海洋生物活性肽的功能、制備技術(shù)與作用機制研究進(jìn)展

楊貴蘭, 秦 松, 李文軍, 李 亞

海洋生物活性肽的功能、制備技術(shù)與作用機制研究進(jìn)展

楊貴蘭1, 2, 3, 秦 松1, 3, 李文軍1, 3, 李 亞4

(1.中國科學(xué)院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 2.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 山東 煙臺 264005; 3.中國科學(xué)院 海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071; 4.煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司, 山東 煙臺 264003)

許多海洋生物活性肽具有降血壓、抗炎、抗氧化、抗血栓等多種生物活性, 在功能食品及醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本文主要綜述了海洋生物活性肽的制備方法、功能活性及其作用機制, 為進(jìn)一步開發(fā)和利用海洋生物活性肽提供參考。

海洋生物活性肽; 制備方法; 功能活性; 作用機制

海洋表面積約占地球總表面積的71%, 海洋中種類繁多的動物、植物以及微生物形成了一個豐富的生物資源庫。與陸地環(huán)境相比, 海洋環(huán)境具有諸如高鹽、低溫、高壓及少光等特點。為了適應(yīng)特殊的環(huán)境, 海洋生物形成了許多具有的特定功能的生物活性肽。比如, 海洋藻類為了防止氧化損傷, 可產(chǎn)生抗氧化肽實現(xiàn)自我保護(hù)[1]; 海洋魚類生物肽可能會產(chǎn)生一些由特殊氨基酸組成的環(huán)狀肽, 該肽具有特殊的功能活性包括細(xì)胞毒性、抗腫瘤[2]。

生物活性肽是2～50個氨基酸殘基以不同組合和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱[1]。這些生物活性多肽大多是從魚類, 海綿, 海鞘, 海藻和軟體動物中提取得到的, 據(jù)報道具抗炎、抗氧化性、抗血栓等多種藥理作用[3]。本綜述概述了海洋生物活性多肽的制備方法與功能活性, 并介紹活性化合物的作用機制等, 為進(jìn)一步開發(fā)海洋生物活性多肽在功能性食品和藥品中的潛在應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 海洋生物活性肽的制備方法

海洋生物活性肽的制備主要有3種途徑, 一是通過對海洋生物蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解獲得具有各種功能活性的生物肽; 二是通過特定的化學(xué)法, 使海洋生物蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂得到的活性肽類; 三是通過人工合成法等方法獲得具有一定分子質(zhì)量的多肽類化合物。海洋生物活性肽的獲得途徑如圖1所示。

1.1 酶解法

蛋白酶解法是制備生物活性肽最常用的方法。酶解法具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、水解進(jìn)程易于控制且產(chǎn)品安全性較高等特點。酶解法中蛋白酶的選擇是關(guān)鍵, 不同的蛋白酶酶切后將得到不同的片段。胃蛋白酶, 胰蛋白酶, 堿性蛋白酶, 菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶是幾種常用的蛋白酶, 同時這些酶的復(fù)合使用可生產(chǎn)更多高效、穩(wěn)定的生物活性肽。但酶解的最優(yōu)條件需要通過多個單因素實驗來確定, 如底物濃度、用于酶解的最佳酶及添加量、酶解時間等。不同的蛋白酶的酶切位點不同, 使用不同的酶水解相同的蛋白質(zhì)底物時將會獲得活性不同的多肽片段。

已從海洋生物如紫菜、牡蠣、鱸魚、腈魚等中提取得到具有不同功能的活性肽(表1)。黃湛媛等[6]采用中性蛋白酶對竹節(jié)蝦頭副產(chǎn)物進(jìn)行酶解, 最優(yōu)酶解條件下, 獲得的酶解產(chǎn)物DPPH清除率達(dá)69.50%。Wu等[9]從海洋微藻胰蛋白酶酶解液中分離得到氨基酸序列為TMGLDLK的ACE抑制肽, 其IC50值為36.1 μmol/L。

表1 胃腸道消化酶酶解法制備海洋生物活性肽

在酶解法制備活性肽過程中, 超聲波輔助可顯著縮短多肽的提取時間、提高有效成分的提取率、避免高溫提取對多肽的影響[13-18]。超聲波加快酶解反應(yīng)速率的原理主要是空化效應(yīng), 即超聲波在體介質(zhì)中可形成微泡, 借助其破裂時能量的釋放, 進(jìn)而提高酶解反應(yīng)的速度, 最終獲得更加豐富的目標(biāo)肽段, 同時提高多肽的生物活性[19-22]。

