響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取肉豆蔻總黃酮工藝及其抗氧化活性研究

卓微偉，李鳳，胡君

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005）

肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）是肉豆蔻科肉豆蔻屬植物的成熟種仁，可除異味、增辛香，常作為調(diào)味料用于肉品的鹵制和醬肉的加工中[1]。同時(shí)，肉豆蔻也是我國常用的中藥材之一，其生理功能包括抑菌、抗癌、降血糖、抗衰老、保護(hù)肝臟等，而這些生理功能都與肉豆蔻含有的多種抗氧化活性物質(zhì)有關(guān)[2-3]。

黃酮類化合物主要是指具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，是一種多酚類植物次級代謝產(chǎn)物，因其具有多種較好的生理功能而備受關(guān)注[4-5]。黃酮類化合物的提取方式主要包括堿溶酸沉法、超聲輔助提取法、酶解法等，其中超聲輔助提取法是通過超聲波產(chǎn)生的機(jī)械破碎作用、空化效應(yīng)以及熱效應(yīng)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而加快細(xì)胞內(nèi)含物釋放的一種提取技術(shù)，具有提取率高、耗時(shí)少、提取物結(jié)構(gòu)不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于黃酮類化合物的提取中[6-8]。目前，國內(nèi)外對于肉豆蔻的研究主要集中在對其揮發(fā)油[9]、木脂素[10]、多酚[11]等的提取及成分分析，關(guān)于肉豆蔻中總黃酮的提取及抗氧化活性的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究擬采用超聲輔助法對肉豆蔻總黃酮進(jìn)行提取，并以總黃酮得率為評價(jià)指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定提取工藝的最佳參數(shù)。最后利用Fenton反應(yīng)法、鄰苯三酚自氧化法和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼比色法分別評價(jià)肉豆蔻總黃酮對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）和 DPPH 自由基的清除能力，以期為肉豆蔻的多方向利用和功能活性的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉豆蔻：市售，4℃保藏備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：蘇州天可貿(mào)易有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁：鄒平天鹿化工有限公司；無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、鹽酸、鄰苯三酚、氫氧化鈉、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA2004B型）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020型）：南京優(yōu)豐干燥設(shè)備有限公司；高速多功能粉碎機(jī)（DFY-400C型）：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；紫外分光光度計(jì)（756PC型）：湖南力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考陳蘇丹等[12]的方法，準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5 mL 于試管中，向其中加入 5%NaNO2溶液及10%Al（NO3）3溶液各0.5 mL，搖勻后反應(yīng)6 min，隨后加入4%NaOH溶液4 mL，混合均勻，并用70%乙醇定容至10 mL，在25℃下靜置15 min后，于510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.180 2x-0.054 1（R2=0.974 7）。

1.3.2 肉豆蔻總黃酮提取及含量測定

精密稱取10 g經(jīng)干燥粉碎后的肉豆蔻粉末，按一定的乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比進(jìn)行提取，抽濾后得到肉豆蔻總黃酮提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同操作測定肉豆蔻總黃酮的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出提取液中總黃酮的濃度，并利用下面公式計(jì)算肉豆蔻總黃酮的得率。

W/%=C×V/M×100

式中：W為肉豆蔻總黃酮得率，%；C為總黃酮的濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；M為肉豆蔻質(zhì)量，mg。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以總黃酮得率為指標(biāo)，采用控制變量法考察乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、超聲溫度（60、70、80、90、100 ℃）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]對肉豆蔻總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以肉豆蔻總黃酮得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化肉豆蔻總黃酮提取工藝，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 抗氧化活性試驗(yàn)

