)2?ΔCt方法計(jì)算分析定量結(jié)果[30]。

表1 OsActin和OsPT4的定量PCR序列

1.2.6 植株總磷含量測(cè)定及磷素吸收與利用效率計(jì)算

于水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期及生殖生長(zhǎng)期采集不同組織，在105℃下殺青30 min，70℃下烘干至恒重，隨后樣品經(jīng)粉樣機(jī)粉碎后混勻，各稱取樣品0.05 g置于100 mL消化管中，用濃H2SO4-H2O2混合消煮。待冷卻后定容，用鉬銻抗比色法，在722紫外可見分光光度計(jì)下于800 nm處比色測(cè)定[32]。

磷吸收效率＝P/，其中P代表整個(gè)植株的吸磷量，代表根系干物質(zhì)量[31]。磷利用效率計(jì)算方法：磷利用效率=/P，P代表地上部磷含量，代表地上部干物質(zhì)量[32]。

1.2.7 植株總氮含量測(cè)定及生理氮素利用率計(jì)算

稱取烘干磨碎后的植株樣品0.5 g，放置于消煮管中，每個(gè)管中加入1 mL去離子水潤(rùn)濕樣品，隨后加入5 mL濃硫酸搖勻過夜。先在230℃下消煮30 min，等到消化管中煙霧升到管口時(shí)，再將溫度升高到280℃繼續(xù)消煮30 min，加入適量的H2O2，混勻樣品直至澄清狀態(tài)，再持續(xù)消煮10 min。等待消煮管冷卻后定容樣品到100 mL?？偟獫舛扔肁A3單通道連續(xù)流動(dòng)分析儀(德國Bran +Luebbe公司)測(cè)定。生理氮素利用率計(jì)算方法：=/。代表產(chǎn)量，代表施氮量，計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[33]。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SigmaPlot 12.0和SPSS 24進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPT4在水稻不同生長(zhǎng)期的表達(dá)模式

利用熒光定量PCR檢測(cè)日本晴野生型(WT)中在幼穗分化期(12周)和孕穗期(14周)不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)量。如圖1所示，在水稻(日本晴)中呈組成型表達(dá)。其中，在幼穗分化期，根系中的相對(duì)表達(dá)豐度最高，葉片中次之，其他組織(莖基部、葉鞘和未成熟穗)中相對(duì)表達(dá)量略低。在孕穗期，根系中的相對(duì)表達(dá)豐度依然最高。與根系中相對(duì)表達(dá)量相比，劍葉、劍葉葉鞘、倒2葉及倒2葉葉鞘中表達(dá)豐度次之，其他營(yíng)養(yǎng)組織(莖基部)及繁育組織(花梗、花軸和小穗)中表達(dá)豐度較低。

數(shù)據(jù)均為平均數(shù)（n = 3）。

Fig. 1. Relative expression ofin different organs at different growth stages of rice.

2.2 OsPT4對(duì)水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期磷素積累的影響

為研究超表達(dá)對(duì)水稻氮磷養(yǎng)分利用效率的影響，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得多個(gè)的超表達(dá)株系，經(jīng)Southern-blot鑒定拷貝數(shù)，選取3個(gè)單拷貝株系進(jìn)行試驗(yàn)(圖2-A)。經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，3個(gè)超表達(dá)株系的相對(duì)表達(dá)量分別為WT的9.7、7.4及5.4倍(圖2-B)。

