DNA疫苗多次重復(fù)接種對特異性抗體滴度和親合力影響

王 靜，劉 洋，田向向，曲仕釗，閆冬梅

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154007)

疫苗是控制和消滅傳染病主要手段，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要成就之一。然而，受限于對機體免疫防御機制的認(rèn)識，傳統(tǒng)疫苗研發(fā)主要依賴實踐經(jīng)驗積累。近年來，伴隨著基礎(chǔ)免疫學(xué)和病原生物知識與技術(shù)手段的不斷拓展，疫苗研發(fā)開始擺脫對“經(jīng)驗”的依賴，逐漸向“理性”疫苗設(shè)計邁進。

完全實現(xiàn)疫苗的“理性”設(shè)計是一項艱巨的科學(xué)挑戰(zhàn)，原因是影響疫苗潛在因素眾多，這些因素包括：宿主的內(nèi)在因素(如：性別、年齡、定植微生物群以及感染等)[1-2]、環(huán)境因素(如：地理位置、季節(jié)等)[3-4]、目標(biāo)病原體因素以及疫苗因素等等。在上述因素中，尤以疫苗因素與疫苗設(shè)計的關(guān)系最為密切，以往研究顯示疫苗的類型、接種劑量以及接種部位均會影響個體對疫苗的免疫應(yīng)答[5]。此外，疫苗接種次數(shù)顯而易見的也是影響免疫應(yīng)答強度和質(zhì)量的重要因素，然而經(jīng)過系統(tǒng)地文獻回顧我們發(fā)現(xiàn)僅有少量研究對該問題進行過正面探討[6-7]。但是，艾滋病、瘧疾以及廣譜流感疫苗研發(fā)所遭遇的困難提醒我們，傳統(tǒng)疫苗研發(fā)經(jīng)驗并不完善，亟須對影響疫苗效果的因素進行更深入、更全面的分析。

在本研究中，為了探討疫苗接種次數(shù)與特異性免疫應(yīng)答，特別是與抗體應(yīng)答之間的關(guān)系，我們利用表達OVA 的 DNA疫苗作為模式疫苗，在重復(fù)接種小鼠的過程中在多個時間點采樣并檢測了OVA特異性抗體應(yīng)答在重復(fù)接種過程中的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物c57BL/6小鼠，6～8周齡，16只，雌、雄各8只。購自上海南方模式生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物中心SPF級動物房。室內(nèi)安靜整潔，溫度控制在(22±2)℃，單籠飼養(yǎng)(12 h黑夜/12 h白晝，早上8: 00開燈)，食物和水供應(yīng)充足。

1.2 疫苗及菌株表達OVA的DNA疫苗由本課題組在前期研究中構(gòu)建完成[8]。用于小鼠接種的OVA DNA疫苗均使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒(Plasmid Giga Kit)制備并溶于無菌PBS中。

1.3 主要試劑及儀器感受態(tài)細(xì)胞，cat#D0351，碧云天生物技術(shù)公司；Plasmid Giga Kit，cat#12191，QiaGEN；高親和力EIA板，cat#9018，CORNING；OVA抗原，A5503，Sigma； Goat anti-mouse IgG-HRP，cat#115-035-003，Jackson Immuno Research；Goat anti-Mouse IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3，cat#ab97240、ab97250、ab97255、ab97260，Abcam；TMB，cat#NO.MG882，上海邁基生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基，REF#10-040-CVR，CORNING；胎牛血清(FBS)，REF#10091，Gbico；ELISPOT試劑盒，cat#551083，BD；PMA，cat#P8139，sigma；Ionomycin，cat#407953，sigma；OVA/Pep，cat# 04010006545，上海強耀生物科技有限公司；800TS酶標(biāo)儀，Biotek；水浴鍋、MTX-超速離心機、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo；ELISPOT儀，北京安泰永信醫(yī)療科技有限公司。

1.4 疫苗接種與樣本采集免疫規(guī)劃如圖1所示，每只小鼠每次肌注接種50 μg OVA DNA疫苗，連續(xù)接種8次，每次間隔2周。每次疫苗接種前先通過下頜靜脈穿刺采集50 μL外周血，并且在第8次免疫結(jié)束后第4周、第6周采集小鼠外周血，于第6周時對小鼠實施安樂死，采集外周血和脾臟細(xì)胞進行免疫學(xué)檢測。