分別配制濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的肉豆蔻總黃酮提取液，以相同濃度的VC作為陽性對照，采用Fenton反應(yīng)法[13]、鄰苯三酚自氧化法[14]和DPPH比色法[15]測定其對·OH、O2-·和DPPH 自由基的清除率，從而評價(jià)肉豆蔻總黃酮的抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Office2010對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，分析乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖1可知，肉豆蔻總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高先增大后緩慢減小，且當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，肉豆蔻總黃酮的得率最高。這是由于總黃酮類物質(zhì)的溶出與提取溶劑的極性有關(guān)，隨著乙醇濃度的升高，肉豆蔻總黃酮與乙醇的極性逐漸接近，總黃酮類物質(zhì)溶出增多。但是乙醇濃度過高，溶劑極性減小，阻礙了部分黃酮苷的溶解，并且造成其它醇溶性雜質(zhì)及色素等物質(zhì)的大量溶出，從而加速了其它物質(zhì)與總黃酮類物質(zhì)的溶出競爭[16]，總黃酮得率有所下降。因此乙醇的最適濃度為80%。

2.1.2 超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取超聲溫度為 60、70、80、90、100 ℃，分析超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖2可知，隨著超聲溫度的增加，肉豆蔻總黃酮得率先增大后減小，且當(dāng)超聲溫度為80℃時(shí)，總黃酮得率最高。這是因?yàn)闇囟鹊纳呒涌炝朔肿娱g的運(yùn)動(dòng)，總黃酮類物質(zhì)在提取溶劑中的擴(kuò)散、溶解能力增強(qiáng)，溶出量增多。然而溫度過高時(shí)，提取溶劑揮發(fā)加劇，乙醇濃度降低，影響提取效果。此外，過高的溫度容易破壞總黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)加速了黃酮醇類等物質(zhì)的分解速率及其它黃酮類化合物的氧化、縮合、降解等反應(yīng)[17-18]，總黃酮得率下降。因此最佳超聲溫度為80℃。

2.1.3 超聲時(shí)間對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60 min，分析超聲時(shí)間對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖3可知，肉豆蔻總黃酮的得率隨著超聲時(shí)間的延長先增大后減小，且當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)，總黃酮得率最高。這可能是黃酮類化合物大多存在于肉豆蔻的細(xì)胞膜中，在超聲波的作用下，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，分子運(yùn)動(dòng)速率加快，總黃酮類物質(zhì)不斷溶出，總黃酮得率增加[19]。但是超聲時(shí)間過長，其產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化效應(yīng)會(huì)對總黃酮結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[20]。因此，超聲時(shí)間以50 min為宜。

2.1.4 料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL），分析料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖4可知，隨著溶劑用量的增加，肉豆蔻總黃酮的得率逐漸增加，且當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸趨于穩(wěn)定。這是由于增大溶劑用量，肉豆蔻粉末與提取溶劑能夠充分接觸，有利于總黃酮類物質(zhì)從肉豆蔻內(nèi)部向溶劑中擴(kuò)散，總黃酮得率提高。但是當(dāng)料液比達(dá)到一定程度時(shí)，總黃酮類物質(zhì)已基本溶出，此時(shí)若繼續(xù)增加溶劑用量，不僅容易造成雜質(zhì)的溶解，還會(huì)增加溶劑成本[21]。因此，最佳的料液比為1∶40（g/mL）。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以肉豆蔻總黃酮得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面試驗(yàn)對肉豆蔻總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Response surface test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

使用響應(yīng)面分析軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到以總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程：Y=2.43-0.097A+0.085B+0.054C-0.022D-0.015AB+0.042AC+0.52AD+0.24BC-0.18BD+0.26CD-0.25A2-0.59B2-0.25C2-0.50D2。

由表3可知，模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說明該模型誤差小。R2值為 0.952 7，R2adj值為0.905 5，CV為7.69%，說明模型擬合度良好，進(jìn)一步說明該模型的可靠性，并可將其用于肉豆蔻總黃酮得率的預(yù)測和分析。顯著性分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)對總黃酮得率均有極顯著影響，A、B、BD 項(xiàng)對肉豆蔻總黃酮得率影響顯著，C、D、AB、AC項(xiàng)對肉豆蔻總黃酮得率影響不顯著。根據(jù)F值可知，4個(gè)因素對肉豆蔻總黃酮得率的影響順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>超聲溫度（B）>超聲時(shí)間（C）>料液比（D）。