將苗齡為10 d的WT和超表達(dá)株系(、和)分別移入正常供磷(+P)和缺磷(?P)營(yíng)養(yǎng)液中處理21 d，統(tǒng)計(jì)不同株系地上部和根部干物質(zhì)量。如圖3所示，在+P條件下，、和地上部干物質(zhì)量與野生型相比分別增加了19.5%、15.2%和9.3%，根部分別增加20.4%、19.3%和17%；在?P條件下，三個(gè)超表達(dá)株系的地上部干物質(zhì)量分別增加了26.5%、21.6%和9.6%，根部分別增加8.6%、14.9%和12.8%(圖3-A～B)。對(duì)全P含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在+P和?P兩種處理?xiàng)l件下，的超表達(dá)均顯著提高水稻地上部及根部全磷含量(圖3-C～D)。其中，+P條件下、和地上部全磷含量分別比野生型上升9.4%、14.3%和11.4%，根部分別增加27.7%、23.5%和19.1%；?P條件下超表達(dá)株系地上部全磷含量分別增加52.2%、38.5%和37.9%，而根部則分別增加15.4%、13.6%和13.1%。

A－OsPT4超表達(dá)材料拷貝數(shù)鑒定；B－超表達(dá)材料中OsPT4的相對(duì)表達(dá)量。M代表標(biāo)記物，P代表陽性對(duì)照。不同字母表示在5%水平上差異顯著。WT－野生型；Ox1～ Ox3－三個(gè)超表達(dá)株系。數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)；不同字母表示同一時(shí)期內(nèi)各株系在0.05水平上差異顯著。

Fig. 2. Molecular identification ofoverexpressing lines.

2.3 OsPT4對(duì)水稻磷吸收及利用效率的影響

與野生型相比，的超表達(dá)可顯著提高各組織中總P含量(圖4)。其中，與野生型相比，在+P土壤條件下，超表達(dá)株系的劍葉、葉鞘、莖稈、稻殼、穗柄和糙米中總P含量分別提高了12.9%、15.5%、17.1%、22.0%、56.3%和17.3%； ?P土壤條件下，分別提高了61.4%、48.1%、53.6%、38.4%、61.0%和47.4%(圖4)。

為了進(jìn)一步研究在不同P環(huán)境下的超表達(dá)對(duì)水稻磷素的吸收與利用影響，我們統(tǒng)計(jì)并計(jì)算了超表達(dá)株系磷素吸收與利用效率。如圖5所示，的超表達(dá)顯著提高了+P及?P土壤條件下水稻磷素吸收與利用效率。

2.4 OsPT4對(duì)水稻植株形態(tài)、產(chǎn)量及其構(gòu)成的影響

對(duì)+P和?P土壤條件下超表達(dá)株系的農(nóng)藝性狀(株高、單株產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率和千粒重)的統(tǒng)計(jì)分析顯示，?P土壤條件下的水稻各株系生長(zhǎng)發(fā)育均受到不同程度的抑制，并且在兩個(gè)P處理土壤條件下，超表達(dá)株系的長(zhǎng)勢(shì)均優(yōu)于野生型(圖6-A～B)。雖然超表達(dá)株系的株高與野生型相比均出現(xiàn)矮化(圖6-C)，但單株產(chǎn)量均顯著上調(diào)，在+P和?P條件下、和的單產(chǎn)分別平均升高7%和9.1%(圖6-D)。的超表達(dá)并沒有使+P條件下的結(jié)實(shí)率顯著增加，但卻使?P條件下的水稻結(jié)實(shí)率平均增加10.6%(圖6-E)。另外，與野生型相比，超表達(dá)株系的千粒重在+P和?P條件下分別平均升高9.3%和10.7%(圖6-F)。

數(shù)據(jù)均為平均數(shù)（n = 4）；不同字母表示同一時(shí)期內(nèi)各株系在0.05水平上差異顯著。下同。

Fig. 3. Overexpression of OsPT4 increases the biomass and total P concentration under both +P and ?P conditions during vegetative growth stage.

Fig. 4. Overexpression offacilitates the P accumulation of rice under both +P and ?P soil conditions during reproductive growth stage.

圖5 OsPT4的超表達(dá)提高正常供磷和缺磷土壤條件下水稻磷吸收及利用效率

Fig. 5. Overexpression offacilitates the Pi uptake and use efficiency of rice under both +P and ?P soil conditions.

