非洲豬瘟病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

劉 濤李永秀康亞男郭 禹劉朋朋柳 珊

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001；2瑞普 （保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；3河北科醫(yī)生物技術(shù)有限公司，河北保定 072750；4天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病臨床上以高熱、皮膚和內(nèi)臟廣泛性出血、腹瀉、死亡為主要特征，其是目前已知的唯一的1個DNA蟲媒病毒[1]。ASFV成熟病毒粒子共編碼54種結(jié)構(gòu)蛋白[2]，其中p30、p54和p72在抗原檢測中應(yīng)用較為廣泛，研究表明，p30蛋白在非洲豬瘟病毒感染早期表達(dá)，適用于ASF疫病的早期診斷；而p54蛋白的免疫原性較好，結(jié)構(gòu)保守，在機(jī)體中產(chǎn)生抗體時間早且持續(xù)時間長久；p72蛋白在病毒感染后的晚期進(jìn)行表達(dá)，保守性較強(qiáng)且免疫原性好，是目前研究最多的用于診斷的結(jié)構(gòu)蛋白[3]。核酸檢測PCR技術(shù)通常根據(jù)ASFV的B646L基因的高度保守區(qū)來設(shè)計引物和探針，對疑似病例進(jìn)行檢測，在此方法中，PCR的擴(kuò)增效率會因引物的位置和堿基組成不同而存在一定差異[4]，本文將對非洲豬瘟的實驗室檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為非洲豬瘟防控提供參考。

1 非洲豬瘟傳播概況

20世紀(jì)初，非洲豬瘟病毒最早發(fā)現(xiàn)于東非地區(qū)，1957年在伊比利亞半島流行；20世紀(jì)中期，擴(kuò)散至西非、加勒比、西歐、東歐等多個國家和地區(qū)[5]。2007年非洲豬瘟疫情首次傳入高加索地區(qū)，2009年進(jìn)入俄羅斯，2012年從俄羅斯轉(zhuǎn)向烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯[6]。2018年8月，在我國遼寧沈陽首次發(fā)生了非洲豬瘟疫情，隨后在我國的31個省份陸續(xù)點(diǎn)狀散發(fā)。非洲豬瘟的高傳播速度和高致死率一度導(dǎo)致我國生豬、豬肉及相關(guān)產(chǎn)品供給緊張、價格高漲。非洲豬瘟對全球養(yǎng)豬業(yè)都造成了嚴(yán)重的影響，僅2020年全球就有27個國家和地區(qū)發(fā)生了2 538起家豬疫情和8 188起野豬疫情，共計10 726起。

目前，全球還沒有商品化大量生產(chǎn)的ASF疫苗。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所正在研發(fā)的疫苗有2種，分別是非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗（HLJ/18-7G D株）和非洲豬瘟弱毒活疫苗（HLJ/18-7GD株），這2種疫苗均獲得了2020年的臨床試驗批件。其中，非洲豬瘟弱毒疫苗于2020年底完成了其實驗室創(chuàng)制、中間試制、生物安全環(huán)境釋放試驗及第一階段臨床試驗等，且該弱毒疫苗的生物安全生產(chǎn)試驗和第二階段臨床試驗也在推進(jìn)中。其實當(dāng)前仍沒可以商業(yè)化生產(chǎn)的非洲豬瘟疫苗，因此在非洲豬瘟疫苗上市之前，病原的及時檢測和嚴(yán)格的生物安全措施仍是防控非洲豬瘟的主要手段。

2 非洲豬瘟病毒的檢測技術(shù)

隨著非洲豬瘟疫情在全球的不斷發(fā)展，抗原、抗體快速診斷技術(shù)、方法層出不窮，國內(nèi)外科研人員建立了多項抗原和抗體檢測技術(shù)，并在檢測實驗室臨床應(yīng)用。國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方面，2020年12月14日國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布了《非洲豬瘟診斷技術(shù)》(GB/T 18648-2020)[7]，分別從非洲豬瘟病毒核酸檢測、病毒完整顆粒檢測和非洲豬瘟病毒抗體檢測等3方面規(guī)定了非洲豬瘟病毒的實驗室診斷技術(shù)和方法。其中，非洲豬瘟病毒核酸檢測技術(shù)包括普通PCR檢測法、熒光定量PCR檢測法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)、微流控芯片檢測法5種。非洲豬瘟病毒完整顆粒檢測方法包括病毒的分離培養(yǎng)技術(shù)、夾心ELISA抗原檢測法和高敏熒光分析法3種。非洲豬瘟病毒抗體檢測方法包括膠體金免疫層析技術(shù)和ELISA抗體檢測方法2種。

