一株產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌的麩曲制作及其產(chǎn)酶特性研究

鄭自強(qiáng) 衛(wèi)春會(huì) 鄧 杰 黃治國 仲濟(jì)宇 任志強(qiáng)

(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué)生釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000)

纖維素在動(dòng)植物中普遍存在，被稱為最豐富的可再生能源之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保行業(yè)，具有遠(yuǎn)大的經(jīng)濟(jì)開發(fā)前景[1]。纖維素資源的利用經(jīng)常需要進(jìn)行降解處理，主要分為物理降解法、化學(xué)降解法和生物降解法，生物降解法因其綠色和低能耗的優(yōu)點(diǎn)備受青睞，而生物降解法一般是通過利用產(chǎn)纖維素酶的微生物來實(shí)現(xiàn)的[2]。纖維素酶是由細(xì)菌、真菌等微生物產(chǎn)生的能夠?qū)⒗w維素降解成可發(fā)酵性糖的一系列酶類的總稱，主要由內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶3種酶構(gòu)成，3種酶類的協(xié)同作用才能更好地將纖維素酶解[3]。能夠同時(shí)產(chǎn)內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶菌株的酶系較為復(fù)雜，目前從自然界中篩選出的產(chǎn)纖維素酶菌株存在分解纖維素的酶解效率低，應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)難的局限性[4]。

選育性能良好的產(chǎn)纖維素酶菌株是利用纖維素的基礎(chǔ)。楊偉平等[5]分離出一株能高效降解纖維素的細(xì)菌，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；黃玉蘭等[6]從土壤中篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株XW-1，其最佳的產(chǎn)酶條件下的酶活性為15.60 U/mL；胡麗娟等[7]篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的突變株Y-9，經(jīng)工藝優(yōu)化后的酶活性可達(dá)28.62 U/mL。以往的研究大多只以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物測(cè)定內(nèi)切β-葡聚糖酶活力作為菌株纖維素酶活力參考，而少有對(duì)纖維素酶3種酶的酶活特性進(jìn)行綜合探討，且對(duì)于纖維素生物降解的應(yīng)用多采用直接接種的方式，造成酶生成量少、酶穩(wěn)定性差、酶作用效率低等問題，無法滿足現(xiàn)階段工業(yè)上的應(yīng)用需求。

鑒于目前的研究現(xiàn)狀，在不降低產(chǎn)纖維素酶菌株的產(chǎn)酶特性條件下擴(kuò)培菌種以及提高酶的穩(wěn)定性變得尤為重要，產(chǎn)纖維素酶菌株的大規(guī)模應(yīng)用首先需要擴(kuò)大培養(yǎng)，制備麩曲是白酒行業(yè)比較常見的生產(chǎn)用菌擴(kuò)培方式。麩曲一般以麩皮為原料，經(jīng)處理后接種微生物培養(yǎng)產(chǎn)酶，工業(yè)上常通過制備麩曲的方式對(duì)純種微生物進(jìn)行擴(kuò)培，提高經(jīng)濟(jì)效益[7]。研究擬以一株產(chǎn)纖維素3種酶齊全、酶活性高的枯草芽孢桿菌——XWS-A[8]為出發(fā)菌株制作細(xì)菌麩曲，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化工藝擴(kuò)大菌種，并對(duì)成品麩曲的內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活力進(jìn)行測(cè)定，以期改善菌種應(yīng)用價(jià)值，提高資源利用率，為開發(fā)利用纖維素資源提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

XWS-A菌種：釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

麩皮：市售；

羧甲基纖維素鈉：淄博海瀾化工有限公司；

微晶纖維素：河南德鑫化工實(shí)業(yè)有限公司；

水楊苷：上海源葉生物科技有限公司；

纖維素酶、(NH4)2SO4、KH2PO4、DNS試劑：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器及設(shè)備

電子天平：CP214型，奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-1200型，翱藝儀器上海有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：5430R型，德國Eppendorf公司。

1.3 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，NaCl 1.25 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.0；

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.0。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 麩曲枯草芽孢桿菌生物量測(cè)定 取10 g樣品(麩曲)加入90 mL無菌水，作為10-1濃度，采用LB培養(yǎng)基稀釋涂布計(jì)數(shù)[9]。

1.4.2 麩曲工藝流程

1.4.3 枯草芽孢桿菌麩曲制作單因素試驗(yàn) 以芽孢桿菌生物量為指標(biāo)，在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定原料采用全麩皮，固定培養(yǎng)時(shí)間為60 h，分別考察不同接種量(1%，3%，5%，7%，9%，11%)、培養(yǎng)溫度(30，35，40，45，50，55，60 ℃)和含水量(30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%)對(duì)麩曲中XWS-A菌株生物量的影響。

1.4.4 枯草芽孢桿菌麩曲制作的響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素結(jié)果，運(yùn)用Design-Export 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)Box-Behnken中心組合，以芽孢桿菌生物量為響應(yīng)值，選取接種量、培養(yǎng)溫度和含水量為試驗(yàn)因素，確定強(qiáng)化麩曲的工藝最優(yōu)點(diǎn)[11]。

1.4.5 麩曲纖維素酶活力的測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別在比色管中加入1.0 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，各管分別補(bǔ)離子水至1 mL，再分別加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后稀釋至刻度線(25 mL)，以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，540 nm處測(cè)定吸光值。

