Anle138b對慢性AβOs誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元毒性作用影響

劉偉

[摘要] 目的 觀察二苯基吡唑化合物Anle138b對β淀粉樣蛋白寡聚體（AβOs）誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元毒性作用的影響。

方法 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞成熟后，將其分為空白對照組、AβOs處理組（用0.1 μmol/L AβOs處理7 d）和Anle138b處理組（用0.1 μmol/L AβOs處理7 d，在AβOs處理的后2 d加用0.1 μmol/L Anle138b）。使用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測細(xì)胞損傷情況，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)。

結(jié)果 與空白對照組相比較，AβOs處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞LDH釋放量增加（F=14.810，q=7.481，P<0.01），凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)升高（F=6.677，q=4.816，P<0.05）。與AβOs處理組相比，Anle138b處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞LDH釋放量降低（q=5.310，P<0.05），凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論 Anle138b在慢性AβOs誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡模型中具有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病;蛋白質(zhì)聚集體;淀粉樣β肽類;Anle138b;海馬;神經(jīng)元;毒性作用

[中圖分類號] R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0662-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.185

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.1333.003.html;2021-11-02 14：23：02

EFFECT OF ANLE138B ON CHRONIC HIPPOCAMPAL NEURONAL TOXICITY INDUCED BY β-AMYLOID PEPTIDE OLIGOMERS

LIU Wei

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medical， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the diphenyl-pyrazole compound Anle138b on hippocampal neuronal toxicity induced by β-amyloid peptide oligomers （AβOs）.

Methods After the primary cultured hippocampal neurons became mature， they were divided into blank control group， AβOs treatment group （treated with 0.1 μmol/L AβOs for 7 days）， and Anle138b treatment group （treated with 0.1 μmol/L AβOs 5 days and then treated with both AβOs and 0.1 μmol/L Anle138b for 2 days）. Lactate dehydrogenase （LDH） kit was used to observe cell damage， and Western blot was used to measure the expression of the apoptosis protein cleaved caspase-3.

Results Compared with the blank control group， the AβOs treatment group had significant increases in the release of LDH in hippocampal neurons （F=14.810，q=7.481，P<0.01） and the expression of the apoptotic protein cleaved caspase-3 （F=6.677，q=4.816，P<0.05）. Compared with the AβOs treatment group， the Anle138b treatment group had a significant reduction in the release of LDH in hippocampal neurons （q=5.310，P<0.05）， as well as a tendency of reduction in the expression of the apoptotic protein cleaved caspase-3， but with no significant difference （P>0.05）.

Conclusion

Anle138b has a certain protective effect in the model of chronic hippocampal neuronal apoptosis induced by AβOs.

[KEY WORDS] Alzheimer disease; protein aggregates; amyloid beta-peptides; Anle138b; hippocampus; neurons; toxic actions

阿爾茨海默?。ˋD）又稱為老年癡呆癥，是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)退行性疾病，也是癡呆癥最常見的病因。隨著預(yù)期壽命的持續(xù)增長，AD發(fā)病率將會越來越高。到2050年，全世界癡呆癥的人數(shù)預(yù)計(jì)將增加到1.315億[1]。盡管進(jìn)行了數(shù)十年的研究，但該病至今尚未找到有效的治療方法。AD的病因復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素。目前關(guān)于AD病因的假說有很多，包括膽堿能假說、β淀粉樣蛋白（Aβ）毒性假說、tau蛋白異常修飾假說、鈣穩(wěn)態(tài)假說等，其中被廣泛認(rèn)同的是Aβ毒性假說[2-3]。離子通道假說是Aβ發(fā)揮毒性的一種機(jī)制，該假說認(rèn)為，Aβ變構(gòu)、組裝成離子通道結(jié)構(gòu)，嵌入脂質(zhì)雙層膜，造成膜泄漏和鈣穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡[4-5]。