圖6 OsPT4超表達(dá)材料在正常供磷與缺磷土壤中的農(nóng)藝性狀分析

Fig. 6. Phenotype ofoverexpressing lines grown in +P and ?P soil conditions.

2.5 OsPT4對(duì)水稻磷素和氮素利用率的影響

在+P條件下，超表達(dá)株系癟殼中的總氮含量與WT無顯著性差異，而糙米中的總氮含量比野生型平均高8.5%。?P條件下的超表達(dá)導(dǎo)致癟殼及糙米中總氮含量均顯著升高，其中癟殼平均增加16.8%，糙米中的平均上升19.8%(圖7-A)。與WT相比，在?P條件下，的超表達(dá)使生理氮素利用率顯著升高(圖7-B)；然而在+P條件下，兩者無顯著性差異。

3 討論

已有報(bào)道顯示，為高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)磷素的吸收與向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。定量與組織定位結(jié)果表明，在根部的表達(dá)明顯強(qiáng)于地上部葉片，在生殖生長(zhǎng)階段，在胚中的表達(dá)較為強(qiáng)烈，而在胚乳和穗柄中的表達(dá)較弱[16]。本研究對(duì)水稻幼穗分化期和孕穗期表達(dá)模式的檢測(cè)也印證了其在根系中表達(dá)量最高的結(jié)果，這一表達(dá)模式特點(diǎn)與其他幾種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因也十分相似(、、和)[12, 15, 17]。同時(shí)，繁育器官(包括未成熟小穗、花梗、花軸和小穗)中的相對(duì)表達(dá)量較低(圖1)，這說明孕穗期及幼穗分化期可能主要行使根系從土壤中吸收P的功能，而非P向繁育器官的轉(zhuǎn)運(yùn)。

在作物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，由于P易于固定在土壤中，且利用效率非常低，P饑餓已成為提高作物產(chǎn)量和改善質(zhì)量的主要限制因素之一[34]。前期研究證明，對(duì)水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期根系對(duì)P的吸收起促進(jìn)作用，且同時(shí)負(fù)責(zé)磷素由根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，其超表達(dá)可顯著提高+P和?P條件下根系和地上部的總P及無機(jī)態(tài)P含量[16, 35]。對(duì)超表達(dá)株系在不同P處理水培條件下的總P檢測(cè)也證實(shí)了這一結(jié)果(圖3)。然而，目前對(duì)在生殖生長(zhǎng)階段不同P土壤環(huán)境下對(duì)水稻P動(dòng)態(tài)平衡，及其對(duì)該時(shí)期P吸收與利用效率的影響仍知之甚少。對(duì)生殖生長(zhǎng)期超表達(dá)材料在不同P處理土壤條件下不同組織中總P含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無論是+P還是?P條件下，的超表達(dá)均可提高營(yíng)養(yǎng)組織和繁育組織中的總P積累(圖4)。這些結(jié)果說明不僅可以促進(jìn)+P土壤環(huán)境下水稻生殖生長(zhǎng)階段各組織中的P積累，同時(shí)也可增加?P環(huán)境下各組織中的P積累。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)+P和?P土壤環(huán)境下的P吸收與利用效率(圖5)?？梢娫谒旧笃赑的吸收與利用過程中起重要作用。已知的超表達(dá)促進(jìn)+P土壤條件下的單株產(chǎn)量、千粒重以及胚的發(fā)育[16]。本研究結(jié)果顯示，不僅可以增加+P條件下單株產(chǎn)量及千粒重，還可增加?P條件下的結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量及千粒重(圖6)。由此可推斷，提高水稻在?P土壤中P的積累及利用效率，促進(jìn)了繁育器官的發(fā)育，增加?P條件下的水稻產(chǎn)量。

圖7 正常供磷和缺磷土壤中OsPT4超表達(dá)材料繁育器官總氮含量及水稻生理氮素利用率

Fig. 7. Total N concentration in reproductive tissues and physiology N use efficiency ofoverexpressing lines under both +P and ?P soil conditions.