2.1 非洲豬瘟病毒核酸檢測技術(shù)

2.1.1 普通PCR檢測法

世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的PCR檢測法是針對ASFV的vp73基因設(shè)計引物后擴(kuò)增出257 bp基因片段，來確診該病的[8]。Giammarioli等[9]則通過研究建立了非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等5種病毒的多重PCR檢測，多重PCR檢測法緩解了實驗人員檢測多個病毒需要多次檢測才能實現(xiàn)的壓力。目前，PCR技術(shù)以其快速、靈敏的檢測特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于ASFV的實驗室診斷，但PCR技術(shù)在對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析時也存在一定的缺陷，即PCR擴(kuò)增時需要開蓋二次加引物，容易造成樣品的交叉污染而出現(xiàn)假陽性。此外，待檢樣品中可能存在的酶也會抑制病毒核酸的檢出，從而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[10]。

2.1.2 熒光定量PCR檢測法

熒光定量PCR檢測法是檢測核酸樣品由定性到定量的轉(zhuǎn)變，同時提高了核酸檢測的敏感性、特異性及檢測效率等。OIE推薦的熒光定量PCR檢測法是依據(jù)ASFV的B646L基因保守序列設(shè)計的探針[11]進(jìn)行病毒基因擴(kuò)增。王彩霞等[12]則根據(jù)非洲豬瘟病毒CD2v基因序列，設(shè)計了TaqMan熒光PCR引物和探針，建立了ASFV的TaqMan實時熒光PCR檢測法，且其最低檢測下限可達(dá)到10 copies/L。史喜菊等[13]建立了豬瘟、非洲豬瘟和豬水泡病毒等多重?zé)晒釸T-PCR同步檢測和鑒別診斷方法，三重?zé)晒釶CR可以達(dá)到與單重?zé)晒釶CR相等的指標(biāo)參數(shù)，實現(xiàn)同時檢測和鑒別3種病毒的目的。

2019年中國動物疫病預(yù)防控制中心等單位合作研發(fā)的熒光PCR檢測ASFV試劑盒獲得二類新獸藥注冊，后續(xù)國內(nèi)又有4項同類產(chǎn)品注冊成功。2020年12月新發(fā)行的《非洲豬瘟診斷技術(shù)》[7]將國內(nèi)檢測非洲豬瘟病毒的主要方法定為以ASFV的vp72基因保守序列為靶標(biāo)建立的熒光定量PCR檢測法。

2.1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

2000年，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）作為一種由BST酶介導(dǎo)的且反應(yīng)溫度單一的恒溫核酸擴(kuò)增新技術(shù)出現(xiàn)并廣泛應(yīng)用[14]。隨后，王林等[15]根據(jù)p72基因設(shè)計引物，建立了基于SYTO9熒光染料的實時熒光LAMP快速法檢測非洲豬瘟病毒，該方法最低可檢測基因片段的量為10 copies/μL，與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的熒光定量PCR法檢測結(jié)果的符合率為100%，具有反應(yīng)速度快（40 min）、靈敏度高、操作簡便、不易污染、適用儀器廣等優(yōu)勢。2019年，北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)研發(fā)了檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，并成功注冊成為第一個利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測非洲豬瘟病毒的檢測試劑盒。

2.1.4 重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

近年來，重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法（RAA）檢測基因技術(shù)日益興起，重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法運(yùn)用的酶主要是細(xì)菌或真菌的重組酶。細(xì)菌和真菌的重組酶與噬菌體的重組酶相比其來源廣泛、對溫度的適應(yīng)性強(qiáng)[16]。趙凱穎等[17]運(yùn)用重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增了非洲豬瘟病毒的p72基因序列，在擴(kuò)增過程中，該方法表現(xiàn)出靈敏度高和用時短的特點(diǎn)，其靈敏度可達(dá)10 copies/μL，且檢測時長僅需10 min。目前，我國在運(yùn)用重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法檢測非洲豬瘟病毒時，推薦以病毒B646L基因的保守序列為檢測靶標(biāo)，利用熒光標(biāo)記的探針追蹤目的片段進(jìn)行檢測[7]。重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增檢測法在靈敏度和反應(yīng)用時方面都有一定的優(yōu)勢，且具有廣闊的發(fā)展前景。