康永峰等[23]利用超聲波-微波協(xié)同對鮭魚膠原蛋白進(jìn)行了酶解, 制備得到一種抗氧化肽, 還研究了超聲波和微波單一作用及共同作用對鮭魚肽超氧陰離子自由基清除能力的影響, 發(fā)現(xiàn)抗氧化能力均得到一定程度的提高。張玥等[24]采用超聲輔助乙酸提取法, 從紫貽貝加工下腳料中得到一種抗菌肽, 并對其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化, 研究發(fā)現(xiàn): 與傳統(tǒng)乙酸提取法相比, 超聲輔助乙酸法提取的抗菌肽抑菌效果更好, 抑菌圈可達(dá)(7.52±0.08) mm。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用微生物自身的胞外蛋白酶將蛋白質(zhì)降解的過程, 是產(chǎn)生生物活性肽和食品級水解蛋白質(zhì)的一種有效方法。與酶解法相比, 微生物發(fā)酵法產(chǎn)物純化較困難, 有一些產(chǎn)酶菌株可能對機體產(chǎn)生毒害作用等[13]。但該方法成本較低, 產(chǎn)量較高, 同時還能對魚皮進(jìn)行脫腥脫臭處理。

劉芳等[14]采用微生物發(fā)酵法從鱈魚中提取得到抗氧化膠原多肽, 發(fā)酵菌株為JF0Y3+啤酒酵母+ H-2, 并達(dá)到除臭除腥的效果。彭健等[15]采用復(fù)合酶解與微生物發(fā)酵法協(xié)同制備得到了一種刺參低聚肽, 提升了刺參肽功能制品附加值及刺參副產(chǎn)物利用率, 并有效徹底除腥。林俊宏等[16]采用微生物發(fā)酵法, 將嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌混合與魚粉共同發(fā)酵, 提取得到具有強抗氧化能力的魚粉肽類化合物。

1.3 化學(xué)水解法

化學(xué)水解法是一種利用適當(dāng)濃度的酸或堿溶液對蛋白質(zhì)進(jìn)行處理, 使蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂, 獲得小分子生物活性肽的方法[2]。對于一些與脂質(zhì)結(jié)合能力較強且具有很多非極性側(cè)鏈的多肽需采用不同比例的酸或堿同步提取。然而, 該技術(shù)存在許多限制因素, 如在多肽提取工藝過程中難以控制氨基酸的改變[17]。因此, 近年來單獨使用該方法在海洋生物活性肽的提取中應(yīng)用較少。

李祺福[18]采用20 mmol/L的HCl對牡蠣勻漿液進(jìn)行提取, 并利用分子篩層析獲得一種低分子活性肽, 且該活性肽可顯著抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖, 細(xì)胞生長抑制率高達(dá)49.8%。王傳幸等[19]以黑魚魚鱗為原料, 采用堿提法提取膠原蛋白, 又在此基礎(chǔ)上, 利用酶解法制備得到小分子膠原蛋白肽, 研究發(fā)現(xiàn): 體外羥自由基清除能力最高可達(dá)65.76%。

1.4 固相合成法

固相合成法是一個從C端向N端重復(fù)添加氨基酸的過程, 可合成包含10～100個殘基的多肽序列[20]。使用該方法合成多肽的前提是已知目標(biāo)肽段中氨基酸的序列。

Deng等[21]采用HPLC-MS技術(shù)從龍須菜水解物中篩選出了兩種ACE抑制肽, 并采用固相合成法進(jìn)行合成, 研究發(fā)現(xiàn)合成的兩種多肽在給藥2～4 h內(nèi),高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓分別降低了34和28 mmHg。丁靖[22]采用固相合成法合成了胡蜂蜂毒肽-M, 經(jīng)HPLC分析其純度可達(dá)97%, 多肽最終收率達(dá)56%, 說明固相合成法合成的多肽純度較高, 操作較方便, 多肽得率也較高。但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)合成多肽的成本較高、活性不穩(wěn)定, 只能合成已知氨基酸種類和肽鏈排列順序的肽[23]。

2 海洋生物活性肽的功能活性

2.1 降血壓

近年來, 天然海產(chǎn)品已被作為化學(xué)合成藥物的替代品被研究, 目前已經(jīng)從藻類和海洋蛋白質(zhì), 如海蝦[24]、鮭魚[25]中分離得到一些新的具有ACE抑制活性的化合物。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在人體血壓調(diào)節(jié)過程中具有重要作用, 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是RAS中重要的水解酶, 抑制ACE的活性, 可以減少血管緊張素II的生成、降低ACE對緩激肽的水解, 從而抑制RAS系統(tǒng), 達(dá)到降低血壓的目的[26]。

