桃花精顆粒對(duì)小鼠糖尿病心肌病的影響及機(jī)制

鄧玉清，于曉原，王艷麗，張露露，王四旺

(1.西安荷默奇醫(yī)藥科技有限公司，西安 710075；2.西安交通大學(xué)醫(yī)院，西安 710061；3.西安市人民醫(yī)院，西安 710004；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室，西安 710032)

糖尿病心肌病(DCM)的特征是糖尿病患者在沒有冠心病、全身性高血壓和其他心臟病的情況下，表現(xiàn)出一系列心臟功能障礙和病理結(jié)構(gòu)變化，包括左心室功能障礙、心臟纖維化、心肌肥大和心肌細(xì)胞凋亡等心肌病變[1]。

中醫(yī)雖未記載糖尿病心肌病這一病名，但最早于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中出現(xiàn)的“消渴癥”被認(rèn)為是指現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的糖尿病，且在《諸病源候論》中記載的“消渴重，心中痛”則相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中所指的糖尿病心肌病[2]。中醫(yī)認(rèn)為消渴胸痹病是由長(zhǎng)期的臟腑功能失調(diào)引起的，屬于本虛標(biāo)實(shí)之癥，實(shí)則患者以氣陰兩虛及氣滯血瘀為主要病因。張潤(rùn)云等[3]認(rèn)為氣血虛弱、血脈瘀阻是糖尿病心肌病的病變基礎(chǔ)，治療時(shí)應(yīng)兼顧益氣養(yǎng)陰和活血化瘀。桃花精顆粒(THJG)由桃仁、紅花和黃精按照一定比例配伍后經(jīng)提取制得，本研究旨在探討THJG對(duì)小鼠糖尿病心肌病的影響及其可能的作用機(jī)制，為后續(xù)THJG的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 羅氏血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、電泳儀，均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；美國(guó)Milli-Q Academic型超純水系統(tǒng)(Merck Millipore公司)；光學(xué)顯微鏡(美國(guó)Olympus公司)；VEVO 770型高分辨率成像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)。

1.2試藥 桃花精顆粒(THJG,批號(hào)20190122A，西安荷默奇醫(yī)藥科技有限公司)；鏈脲佐菌素STZ，美國(guó)Genview公司)；HF45高脂飼料(戴茨生物科技有限公司)；血糖試紙(美國(guó)強(qiáng)生公司)；三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒，均購(gòu)自邁瑞醫(yī)療公司；NLRP3單克隆抗體和caspase-1單克隆抗體，均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3動(dòng)物 C57BL/6J小鼠60只，雄性，5周齡，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(軍)字第2018-037號(hào)。小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。人工控制12 h光照，糖尿病心肌病造模前墊料每周更換1次，造模成功后，墊料2 d更換1次，并對(duì)飼養(yǎng)盒進(jìn)行清洗和酒精消毒，飼料每天新加1次，飲水每天更換并清洗飲水瓶。

2 方法

2.1THJG對(duì)小鼠糖尿病心肌損傷的作用

2.1.1造模及給藥 60只小鼠，隨機(jī)取12只作為正常對(duì)照組，腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液，其余操作與造模小鼠保持一致；另48只用于造模。造模前禁食12 h，于第2 天上午腹腔注射STZ(60 mg·kg-1)，連續(xù)3 d，1周后測(cè)空腹血糖，按血糖值分類(分類標(biāo)準(zhǔn)為：大于11.1 mmol·L-1，接近11.1 mmol·L-1和遠(yuǎn)小于11.1 mmol·L-1)，1周后再次測(cè)空腹血糖(空腹血糖>11.1 mmol·L-1視為造模成功)。將成模小鼠按血糖隨機(jī)分為模型組及THJG低(0.32 g·kg-1)、中(0.63 g·kg-1)和高劑量組(1.26 g·kg-1)，每組12只，各組每天灌胃并給予相應(yīng)治療藥物，模型組和正常組給予等容量生理鹽水，給藥周期為3個(gè)月。

2.1.2心臟超聲檢測(cè) 給藥結(jié)束后，將小鼠固定于操作臺(tái)上，備皮，帶上麻醉面罩用10 g·L-1異氟烷吸入麻醉，使小鼠心率保持在400～500次·min-1，并在整個(gè)麻醉過程中放置在溫墊上。將超聲專用耦合劑涂于小鼠胸部，探頭緊密貼合于小鼠胸部，開啟VEVO 770型高分辨率成像系統(tǒng)，使用二維M-mode超聲圖記錄小鼠左室收縮期末期直徑(LVESD)、左室舒張末期直徑(LVEDD)和左室后壁厚度(LVPWD)。用計(jì)算機(jī)算法計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)，所有測(cè)量都是基于6個(gè)連續(xù)的心臟周期，采集超聲心動(dòng)圖和評(píng)價(jià)其心臟功能。

2.1.3生化指標(biāo)檢測(cè) 眼底靜脈叢采血，以3 500 r·min-1離心，分離，取血清，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中TG、HDL-C、LDL-C及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

2.1.4心臟指數(shù)測(cè)定 動(dòng)物摘眼球采血(按照常規(guī)方法分離，取血清，-80 ℃冰箱保存)后，快速分離小鼠心臟，置于盛有預(yù)冷生理鹽水的培養(yǎng)皿中清洗干凈，吸水紙吸干后稱質(zhì)量，按公式心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%計(jì)算心臟指數(shù)。