2.1.5 微流控芯片檢測法

微流控芯片技術(shù)（microfluidic chip technology）是20世紀(jì)90年代提出的一種借助微米級通道操控微液滴流動的新型技術(shù)，近年來有研發(fā)人員將該方法與光學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合，使其在生物醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域得到了全新的應(yīng)用與發(fā)展。微流控芯片法作為被推薦的即時檢驗檢測ASFV的方法被列入我國2021年7月份實施的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中[18]，該方法針對ASFV的p72基因序列設(shè)計特異性引物，并將其固定于芯片反應(yīng)室后對芯片進(jìn)行封裝，隨后把提取的核酸模板與含有SYBR Green熒光染料的反應(yīng)液混合后加入到封裝好的芯片內(nèi)，借助帶有離心功能、恒溫功能及實時熒光檢測一體化的微流控芯片檢測儀對產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行收集與分析，從而達(dá)到對ASFV檢測的目的。該方法將樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本單元集成到微米級尺寸的芯片上，然后自動完成分析全過程，不受試驗場地及條件限制，可實現(xiàn)“樣本進(jìn)，結(jié)果出”的便捷檢測，適合現(xiàn)場快速檢測。

2.2 非洲豬瘟病毒完整顆粒檢測方法

2.2.1 非洲豬瘟病毒的分離培養(yǎng)

非洲豬瘟病毒的分離與培養(yǎng)是OIE推薦的診斷非洲豬瘟病毒的黃金標(biāo)準(zhǔn)，一般采用紅細(xì)胞吸附試驗（HAD）進(jìn)行ASFV的分離確診。首先將可能攜帶病毒的組織分離，如豬的血液、淋巴結(jié)、脾臟等，然后取病料樣品進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分離病毒粒子，再將病料培養(yǎng)的病毒粒子接種在原代白細(xì)胞中，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect,CPE），最后取健康豬的血液與接種的白細(xì)胞共同孵育，顯微鏡下觀察白細(xì)胞的變化，如果白細(xì)胞表面有大量豬紅細(xì)胞附著，則判定為陽性[19]。該方法試驗周期較長，且直接接觸病原可能會增加病原體擴(kuò)散污染的風(fēng)險，此外，應(yīng)用該方法時，如果待檢樣品中病毒載量較低，則白細(xì)胞表面附著紅細(xì)胞的現(xiàn)象不明顯，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此不適用于現(xiàn)場大量檢測。

2.2.2 夾心ELISA抗原檢測法

雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法主要是將特異性反應(yīng)抗體的固相載體包被在96孔板中，然后向96孔中加入待檢樣品（抗原）及酶標(biāo)記抗體共同孵育，使抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體結(jié)合后，根據(jù)反應(yīng)液的顏色反應(yīng)來判斷抗原含量，從而達(dá)到對待檢樣品進(jìn)行定性或定量分析的方法。Vidal和Aydin等[21,22]利用夾心ELISA抗原檢測法檢測了非洲豬瘟病毒p72基因的單克隆抗體。當(dāng)前，我國制定的檢測非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)是將ASFV p30蛋白單克隆抗體作為包被抗體，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的p30蛋白單抗（針對p30蛋白不同表位）作為酶標(biāo)抗體對待檢樣品進(jìn)行檢測[8]。此法操作較簡便，可降低假陽性風(fēng)險。

2.2.3 高敏熒光免疫分析法

高敏熒光免疫分析法是將鑭系元素與免疫層析技術(shù)結(jié)合的一種分析方法。該方法是針對目的基因片段設(shè)計引物或探針時，在引物或探針上標(biāo)記或包埋鑭系螯合物作為熒光信號，最后參照熒光標(biāo)準(zhǔn)信號的濃度曲線對待測樣品的目的基因片段濃度進(jìn)行定量檢測[20]，我國新實行的非洲豬瘟檢測標(biāo)準(zhǔn)中以鑭系元素螯合物為追蹤信號，結(jié)合抗原抗體免疫層析技術(shù)，達(dá)到檢測ASFV抗原的目的[8]。