胃蛋白酶、糜蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶等常被用于蛋白水解以獲得ACE抑制肽。不同的蛋白酶, 酶切位點不同, 制備得到的降壓肽的IC50值也不同(表2), 這可能是由于肽的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致其活性大小不同[27]。例如: 胰蛋白酶可特異性裂解羧基側(cè)具有Lys和Arg殘基的蛋白質(zhì), α-胰凝乳蛋白酶傾向于在芳香族或大型疏水側(cè)鏈的羧基側(cè)裂解肽鍵, 釋放帶有His、Ala、Val、Leu、Tyr、Phe、Trp和Pro C末端氨基酸的肽[27]。另外, 肽鏈N端和C端氨基酸殘基的類型對ACE抑制活性影響很大。Saadi等[28]發(fā)現(xiàn)肽段N端氨基酸為Gly、Asn、Met、Arg和Tyr, C端氨基酸為Leu、Pro、Asp和Phe時, ACE抑制活性較好。該作者還指出抑制ACE肽的序列可以根據(jù)其分子量進(jìn)行分類, 其中前導(dǎo)序列是分子質(zhì)量最低的序列, 其次是中等分子質(zhì)量的序列, 最后是分子質(zhì)量最高的序列。因此, 含有兩個和三個氨基酸的肽序列常是ACE抑制活性最強的序列[29]。當(dāng)抑制劑C-末端的三肽序列為疏水性氨基酸(包括Phe、Trp、Tyr、Val、Leu和Ile)時, ACE抑制活性較好[27, 30]。此外, C末端殘基為帶有正電荷氨基酸(Lys和Arg)或者倒數(shù)第二個氨基酸是脂肪族氨基酸(如: Val、Ile、Ala等), 堿性和芳香族氨基酸(例如Tyr、Phe等)時, 該抑制肽的ACE抑制活性更好[31-32]。

表2 具有ACE抑制活性的海洋來源蛋白質(zhì)水解物的制備條件與氨基酸序列

2.2 促鈣吸收

促鈣吸收肽在pH值呈中性至微堿性的動物小腸下端, 能與鈣離子結(jié)合, 阻止鈣離子與磷酸根產(chǎn)生沉淀, 使小腸內(nèi)可溶性的鈣濃度增加, 從而促進(jìn)鈣離子的吸收和利用[41]。目前已從鱈魚、姑魚、蝦等海洋生物中提取得到多種促鈣吸收肽(表3)。促鈣吸收肽中有許多官能團(tuán), 如磷酸基、氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、羰基及亞氨基等, 可與鈣結(jié)合形成可溶性肽鈣復(fù)合物, 進(jìn)而可以提高其鈣離子螯合能力[42]。促鈣吸收肽中的氨基酸殘基側(cè)鏈中含有Asp、Ser、His、Cys和Gln等氨基酸時, 可能會通過靜電相互作用或氫鍵配位與肽形成復(fù)合物。因此含有以上氨基酸的肽鈣結(jié)合物活性較高[43]。

表3 已鑒定出的海洋來源促鈣吸收肽的制備條件與氨基酸序列

2.3 抗血栓

血小板的活化和聚集是血栓形成的主要原因, 目前使用的抗血小板藥物, 如阿司匹林, 可能會增加出血風(fēng)險、胃腸毒性、血小板反應(yīng)性等[50]。所以, 尋求來源更廣泛更安全可靠的抗血小板活性物質(zhì), 對預(yù)防或延緩血栓性疾病具有重大意義。

Pierschbacher等發(fā)現(xiàn)RGDS序列是纖維蛋白原結(jié)合細(xì)胞的活性位點, 可抑制血小板的凝集、纖連蛋白與活化血小板的結(jié)合, 最終抑制血栓形成[51]。從天然物質(zhì)中分離的抗血小板肽也相繼出現(xiàn)[52]。Khiari等采從腈魚皮胃蛋白酶酶解液中分離得到一種序列為FGN的三肽, 該肽作用濃度為60 μg/mL時, 血小板的聚集抑制活性與阿司匹林相似。Cian等[53]從紫菜堿性和風(fēng)味蛋白酶酶解液中分離純化得到一種分子量約為287 Da的抗血栓肽, 其抗血小板聚集活性可達(dá)44%±1.6%。Qiao等[54]對貽貝內(nèi)收肌、足、內(nèi)臟等8個不同部位的組織進(jìn)行酶解, 研究發(fā)現(xiàn)從內(nèi)收肌胰蛋白酶酶解液中分離得到氨基酸序列為“VQQELEDAEERADSAEGSLQK”的抗血小板肽對凝血酶的親和力較強, IC50值可達(dá)1.49 g/L。