P和N是植物生長(zhǎng)發(fā)育的兩種最重要的大量營(yíng)養(yǎng)元素。近年來，N和P養(yǎng)分間的互作受到人們的關(guān)注。在擬南芥、水稻和玉米中，N缺乏可改變P中心轉(zhuǎn)錄因子PHR1半衰期及其積累，從而影響P的調(diào)控通路[21, 23, 25, 26, 28]。雖然磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與N和P互作通路，但其對(duì)不同P條件下N利用的影響尚未可知。本研究顯示，在水稻生殖生長(zhǎng)階段，的超表達(dá)可顯著提高?P條件下癟殼中以及+P與?P條件下籽粒中的總氮含量，并可使?P條件下生理氮素利用率明顯上調(diào)(圖7)。由此可見，作為高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)水稻?P條件下的氮素利用率同樣具有促進(jìn)作用。這一結(jié)果為水稻N和P的互作關(guān)系及互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的完善提供了理論依據(jù)。綜合以上結(jié)果可知，的超表達(dá)在協(xié)同促進(jìn)水稻P的吸收與利用以及?P土壤條件下的N利用中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，也說明在水稻依賴于外界P供應(yīng)的N素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能行使重要功能，這一部分的機(jī)理研究仍有待于進(jìn)一步深入。

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Research on the Mechanisim of OsPT4 Regulating the Accumulation and Utilization of Nitrogen and Phosphorus in Rice

SUN Yafei#, SONG Ke#, QIN Qin, SUN Lijuan, XUE Yong*

(Shanghai 201403, China; These authors contributed equally to this work; Corresponding author: E-mail, exueyong@163.com)

【】The phosphate (Pi) transporter, OsPT4, is a member of the Pht1 family of rice, responsible for Pi uptake and transportation. It is important to explore the effect ofoverexpression on nitrogen (N) and phosphorous (P) accumulation and utilization in rice under different Pi conditions and its mechanism. 【】The-overexpressing lines with Nipponbare background were used as material. Through the hydroponic and pot-cultivated experiments with (+Pi) or without Pi (?Pi) supply, the relative expression ofin different tissues during reproductive growth stage was detected. The N and P concentrations in different tissues (leaf blade, leaf sheath, stem, rice hull, panicle axis and brown rice) under different Pi treatments were also measured. In addition, the Pi absorption rate and N/P use efficiency were calculated, and the plant height, yield per plant, 1000-grain weight and seed setting rate were analyzed. 【】The relative expression ofwas higher in rice roots during reproductive growth stage. Overexpression ofincreased the total P concentration in rice flag leaf blade, leaf sheaths, stems, rice hull, panicle axis and brown rice to varying degrees, and significantly improved the Pi absorption and use efficiency under different Pi regimes. Meanwhile,overexpression could significantly increase the yield per plant, 1000-grain weight and seed setting rate in +Pi and ?Pi soils. In addition, the overexpression ofalso increased the total N concentration in unfilled rice hull and brown rice by 16.8% and 19.8%, and the N use efficiency by 6.6% under Pi-deficiency. 【】The overexpression ofnot only promotes the Pi uptake and use efficiency, but also facilitates the physiology N use efficiency in different Pi conditions.

phosphorus; nitrogen;; phosphorus use efficiency; nitrogen use efficiency

10.16819/j.1001-7216.2021.200803

2020-08-03；

2020-12-04。

上海市青年英才揚(yáng)帆計(jì)劃資助項(xiàng)目(19YF1443200)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科推字(2020)2-1]；國家青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31902102)；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家自然科學(xué)基金匹配項(xiàng)目[生科創(chuàng)-GT2020（匹配-3）]；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院卓越團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助項(xiàng)目[2017（A-03）]。