2.1.5炎癥因子檢測(cè) 從-80℃冰箱取出凍存血清，避光恢復(fù)至室溫，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中炎癥因子白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細(xì)胞趨化因子-1 (MCP-1)含量。將試劑盒從4 ℃冰箱取出恢復(fù)至室溫，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟操作。

3 結(jié)果

3.1THJG對(duì)心功能的影響 小鼠心臟超聲心動(dòng)圖(見圖1)測(cè)算的LVEF和LVFS等結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的LVEF和LVFS下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明小鼠糖尿病心肌病建模成功。與模型組比較，THJG低劑量組小鼠的LVEF和LVFS有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而中劑量和高劑量組的LVEF和LVFS升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。計(jì)算小鼠心臟指數(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠心臟指數(shù)較正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而THJG治療后小鼠心臟指數(shù)呈劑量依賴性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表1 THJG對(duì)小鼠心功能的影響

圖1 各組小鼠超聲心動(dòng)圖

3.2THJG對(duì)生化指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清TG和LDL-C水平升高，而HDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，說明模型組小鼠血脂代謝紊亂；與模型組比較，THJG各劑量組小鼠血清TG和LDL-C含量降低，HDL-C升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；模型組小鼠與正常組比較，血清SOD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；THJG各劑量組治療后小鼠血清SOD水平顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2 THJG對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

3.3THJG對(duì)炎性因子的影響 見表3。模型組小鼠血清中促炎因子IL-6、TNF-α和MCP-1升高，而抗炎因子IL-10降低，與正常組比較相差非常顯著(P<0.01)；與模型組比較，THJG劑量依賴性地降低小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量，升高IL-10(P<0.05或P<0.01)。

表3 THJG對(duì)炎癥因子的影響

4 討論

據(jù)WHO報(bào)道[4]，中國(guó)是糖尿病高發(fā)地區(qū)，且患病年齡不斷年輕化。糖尿病發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家快速增加[5]，給社會(huì)、醫(yī)療造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和防治壓力。糖尿病目前無法根治，患者需終生用藥治療[6]。盡管降血糖藥物全球藥源充足，降血糖療效好，但因其并發(fā)癥導(dǎo)致病情惡化是多數(shù)糖尿病患者的轉(zhuǎn)歸，目前，針對(duì)糖尿病并發(fā)癥尚無有效治療藥物[7]。

據(jù)報(bào)道[8]，患糖尿病10年之后，約有25%～35%的患者會(huì)出現(xiàn)一類并發(fā)癥，且無法逆轉(zhuǎn)。1972年S Rubler等[9]首次報(bào)道DCM是一種獨(dú)立于高血壓和冠心病的特異性心肌損傷性疾病，發(fā)病率高，危害大[10]。臨床調(diào)查表明，糖尿病患者心力衰竭的發(fā)生率在19%～26%之間，且近幾年呈上升趨勢(shì)[11]。DCM表現(xiàn)為心肌肥厚、纖維化，進(jìn)一步影響心肌收縮和舒張功能，常伴隨有心力衰竭及心律失常[12]。DCM在發(fā)生發(fā)展過程中存在糖脂代謝失衡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞的凋亡、心肌纖維化等多因素共同介導(dǎo)[13-14]。還有報(bào)道顯示，DCM患者的高血糖、全身性胰島素抵抗、心臟胰島信號(hào)受損、氧化應(yīng)激、線粒體損傷及慢性炎癥等都與DCM的發(fā)病相關(guān)[15-17]。黃壯壯等[18]研究表明，DCM的發(fā)病原理與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等存在一定的關(guān)聯(lián)性，這或許是該病能夠得到醫(yī)治的重要靶點(diǎn)。所以，調(diào)節(jié)血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、改善微循環(huán)及保護(hù)心肌細(xì)胞是治療DCM的關(guān)鍵[19]。目前，西醫(yī)針對(duì)DCM尚無高效預(yù)防和治療藥物；臨床上仍然以控制血糖結(jié)合強(qiáng)心劑和利尿劑治療為主[20-21]。

早在2004年，劉彥晶[21]研究顯示，糖尿病并發(fā)癥可能與瘀血密切相關(guān)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)《直指方》曰：“氣虛血行乏力，則血通滯后，氣滯而血多阻滯不暢，停滯癖。而血瘀一成，或氣機(jī)不暢，或瘀而化熱，乃傷已虛之氣陰，久之則為惡性循環(huán)，導(dǎo)致病情延續(xù)不斷，百病涌現(xiàn)。”因此可知，瘀血是誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的一個(gè)關(guān)鍵誘因。THJG采用活血化瘀經(jīng)典藥對(duì)桃仁-紅花[22]，臨床上常用其治療心腦血管阻塞性疾病，再佐以黃精，補(bǔ)氣養(yǎng)陰，同時(shí)又可降低血糖。全方配伍，既能祛瘀血、補(bǔ)精氣，又能控制血糖，從而緩解和治療糖尿病心肌病病變。

本研究采用THJG治療小鼠DCM，通過臨床人用劑量推算小鼠用量，連續(xù)給藥3個(gè)月，證實(shí)其可明顯改善小鼠DCM的心臟功能，降低心臟指數(shù)，同時(shí)降低血清中TG和LDL-C水平，升高HDL-C水平，并提高小鼠血清SOD含量。此外，THJG改善DCM的心肌損傷還可能與其抗炎作用有關(guān)，即能夠呈劑量依賴性地降低小鼠促炎因子如IL-6、TNF-α等，提高抗炎因子IL-10的表達(dá)。

綜上所述，THJG具有明顯治療DCM的作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化和抗炎作用有關(guān)，其確切作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。