2.4 降血脂

高血脂癥是指血液內(nèi)脂質(zhì)含量超過正常范圍, 即TG, TC, LDL-C過高及HDL-C過低, 由此誘發(fā)的一系列人體脂質(zhì)代謝紊亂疾病。應(yīng)用于臨床的有效降血脂藥物包括貝特類、他汀類等, 價格昂貴, 長期服用還可能會誘發(fā)胃腸道不適、全身性肌肉疼痛和無力等其他不良反應(yīng)[55]。

研究表明, 沙丁魚、大西洋鮭、扇貝、牡蠣等海洋動物中含有降血脂功能的活性肽, 它們富含ω-3脂肪酸和甾醇, 與部分陸地生物來源的降血脂活性物質(zhì)相比, 降血脂效果更為顯著, 一些活性肽的降血脂效果與合成降血脂藥相當(dāng)[56]。江錕等[57]利用胰蛋白酶對海洋鱸魚酶解5 h時, 此時水解度可達(dá)12.5%, 制備得到降血脂活性肽與降血脂藥物考來烯胺相當(dāng)。朱曉連等[58]以卵形鯧鲹魚肉為原料, 發(fā)現(xiàn)其作用濃度為100 g/L的酶解液與甘氨膽酸鈉體外結(jié)合率為21.73%, 相當(dāng)于同濃度降血脂藥物考來烯胺散的48.3%, 這也表明卵形鯧鲹酶解蛋白肽可輔助降血脂。

雖然一些海洋活性多肽在體外已被證明具有良好的降血脂活性, 但其在血脂調(diào)節(jié)方面的作用機制尚不清楚。為此, Ben等[59]通過動物實驗證明多肽含量為5%的沙丁魚酶解物可降低高血脂大鼠血脂水平, 其中, 血清中膽固醇和甘油三酯含量分別降低了31%和46%。

為進(jìn)一步確保海洋來源的降血脂肽的安全性和有效性, Zhu等[60]為探討海洋魚水解液中的膠原蛋白肽對Ⅱ型糖尿病的治療作用, 招募了100名Ⅱ型糖尿病患者和和50名健康對照, 研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)口服3個月海洋魚膠原蛋白肽后, 糖尿病患者血清中TG、TC、LDL、游離脂肪酸的水平顯著降低, HDL-C水平升高, 說明海洋魚膠原蛋白肽可改善患者的高血脂癥狀。通過結(jié)合膽酸鹽從而降低腸道對膽固醇吸收是已知食品輔助降血脂的主要機制之一。

2.5 抗炎

炎癥是人體應(yīng)對不同病原體、有毒化合物和受損細(xì)胞時, 免疫系統(tǒng)對組織損傷的自然生理反應(yīng), 這些觸發(fā)因素可以引發(fā)不同器官的急性或慢性炎癥反應(yīng), 引起組織損傷或一些免疫介導(dǎo)的疾病[61]。炎癥的發(fā)生與多種因子相關(guān), 包括介導(dǎo)前列腺素、白三烯、組胺、緩激肽、血小板活化因子和白細(xì)胞介素-1等化學(xué)物質(zhì)的釋放[62], 抗炎活性肽可以通過減少促炎細(xì)胞因子釋放, 抑制或干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的炎癥途徑、NF-κB和MAPK信號通路達(dá)到預(yù)防和治療炎癥的目的(圖2)。

圖2 海洋源抗炎活性肽的作用機制[63]

Cheng等[64]從金槍魚湯汁堿性蛋白酶酶解液中分離得到兩種抗炎肽, 其氨基酸序列分別為PRRMMNGGR和MGPAMMRTMPG, 分子質(zhì)量分別為1 543.8、1 211.5 Da, 研究發(fā)現(xiàn)在48 h, 肽濃度為500 μg/mL時, 仍可顯著抑制炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的表達(dá)。Qian等[65]將牡蠣組織胃蛋白酶、胰蛋白酶和Maxipro PSP酶解液依次經(jīng)大孔樹脂DA201-C柱洗脫得到四種多肽組分, 研究發(fā)現(xiàn)肽濃度為0.6 g/L時, 20%乙醇洗脫的胃蛋白酶酶解液和40%乙醇洗脫的胰蛋白酶酶解液分離組分可顯著抑制TNF-α的分泌, 40%乙醇洗脫Maxipro PSP酶解液分離組分對IL-1β和IL-6因子的抑制作用最強。