(2)纖維素酶活力檢測(cè)(DNS法)：分別在比色管中加入0.5 mg/mL酶液0.1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%緩沖液0.9 mL(內(nèi)切β-葡聚糖酶活力測(cè)定采用羧甲基纖維素鈉檸檬酸緩沖液；外切β-葡聚糖酶測(cè)定采用微晶纖維素檸檬酸緩沖液；β-葡萄糖苷酶測(cè)定采用水楊苷檸檬酸緩沖液)，調(diào)節(jié)pH，一定溫度條件下水浴10 min，加入1.5 mL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冷卻后稀釋至刻度線(25 mL)，以先加入DNS溶液，后加入緩沖溶液和酶液作為空白，540 nm處測(cè)定吸光值[12]。

(3)纖維素酶活力的定義：在37 ℃，pH 5.5的條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為4 mg/mL 的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U，每1 min水解產(chǎn)生1 μ/g還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U/g)[13]。

以上試驗(yàn)均測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，并做3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Export 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)、方差分析及模型預(yù)測(cè)，采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，最佳接種量為7%，最佳培養(yǎng)溫度為45 ℃，最佳含水量為45%，并以此結(jié)果為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)響應(yīng)面水平中心點(diǎn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)各因素及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)各因素及水平

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次多元分析，得到擬合評(píng)分結(jié)果的二次多元的編碼方程為：

Y=4.44+0.15A+0.18B+0.17C-0.025AB-0.13AC-0.075BC-0.28A2-0.28B2-0.23C2。

(1)

圖2 預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)關(guān)系圖

表3 中心組合的回歸方程方差分析

由圖3可知，接種量與培養(yǎng)溫度、接種量與含水量、培養(yǎng)溫度與含水量的交互圖均呈橢圓形，3D立體圖存在極點(diǎn)值，說明各因素之間交互作用顯著，各因素交互作用對(duì)麩曲生物量結(jié)果有較大影響。模型分析預(yù)測(cè)的最大值為4.5，對(duì)應(yīng)的實(shí)際值為A=7.4，B=46.3，C=46.4。考慮到試驗(yàn)操作的方便性，將結(jié)果修正為A=7.5，B=46，C=46，即模型預(yù)測(cè)的最佳工藝為：接種量7.5%，培養(yǎng)溫度46 ℃，含水量46%。

圖3 交互作用響應(yīng)分析圖

為驗(yàn)證響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果的可靠性，在最佳工藝參數(shù)條件下即控制接種量7.5%，培養(yǎng)溫度46 ℃，含水量46%，進(jìn)行多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，此條件下的成品曲生物量結(jié)果為(4.5±0.3)×1011CFU/g，與預(yù)測(cè)結(jié)果4.5×1011CFU/g接近，證明該響應(yīng)面模型理想，參數(shù)組合穩(wěn)定可靠。

2.3 pH及反應(yīng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌麩曲纖維素酶活性的影響

通過Box-Behnken響應(yīng)設(shè)計(jì)優(yōu)化制曲工藝，成功對(duì)枯草芽孢桿菌XWS-A進(jìn)行擴(kuò)培，而纖維素酶的測(cè)定沒有具體的標(biāo)準(zhǔn)，甚至同一種測(cè)定方法中，處理?xiàng)l件的差異對(duì)酶活的測(cè)定結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生較大影響[16-17]，考慮到纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)，試驗(yàn)測(cè)定在不同pH及反應(yīng)溫度條件下枯草芽孢桿菌XWS-A麩曲的酶活，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶在pH為5.0時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，分別為(2 420±70)，(15±1)，(19±1)U/g；酶是蛋白質(zhì)，高溫會(huì)使蛋白質(zhì)失活，內(nèi)切β-葡聚糖酶活性在55 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值(2 510±70)U/g；外切β-葡聚糖酶活性在55 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值(15±2)U/g；β-葡萄糖苷酶活性在60 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值(30±3)U/g。綜合上述結(jié)果，確定試驗(yàn)成品曲纖維素酶的酶活測(cè)定應(yīng)控制pH為5.0，內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶的反應(yīng)溫度為55 ℃，β-葡萄糖苷酶的反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖4 不同處理?xiàng)l件對(duì)纖維素酶活測(cè)定的影響

3 結(jié)論

以XWS-A為出發(fā)菌株制作麩曲，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化制曲工藝，并對(duì)成品曲的產(chǎn)酶特性進(jìn)行了研究。其最佳工藝為：控制接種量7.5%，培養(yǎng)溫度46 ℃，含水量46%。該條件下XWS-A獲得了有效的增殖，其成品曲的生物量達(dá)到了(4.5±0.3)×1011CFU/g，實(shí)現(xiàn)了XWS-A的擴(kuò)培。

不同測(cè)定條件下內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的活性皆有較大差異，在最佳測(cè)定條件下內(nèi)切β-葡聚糖酶活力為(2 510±70)U/g，外切β-葡聚糖酶的活力為(15±2)U/g，β-葡萄糖苷酶的活力為(30±3)U/g。

但研究還存在部分待解決的問題，如尚未大量開展中試及實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)試驗(yàn)，缺乏對(duì)纖維素資源的多種途徑開發(fā)的實(shí)際生產(chǎn)數(shù)據(jù)，下一步將計(jì)劃從食品、環(huán)保、造紙等方向解決此問題，以進(jìn)一步完備理論支撐依據(jù)。