Anle138b是一種低聚物調(diào)節(jié)劑，具有出色的口服生物利用度和血-腦脊液屏障滲透性，并且在治療劑量下沒有可檢測到的毒性[6]。分子動力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)表明，Anle138b可以有效地阻斷肽鏈相互作用并阻止自發(fā)形成有序的β-折疊結(jié)構(gòu)[7]。2018年，MAR-TINEZ HERNANDEZ等[8]對AD大鼠模型及人工膜的研究表明，Anle138b可以阻止Aβ打孔的活動，而不會改變膜嵌入的Aβ低聚物結(jié)構(gòu)。Anle138b是首個(gè)被報(bào)道的能夠在通道形成后將其阻斷并改善Aβ病理變化的化合物，并且還可以減少病理性tau蛋白聚集體，是治療AD相關(guān)病理改變的新型且有希望的化合物，但是該藥在細(xì)胞模型上的研究結(jié)果較少[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞模型上通過對海馬神經(jīng)元凋亡損傷情況的檢測，觀察了Aβ通道抑制劑Anle138b對慢性Aβ寡聚體（AβOs）誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元毒性作用的影響，為開發(fā)治療AD新型藥物提供思路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞（從大鼠新生鼠腦內(nèi)獲?。珼MEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），Anle138b（Medchem Express公司），青霉素-鏈霉素溶液（100×，北京索萊寶科技有限公司），Aβ42單體粉末（杭州丹港生物科技有限公司），BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司），D-多聚賴氨酸（美國Sigma公司），cleaved caspase-3抗體（上海Cell Signaling公司），ECL發(fā)光液以及PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AβOs制備 取1 mg的Aβ42粉末和六氟異丙醇（HFIP）置于冰上預(yù)冷，向裝有Aβ42粉末的EP管中加入222 μL的HFIP，密封，渦旋混勻，室溫下孵育60 min，直到液體澄清，得到1 mmol/L的 Aβ-HFIP溶液。將Aβ-HFIP溶液置于冰上5 min，取4只無菌EP管，分裝Aβ-HFIP溶液55 μL，在通風(fēng)櫥中將HFIP揮干，得到無色透明Aβ肽膜，置-20 ℃冰箱保存。使用前，取1支分裝管，在冰上加入二甲基亞砜（DMSO）11 μL，水浴超聲（300 W，35 Hz）處理10 min，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）539 μL，渦旋混勻，置于冰箱中4 ℃孵育1 d。使用離心機(jī)在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，上清即為100 μmol/L的AβOs[10]。

1.2.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前先將所有實(shí)驗(yàn)器械高壓滅菌以確保細(xì)胞不被污染。12孔板用多聚賴氨酸包被，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置2 h以上，實(shí)驗(yàn)前用高壓后的雙蒸水沖洗3次，去除多聚賴氨酸，放于培養(yǎng)箱中備用。將小鼠浸泡于體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇中消毒，用剪刀剪下頭部后取出大腦，將其置于盛有基礎(chǔ)培養(yǎng)液預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下取出海馬體（位于大腦皮質(zhì)內(nèi)，有較為明顯的血管膜界限），并去除血管膜。加入胰蛋白酶5 mL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5 min，使用含有FBS的完全培養(yǎng)液終止消化。使用移液槍將海馬體移至新的培養(yǎng)皿中，將其吹打均勻，沉淀后轉(zhuǎn)移上清至離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含B27的培養(yǎng)液輕輕吹打混勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度約為7×108/L。將細(xì)胞懸液以每孔1.5 mL接種于6孔板中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d進(jìn)行1次半換液，細(xì)胞培養(yǎng)7～8 d后觀察細(xì)胞狀態(tài)，待神經(jīng)元胞體發(fā)育飽滿、突觸連接明顯后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（A組，無處理措施）、AβOs處理組（B組，用0.1 μmol/L的AβOs處理7 d）和Anle138b處理組（C組，用0.1 μmol/L的AβOs處理7 d，在AβOs處理后5 d加用0.1 μmol/L的Anle138b）。

1.2.4 海馬神經(jīng)元LDH釋放量檢測 細(xì)胞處理結(jié)束后，轉(zhuǎn)移各組上清至EP管中，并置于冰上。按照試劑盒說明書進(jìn)行LDH檢測，操作過程應(yīng)謹(jǐn)慎迅速，防止LDH降解。將待測樣本轉(zhuǎn)移到96孔板中，加入基質(zhì)緩沖液和輔酶Ⅰ后，37 ℃孵育15 min;加入2，4-二硝基苯肼，37 ℃孵育15 min;加入NaOH溶液，室溫孵育5 min;用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值，按照試劑盒說明書的公式計(jì)算培養(yǎng)液中LDH含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）方法檢測cleaved caspase-3的表達(dá) 將待測樣本轉(zhuǎn)移到12孔板中，每孔加入蛋白裂解液60 μL，在冰上裂解30 min，使用刮板將貼附在板底的海馬神經(jīng)元細(xì)胞刮凈，轉(zhuǎn)移裂解液和細(xì)胞至EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸取上清至新的EP管中，使用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。加入1/4上清量的5×Loading Buffer，95 ℃加熱5 min，樣品置于-20 ℃保存。使用125 g/L的PAGE凝膠進(jìn)行電泳，將制備好的蛋白樣品加入膠孔中，以80 V電壓跑濃縮膠，120 V電壓跑分離膠。電泳結(jié)束后，取出凝膠，應(yīng)用0.22 μm的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，以300 mA恒定電流在冰上轉(zhuǎn)膜約90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用封閉液封閉 2 h，根據(jù)分子量大小裁膜，得到相關(guān)蛋白條帶后加入一抗（稀釋比例1∶800），4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗3次，每次10 min;加入二抗（稀釋比例1∶10 000）后室溫孵育 1 h，TBST洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑顯影后，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白β-actin的灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s的形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，并繼以Tukey法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 Anle138b對AβOs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型LDH釋放量的影響