圖1 疫苗接種與采樣規(guī)劃

1.5 OVA特異性結(jié)合抗體(IgG)及其亞類檢測用pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋OVA抗原至1 μg/mL，加入高親和力96孔EIA板中，100 μL/孔，4 ℃包被過夜。1×PBS洗滌3次，每孔加入200 μL封閉液(5%脫脂奶粉，1×PBS)，37 ℃孵育1 h。PBST(0.05% Tween20，1×PBS)洗5次，取用稀釋液(6%甘油，0.6% Tween20，5%脫脂奶粉，1×PBS)2倍比稀釋后的小鼠血清至各個孔中，每個樣本做1個復(fù)孔，37 ℃孵育1 h。1×PBST洗5次，加入用稀釋液5000倍稀釋后的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。1×PBST洗5次，加入底物TMB 100 μL，室溫避光顯色15 min后上機檢測，取2次結(jié)果的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。小鼠血清中IgG抗體亞類檢測時，操作步驟大部分和血清中特異性IgG抗體檢測一致，只是加入不同的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗即：IgG1、IgG2b、IgG2C、IgG3二抗。

1.6 小鼠血清抗體親和力檢測用pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋OVA抗原至1 μg/mL，50 μL/孔，加入96孔板中，4 ℃包被過夜。1×PBS洗滌3次，加入封閉液，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。1×PBST洗滌5次，加入稀釋液100倍稀釋后的小鼠待測血清，每個樣本做1個復(fù)孔，50 μL/孔，37 ℃孵育1 h。1×PBST洗滌5次，加入8 M尿素[9]，100 μL/孔，剩余孔中加入PBS作為對照，室溫作用15 min。PBST洗2次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，50 μL/孔，37 ℃孵育1 h。1×PBST洗滌5次，向96孔板中加入底物TMB 顯色，50 μL/孔，室溫避光顯色15 min后上機檢測，取2次結(jié)果的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 小鼠脾細(xì)胞OVA特異性IFN-?分泌量檢測通過使用小鼠IFN-γ ELISPOT試劑盒對小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ分泌情況進行檢測。1×PBS稀釋IFN-γ捕獲抗體，100 μL/孔，4 ℃過夜。R10洗板一次，200 μL/孔。加入封閉液(R10)，200 μL/孔，室溫靜置2 h。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL， 50 μL/孔，每個樣本做1個復(fù)孔。向孔板中加入陰性對照(R10)，肽刺激物(OVA/Pep，20 μg/mL)，陽性刺激物(PMA，0.5 μg/mL；Ionomycin，0.5 μg/mL)各50 μL，剩余體積用R10補齊，37 ℃孵育24 h。去離子水洗板2次，PBST(PBS+0.05% tween20)洗板3次。加入檢測抗體100 μL/孔，室溫靜置2 h。PBST洗板3次，加入HRP標(biāo)記的酶，100 μL/孔。室溫靜置1 h。PBST洗板4次，1×PBS洗板2次。每孔加入100 μL底物，等待斑點顯色，顯色時間：5～60 min，水沖洗停止顯色。室溫放置96孔板干透后，上機檢測，取2次結(jié)果的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖。兩組間均值的比較采用t檢驗分析，多組間均值的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05判定為組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 多次反復(fù)免疫接種過程中OVA特異性結(jié)合抗體(IgG)滴度的動態(tài)檢測分析小鼠免疫結(jié)束后，我們利用ELISA方法對小鼠血清中的OVA特異性IgG抗體進行了檢測。檢測結(jié)果顯示，免疫接種過程中，雌、雄小鼠體內(nèi)OVA特異性結(jié)合抗體滴度變化趨勢基本一致：經(jīng)過三次免疫之后，OVA特異性結(jié)合抗體滴度升至1×104，而后續(xù)的免疫接種不能使之繼續(xù)得到提高(圖2)。此外，我們也注意到，盡管雌、雄小鼠的總體抗體應(yīng)答趨勢相似，但依然存在一些差異。例如，經(jīng)過兩次免疫之后，雌鼠血清中的平均OVA特異性結(jié)合抗體水平已經(jīng)明顯高于基線水平，而雄鼠體內(nèi)OVA特異性抗體仍然維持在基線水平(圖2)。再如，在第8次免疫結(jié)束6周后，雌鼠體內(nèi)OVA特異性抗體滴度仍然維持在1×104倍以上，而雄鼠的抗體滴度則呈現(xiàn)出下降趨勢(圖2)。