2.6 抗氧化

當(dāng)人體機體內(nèi)自由基過量堆積, 這些氧自由基會與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生反應(yīng), 生成大量的氧化物或過氧化物, 可能會打破人體的代謝平衡, 并引起動脈粥樣硬化、癌癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等一些慢性疾病的發(fā)生[66-67]。海洋抗氧化肽可以通過清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、金屬離子螯合等作用, 發(fā)揮抗氧化活性[4, 68]。

Zhao等[69]從腈魚肌肉酶解液中分離得到4種抗氧化肽PELDW、WPDHW、FGYDWW和YLHFW, 四個肽段的DPPH自由基清除率的EC50值分別為1.53、0.70、0.53和0.97 g/L、羥基自由基清除率的EC50值分別為1.12、0.38、0.26和0.67 g/L以及超氧陰離子自由基清除率的EC50值分別為0.85、0.49、0.34和1.37 g/L。Wong等[70]對藍(lán)斑刺鰩堿性蛋白酶水解液進(jìn)一步純化得到WAFAPA和MYPGLA兩個肽段。結(jié)果表明WAFAPA的抗氧化活性高于陽性對照谷胱甘肽和MYPGLA, 其EC50值分別為12.6、13.7和19.8 μmol/L。Zheng等[71]利用Ginger蛋白酶對魚皮進(jìn)行酶解, 進(jìn)一步分離得到氨基酸序列為Gly-Pro-Ala的抗氧化肽。研究發(fā)現(xiàn)Gly-Pro-Ala以劑量依賴的方式激活了ARE介導(dǎo)的抗氧化酶基因的表達(dá), 進(jìn)而抑制了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

3 展望

海洋來源的生物活性肽具有營養(yǎng)、安全的優(yōu)點, 在保健食品及生化藥物開發(fā)方面具有重要意義。目前國內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)來源生物活性肽的研究與應(yīng)用上也有了一定的成果, 但在構(gòu)效關(guān)系和作用機制方面的深入研究還欠缺, 難以闡釋清楚其作用靶點和代謝途徑, 限制了其在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。未來, 隨著分子對接技術(shù)、電鏡與大分子相互作用解析技術(shù)、基于靶蛋白-靶蛋白激活劑之間競爭性抑制的功效作用機制解析等技術(shù)的突破, 將有望深入研究海洋功能多肽的結(jié)構(gòu)特征與活性功效, 這對提高我國水產(chǎn)精深加工與高值化利用水平, 充分利用我國豐富的海洋蛋白資源, 具有十分重要的意義。

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Function, preparation technology, and mechanism of marine biological active peptides

YANG Gui-lan1, 2, 3, QIN Song1, 3, LI Wen-jun1, 3, LI Ya4

(1.Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2.School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264005, China; 3.Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4.Yantai Jiahui Marine Biological Technology Co., Ltd, Yantai 264003, China)

marine bioactive peptides; preparation methods; functional activity; mechanism

Many marine bioactive peptides have application prospects in the fields of functional food and medicine due to their various biological activities, such as antihypertensive, anti-inflammatory, antioxidation, and antiplatelet activities.This review highlights the overview on preparation methods, functional activity, and mechanism of marine biotic active peptide, and provides some references for their further development and utilization.

Sep.23, 2020

[National Key Research and Development Program of China, No.2018YFD0901102; Marine Economy Innovation Development Demonstration Project, No.YHCX-SW-L-201705; Major Science and Technology Innovation Project of Shandong Province (China), No.2019JZZY011103]

Q51

A

1000-3096(2021)10-0123-10

10.11759/hykx20200923003

2020-09-23;

2021-04-27

國家重點研究發(fā)展計劃(2018YFD0901102); “十三五”海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展示范項目煙臺市創(chuàng)新型海洋醫(yī)用材料產(chǎn)業(yè)孵化聚集創(chuàng)新與示范資助項目(YHCX-SW-Y-201701); 天然海洋膠原基可降解、可誘導(dǎo)、可修復(fù)系列生物醫(yī)用材料的研究與開發(fā)(2019JZZY011103)

楊貴蘭(1995—), 女, 山東滕州人, 碩士研究生, 研究方向: 海洋生物活性肽的開發(fā)與分析, 電話: 17861176003, E-mail: yangguilan0212@163.com; 李文軍, 通信作者, 副研究員, 研究方向: 海岸帶功能蛋白分子結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用, 電話: 15605350917, E-mail: wjli@yic.ac.cn; 李亞, 通信作者, 研究方向: 海洋生物活性肽產(chǎn)品的開發(fā)與研究, E-mail: biotechly@163.com

(本文編輯: 康亦兼)