與空白對照組相比，AβOs處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞LDH釋放量增加（F=14.810，q=7.481，P<0.01）;與AβOs處理組相比較，Anle138b處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的LDH釋放量降低（q=5.310，P<0.05）。見表1。

2.2 Anle138b對AβOs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AβOs 處理組細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)升高（F=6.677，q=4.816，P<0.05）;與AβOs處理組相比較，Anle138b處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.255，P>0.05）。見表1。

3 討? 論

隨著社會老齡化的加劇，在中老年人群中AD患病率成倍增加，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療AD藥物主要有兩類，一類是膽堿酯酶抑制劑，另一類是興奮性氨基酸受體拮抗劑[11]。盡管已證明這些藥物對AD癥狀的控制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但它們的治療效果并不穩(wěn)定，并且作用持續(xù)時(shí)間有限[12]?；诂F(xiàn)有療法的低效率，迫切需要開發(fā)能阻止疾病發(fā)展的藥劑，找到AD的新療法。而Aβ通道小分子阻斷劑將會是治療AD相關(guān)病理改變的一種新穎且有希望的化合物[9]。Anle138b是首個(gè)被報(bào)道的能夠在通道形成后將其阻斷并改善Aβ病理變化的化合物，但是該藥物在細(xì)胞模型上的研究結(jié)果較少，因此本實(shí)驗(yàn)使用體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元作為實(shí)驗(yàn)材料，并且降低AβOs給藥濃度，采用連續(xù)7 d慢性給藥的方式，研究Anle138b對慢性AβOs誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元毒性作用的影響。相較于人工膜以及急性分離模型，原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元可以形成較為發(fā)達(dá)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞間可以進(jìn)行突觸傳遞和信號交流，更加接近生理環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)先給予AβOs處理5 d，再用Anle138b和AβOs共處理2 d，這種給藥方式更能表現(xiàn)出Anle138b能夠在Aβ通道形成后將其阻斷的作用機(jī)制，這也是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新性所在。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與AβOs處理組相比，Anle138b處理能夠降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞LDH釋放量，并且凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)也呈下降趨勢。表明Anle138b在慢性AβOs誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡模型中有一定的保護(hù)作用。后續(xù)研究尚需進(jìn)一步加大樣本量，這樣cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量的下降將可能有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會更明確且具有說服力。近年來，Aβ如何影響神經(jīng)元和突觸功能受到關(guān)注[13-15]。而Aβ與質(zhì)膜的相互作用是AD發(fā)展的關(guān)鍵，二者相互作用的結(jié)果之一就是形成離子通道[16-18]。離子通道形成后，會造成膜泄漏和鈣穩(wěn)態(tài)失衡進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡[19]。本研究Anle138b表現(xiàn)出對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用可能就是通過阻斷Aβ通道的作用。到目前為止，在包括輕度至中度AD病人的臨床試驗(yàn)中，大部分治療方法均未成功通過Ⅲ期臨床試驗(yàn)，進(jìn)行分析時(shí)，在疾病過程中采取干預(yù)措施開始太晚是解釋此類失敗的經(jīng)常性的論據(jù)之一，認(rèn)為早期的預(yù)防性治療將帶來好處[20]。aducanumab抗體的臨床試驗(yàn)也是集中在早期或中期病人[21-23]，然而實(shí)際上AD病人被確診基本處于發(fā)病后期，并且目前AD發(fā)病早期的診斷尚不成熟[24]。因此，尋求一種能在AD發(fā)病后期發(fā)揮重要作用的藥物非常重要。而在本實(shí)驗(yàn)中，Anle138b加藥時(shí)間是在AβOs處理一定時(shí)間之后，故像Anle138b這種小分子阻斷劑可能在該病的治療中有很大的潛力[25]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]SENGOKU R. Aging and Alzheimers disease pathology[J]. Neuropathology， 2020，40（1）：22-29.

[2]LIU P P， XIE Y， MENG X Y， et al. History and progress of hypotheses and clinical trials for Alzheimers disease[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2019，4：29.

[3]LANE C A， HARDY J， SCHOTT J M. Alzheimers disease[J]. European Journal of Neurology， 2018，25（1）：59-70.

[4]SHIRWANY N A， PAYETTE D， XIE J， et al. The amyloid beta ion channel hypothesis of Alzheimers disease[J]. Neuropsychiatric Disease and Treatment， 2007，3（5）：597-612.