圖2 重復(fù)免疫接種過程中，小鼠體內(nèi)OVA特異性抗體滴度的動態(tài)檢測分析(n=16)

2.2 多次重復(fù)免疫接種過程中小鼠體內(nèi)OVA特異性結(jié)合抗體親合力的動態(tài)變化分析利用尿素溶液洗脫法對OVA特異性抗體的親合力進行了檢測分析。結(jié)果顯示，在1：100稀釋度下，高親合力抗體(8 M尿素洗滌后剩余的結(jié)合抗體)(圖3A)，特別是親合力指數(shù)(8 M尿素洗滌后OD值/8 M尿素洗滌前OD值)(圖3B)，在第7次接種之前持續(xù)維持在較低水平。經(jīng)過3次免疫接種后，高親合力抗體水平較基線顯著升高(圖3A)，并在隨后的較長時間內(nèi)維持穩(wěn)定，直至第7次接種后再次顯著升高(圖3A)。而在整個接種過程中，親合力指數(shù)的升高只出現(xiàn)在第7次免疫之后(圖3B)，第3次免疫接種未能提高OVA特異性抗體的親合力指數(shù)。

圖3 小鼠體內(nèi)OVA特異性抗體親合力的動態(tài)監(jiān)測

2.3 重復(fù)免疫過程中OVA特異性IgG抗體的亞類構(gòu)成分析為了監(jiān)測小鼠體內(nèi)OVA特異性IgG在反復(fù)免疫過程中的亞類轉(zhuǎn)換情況，我們選取第3次、第7次、第8次接種2周后以及第8次接種4周、6周后的血清樣本進行了OVA特異性IgG亞類分析。檢測結(jié)果顯示，在免疫接種全程中，OVA特異性IgG的亞類構(gòu)成維持穩(wěn)定，并未發(fā)生亞類重大的轉(zhuǎn)換。其中IgG2c應(yīng)答強度最高，IgG2b次之，IgG1再次，而IgG3的應(yīng)答強度始終最低(圖4)。

圖4 小鼠血清中OVA特異性IgG的亞類構(gòu)成分析(n=16)

2.4 8次免疫結(jié)束后，雌、雄小鼠之間脾細(xì)胞IFN-γ分泌量的對比分析在第8次免疫結(jié)束后6周，我們對小鼠實施安樂死并采集小鼠脾淋巴細(xì)胞進行了OVA特異性IFN-γ 分泌量的檢測。IFN-γ ELISPOT檢測結(jié)果顯示，雌鼠脾臟中OVA特異性IFN-γ分泌細(xì)胞的頻率顯著高于雄鼠(圖5A)，其OVA特異性IFN-γ分泌量(總熒光強度)也顯著高于雄鼠(圖5B)。

圖5 8次免疫結(jié)束后，雌、雄小鼠體內(nèi)OVA特異性IFN-γ分泌量檢測

3 討論

傳統(tǒng)疫苗主要通過誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體來發(fā)揮保護作用[10]，抗體水平因而成為評估疫苗效果和優(yōu)化疫苗設(shè)計的重要參考依據(jù)。為了優(yōu)化疫苗的免疫效果，以往研究從疫苗劑量、接種時間安排以及疫苗佐劑等多個方面進行了優(yōu)化研究[3]，然而對疫苗接種次數(shù)與抗體應(yīng)答之間關(guān)系的認(rèn)知目前仍然比較欠缺。在研發(fā)艾滋病疫苗和瘧疾疫苗的過程中，這一問題的重要性體現(xiàn)的尤為突出，因為按照傳統(tǒng)疫苗經(jīng)驗制定的疫苗接種安排不能誘導(dǎo)產(chǎn)生高質(zhì)量的抗體應(yīng)答[11]。為了解決這個問題，國外研究團隊于近期提出了一種抗原長時間持續(xù)遞送的疫苗接種方法，并初步證實其有助于促進特異性抗體的親和力成熟[8,12]。雖然該方法在目前尚不具備實用價值，但是從理論層面證實了持續(xù)的抗原刺激有助于誘導(dǎo)產(chǎn)生高質(zhì)量特異性抗體。與上述研究不同，在本文中我們從實際應(yīng)用角度出發(fā)，利用小鼠模型探討了通過反復(fù)多次疫苗接種來改善抗體應(yīng)答的可行性。