2.3 非洲豬瘟病毒抗體檢測方法

2.3.1 膠體金免疫層析技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)（Immune Colloidal Gold Technique）是一種以膠體金為示蹤標(biāo)志物的抗原抗體免疫標(biāo)記技術(shù)。張鑫宇等[23]運(yùn)用此方法建立了ASFV的p54抗體檢測膠體金免疫分析試紙條，該試紙條的臨床檢測樣品的準(zhǔn)確率高于OIE推薦的ELISA檢測法。吳海濤等[24]以原核表達(dá)的PET-30A-P72蛋白作為抗原免疫兔子制備陽性血清，以雜交瘤細(xì)胞株接種小鼠獲得ASFV的單克隆抗體，建立了ASFV膠體金免疫層析法試紙條，該試紙條的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性均較好。膠體金免疫層析法操作簡單、快速，不需要儀器，適用于對國內(nèi)大型豬場的疫病監(jiān)測及大規(guī)模排查。

2.3.2 ELISA抗體檢測方法

ELISA抗體檢測是目前血清學(xué)檢測中最常用的方法。Pastor等[25]利用非洲豬瘟病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中高特異胞質(zhì)可溶性抗原（CS-P）作為包被抗原建立的間接ELISA抗體檢測法適用于ASFV感染的早期檢測。曹琛福等[26]基于非洲豬瘟病毒的p54蛋白建立了阻斷ELISA抗體檢測法，該法成為深圳市地方檢測非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國有2種檢測非洲豬瘟病毒的ELISA抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)，分別是以包被抗原桿狀病毒表達(dá)的P30重組蛋白建立的間接和阻斷ELISA抗體檢測法、和以包被抗原P54重組蛋白建立夾心ELISA抗體檢測法[7]。ELISA檢測法適用于ASFV抗體檢測，主要用于ASF流行區(qū)域的低毒力ASFV感染的豬只，隨著基因缺失弱毒疫苗的研發(fā)，未來還需要配套區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的抗體檢測技術(shù)。

3 國內(nèi)非洲豬瘟病毒診斷制品的注冊情況

中國動物疫病預(yù)防控制中心于2018年12月和2019年4月分別組織了2次非洲豬瘟病毒現(xiàn)場快速檢測試劑評價工作。2019年6月11日公布第二批通過評價的34項檢測試劑名單，包括28項熒光定量PCR類和6項等溫擴(kuò)增類檢測試劑產(chǎn)品，試紙條類產(chǎn)品全部未通過評價。

2020年8月27 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳發(fā)布《關(guān)于非洲豬瘟病毒診斷制品生產(chǎn)經(jīng)營使用有關(guān)事宜的通知》，要求自2020年9月1日起，未在通過評價的34項檢測試劑名單中，以及名單中目前未申請注冊的ASFV診斷制品，一律停止生產(chǎn)經(jīng)營；自2021年1月1日起，全部使用已取得批準(zhǔn)文號的ASFV診斷制品。

截至2021年9月中旬，全國有5項非洲豬瘟檢測試劑通過新獸藥注冊評審，獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的《新獸藥注冊證書》 （見表1）；有13家企業(yè)、10項不同產(chǎn)品（12項熒光PCR法、1項等溫擴(kuò)增法）獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號（見表2），其中3項同表1列出的《新獸藥注冊證書》產(chǎn)品、3項為改良型獸醫(yī)診斷制品，直接核發(fā)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號。

表1 非洲豬瘟檢測試劑新獸藥注冊證書列表

表2 非洲豬瘟檢測試劑批準(zhǔn)文號列表

4 小結(jié)

自2018年非洲豬瘟疫情在我國發(fā)生以來，ASFV抗原、抗體檢測技術(shù)飛速發(fā)展，為應(yīng)對非洲豬瘟疫情，中國動物疫病預(yù)防控制中心通過3次非洲豬瘟病毒現(xiàn)場快速檢測試劑評價，選出了幾十種可用于非洲豬病病毒檢測的試劑，供檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)急使用。通過新獸藥注冊診斷制品的批準(zhǔn)上市和新版《非洲豬瘟診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)出臺，為非洲豬瘟疫情監(jiān)測提供了技術(shù)保障。隨著疫情的蔓延，ASFV的防控和凈化是長期的過程，對ASFV的早期診斷以及免疫后抗體水平檢測的需求也不斷提升，快速、準(zhǔn)確、便捷的診斷技術(shù)是控制和預(yù)防非洲豬瘟的重要手段。