2.2.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖分析

為考察各因素交互作用對肉豆蔻總黃酮得率的影響，通過Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制相應(yīng)的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對肉豆蔻總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

響應(yīng)曲面的陡峭程度可以反映各因素值的變化對于響應(yīng)值的影響大小。由圖5可知，交互項(xiàng)AD（圖5c）、CD（圖 5f）、BC（圖 5d）和 BD（圖 5e）的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，且等高線呈橢圓形或馬鞍形，說明乙醇濃度與料液比、超聲時(shí)間與料液比、超聲溫度與超聲時(shí)間、超聲溫度與料液比的交互作用均顯著，對肉豆蔻總黃酮得率的影響較大；而其它項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖坡度較平緩，表明其交互作用不顯著，這與表3中回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面回歸模型預(yù)測可得肉豆蔻總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度73.73%，超聲溫度81.25℃，超聲時(shí)間 49.11 min，料液比 1∶36.03（g/mL），此時(shí)肉豆蔻總黃酮得率預(yù)測值為2.466%。為方便試驗(yàn)操作，確定其最終提取工藝條件為乙醇濃度74%，超聲溫度81 ℃，超聲時(shí)間 49 min，料液比 1∶36（g/mL），并在此最優(yōu)組合下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到肉豆蔻總黃酮得率平均值為2.503%，與預(yù)測值相近，進(jìn)一步證明了該模型的可信性。

2.3 肉豆蔻總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 肉豆蔻總黃酮對·OH的清除作用

以VC為陽性對照，肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率結(jié)果如圖6所示。

圖6 肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率Fig.6 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for·OH

由圖6可知，肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率隨著其濃度的增加呈上升趨勢，當(dāng)肉豆蔻總黃酮濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，其對·OH的清除率為85.78%，略低于同濃度下的VC對·OH的清除能力。這是由于黃酮化合物含有具備供氫及供電子能力的酚羥基、C4酮羰基等結(jié)構(gòu)，其提供的氫原子能與·OH結(jié)合，終止自由基的氧化損傷反應(yīng)，從而達(dá)到清除·OH的效果[22]。

2.3.2 肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除作用

O2-·活潑性較強(qiáng)，與機(jī)體的氧化損傷有著密切的聯(lián)系，是評價(jià)抗氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。不同濃度的肉豆蔻總黃酮與VC對O2-·清除率的測定結(jié)果如圖7所示。

圖7 肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除率Fig.7 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for O2-·

由圖7可知，隨著肉豆蔻總黃酮濃度的增加，其對O2-·的清除率也不斷增加，且0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除率為88.31%，與同濃度的VC相比，其清除能力略低。然而由于VC本身是一種強(qiáng)氧化劑，因此可認(rèn)定肉豆蔻總黃酮具有較好的清除O2-·的能力。

2.3.3 肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除作用

不同濃度的肉豆蔻總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率結(jié)果如圖8所示。

圖8 肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for DPPH free radical

由圖8可知，肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率隨著其濃度的升高而不斷增加，且0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率為92.31%，與等濃度的VC對DPPH自由基的清除能力相近，可見肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

3 結(jié)論

本研究探討了肉豆蔻總黃酮的最佳超聲輔助提取工藝參數(shù)及其抗氧化活性。結(jié)果表明，肉豆蔻總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度74%、超聲溫度81 ℃、超聲時(shí)間 49 min、料液比 1∶36（g/mL），在此工藝條件下，肉豆蔻總黃酮的得率為2.503%。此外，抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除率分別為85.78%、88.31%和92.31%，略低于同濃度的VC的抗氧化能力，但仍表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。然而本試驗(yàn)也有不足之處，如試驗(yàn)得到的肉豆蔻總黃酮僅為粗提物，還需進(jìn)一步的純化才能發(fā)揮更好的功效，提取物中具體的組成成分及其它的功能活性也需深入研究。