我們的研究結(jié)果顯示，經(jīng)過3次DNA疫苗接種之后，小鼠體內(nèi)OVA特異性結(jié)合抗體(IgG)的滴度顯著升高，后續(xù)的重復(fù)接種不能繼續(xù)提高小鼠血清中OVA特異性結(jié)合抗體的滴度，該現(xiàn)象與以往研究中觀察到的抗體應(yīng)答上限現(xiàn)象一致[13]。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)雖然雌、雄小鼠體內(nèi)抗體滴度的總體變化趨勢一致，但雌鼠趨向于更快地產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并且，在疫苗接種結(jié)束后雌鼠體內(nèi)的抗體水平更穩(wěn)定。

在測定OVA特異性抗體滴度的同時，我們采用尿素洗滌法測定了OVA特異性抗體的親合力，發(fā)現(xiàn)抗體親合力的提高顯著滯后于抗體滴度的上升，抗體滴度在三次免疫之后顯著升高，而抗體親合力尤其是親合力指數(shù)是在第7次免疫后顯著升高。親合力是反應(yīng)特異性抗體應(yīng)答質(zhì)量的重要指標(biāo)，我們的研究結(jié)果證明了通過間斷性的、反復(fù)的抗原暴露可以有效提高特異性抗體的親合力，為疫苗免疫方案制定提供了新依據(jù)。為了考察OVA特異性抗體親合力的升高是否伴隨著IgG亞類構(gòu)成的變化，我們運用ELISA法對小鼠體內(nèi)OVA特異性IgG的亞類構(gòu)成進行了檢測，結(jié)果顯示疫苗接種全程中OVA特異性IgG的亞類構(gòu)成保持穩(wěn)定。有研究報道顯示，在反復(fù)接種癌癥疫苗的過程中，隨著接種次數(shù)的增加部分癌癥患者體內(nèi)抗原特異性IgG的亞類構(gòu)成發(fā)生變化[14]。這與我們的實驗結(jié)果不一致，我們推測宿主種屬(人vs小鼠)以及疫苗形式(蛋白亞單位疫苗vs DNA疫苗)的不同可能是導(dǎo)致差異的主要因素，但確切機制有待進一步研究。

除了觀察疫苗接種次數(shù)對抗體應(yīng)答的影響，鑒于性別對免疫應(yīng)答的顯著影響[15]，在本研究的末尾，我們運用IFN-γ ELISPOT試劑盒對小鼠體內(nèi)OVA特異性T細(xì)胞應(yīng)答進行了檢測。我們發(fā)現(xiàn)，盡管雌、雄小鼠抗體應(yīng)答變化的總體趨勢相似，但是疫苗接種結(jié)束后(第8次接種后6周)雌鼠體內(nèi)OVA特異性T細(xì)胞應(yīng)答水平顯著高于雄鼠。需要特別指出的是，本課題得出的研究結(jié)論均是基于核酸(DNA)疫苗模型得出的，是否適用于其它形式疫苗(如滅活疫苗或蛋白亞單位疫苗)目前尚不清楚；此外，對于特異性抗體在第7次接種后陡升的機制目前也并不清楚。這些問題，我們將在后續(xù)研究中逐一解決。

盡管仍然存在未解決的問題，但是通過本研究我們證實了在重復(fù)免疫過程中，抗體親合力成熟顯著晚于抗體滴度的上升，說明通過間斷的重復(fù)免疫接種能夠提高特異性抗體的親合力。這些研究將為今后的疫苗免疫規(guī)劃設(shè)計提供新的理論參考。