[5]ARISPE N， POLLARD H B， ROJAS E. Giant multilevel

cation channels formed by Alzheimer disease amyloid beta-

protein[A beta P-（1-40）] in bilayer membranes[J]. PNAS， 1993，90（22）：10573-10577.

[6]WAGNER J， RYAZANOV S， LEONOV A， et al. Anle138b： a novel oligomer modulator for disease-modifying therapy of neurodegenerative diseases such as prion and Parkinsons di-

sease[J]. Acta Neuropathologica， 2013，125（6）：795-813.

[7]LEVIN J， SCHMIDT F， BOEHM C， et al. The oligomer modulator anle138b inhibits disease progression in a Parkinson mouse model even with treatment started after disease onset[J]. Acta Neuropathologica， 2014，127（5）：779-780.

[8]MARTINEZ HERNANDEZ A， URBANKE H， GILLMAN A L， et al. The diphenylpyrazole compound anle138b blocks Aβ channels and rescues disease phenotypes in a mouse model for amyloid pathology[J]. EMBO Molecular Medicine， 2018，10（1）：32-47.

[9]GUIX F X， DOTTI C G. Could blocking the formation of amyloid channels rescue Alzheimers phenotype[J]？? EMBO Molecular Medicine， 2018，10（1）：7-9.

[10]CIUDAD S， PUIG E， BOTZANOWSKI T， et al. Aβ（1-42） tetramer and octamer structures reveal edge conductivity pores as a mechanism for membrane damage[J]. Nature Communications， 2020，11（1）：3014.

[11]BRIGGS R， KENNELLY S P， ONEILL D. Drug treatments in Alzheimers disease[J]. Clinical Medicine （London， England）， 2016，16（3）：247-253.

[12]PANZA F， LOZUPONE M， DIBELLO V， et al. Are antibo-

dies directed against amyloid-β （Aβ） oligomers the last call for the Aβ hypothesis of Alzheimers disease[J]？ Immunotherapy， 2019，11（1）：3-6.

[13]FABIANI C， ANTOLLINI S S. Alzheimers disease as a membrane disorder： spatial cross-talk among beta-amyloid peptides， nicotinic acetylcholine receptors and lipid rafts[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience， 2019，13：309.

[14]ARBOR S C， LAFONTAINE M， CUMBAY M. Amyloid-beta Alzheimer targets-protein processing， lipid rafts， and amyloid-beta pores[J]. The Yale Journal of Biology and Medicine， 2016，89（1）：5-21.

[15]RANGACHARI V， DEAN D N， RANA P， et al. Cause and consequence of Aβ-Lipid interactions in Alzheimer disease pathogenesis[J]. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes， 2018，1860（9）：1652-1662.

[16]POPUGAEVA E， PCHITSKAYA E， BEZPROZVANNY I. Dysregulation of intracellular calcium signaling in Alzheimers disease[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2018，29（12）：1176-1188.

[17]VETRIVEL K S， THINAKARAN G. Membrane rafts in Alzheimers disease beta-amyloid production[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2010，1801（8）：860-867.

[18]DI SCALA C， CHAHINIAN H， YAHI N， et al. Interaction of Alzheimers β-amyloid peptides with cholesterol： mechanistic insights into amyloid pore formation[J]. Biochemistry， 2014，53（28）：4489-4502.

[19]BEZPROZVANNY I， MATTSON M P. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimers disease[J]. Trends in Neurosciences， 2008，31（9）：454-463.

[20]ROSENTHAL J， BELFORT G， ISAACSON D. Early treatment critical： bexarotene reduces amyloid-beta burden in silico[J]. PLoS One， 2016，11（4）：e0153150.

[21]ARNDT J W， QIAN F， SMITH B A， et al. Structural and kinetic basis for the selectivity of aducanumab for aggregated forms of amyloid-β[J]. Scientific Reports， 2018，8（1）：6412.

[22]GAMAGE K K， KUMAR S. Aducanumab therapy ameliorates calcium overload in a mouse model of Alzheimers di-

sease[J]. The Journal of Neuroscience， 2017，37（17）：4430-4432.

[23]KASTANENKA K V， BUSSIERE T， SHAKERDGE N， et al. Immunotherapy with aducanumab restores calcium homeostasis in Tg2576 mice[J]. The Journal of Neuroscience， 2016，36（50）：12549-12558.

[24]BATEMAN R J， XIONG C J， BENZINGER T L， et al. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzhei-

mers disease[J]. The New England Journal of Medicine， 2012，367（9）：795-804.

[25]MATTHES D， GAPSYS V， GRIESINGER C， et al. Resolving the atomistic modes of Anle138b inhibitory action on peptide oligomer formation[J]. ACS Chemical Neuroscience， 2017，8（12）：2791-2808.

（本文編輯 馬偉平）