NMDA受體和vein基因?qū)壗慌淙∠蛐袨榈恼{(diào)控研究

邵凌展，平 勇

(1. 上海交通大學(xué) Bio-X研究院，上海 200240； 2. 上海交通大學(xué) 教育部遺傳發(fā)育與精神疾病重點實驗室，上海 200240)

精神分裂癥(Schizophrenia)是一種病因、病理學(xué)復(fù)雜的情感性精神疾病，患者通常會表現(xiàn)出多類行為異常，包括認(rèn)知、情感、幻覺、攻擊等[1-4].2016年全球疾病負(fù)擔(dān)研究(Global Burden of Disease Study 2016, GBD)顯示精神分裂癥的全球患病率約為0.26%，其中，中國居民的患病率達到0.42%，位居所有國家的前列，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2].精神分裂癥的病理機制尚未清楚闡釋，但是人類遺傳學(xué)研究表明遺傳因素在精神分裂癥的產(chǎn)生和病情發(fā)展中起到重要的作用，并已確定了大量與該疾病易感性相關(guān)的候選基因[4-5].N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體功能低下一直被認(rèn)為是精神分裂癥的重要病因，NMDA兩亞基NR1和NR2的表達失調(diào)和磷酸化異常與患者社交及感覺運動控制方面的行為缺陷有關(guān)[6].值得注意的是，NMDA受體信號通路通常被認(rèn)為是精神分裂癥各種候選易感基因的一個重要聚合點[7].而谷氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)和多巴胺等信號通路被證實存在廣泛的相互作用，多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的失衡是該疾病重要的病理生理學(xué)表現(xiàn)[8].

此外，基因連鎖分析與關(guān)聯(lián)研究證實神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白NRG1(Neuregulin 1)及其受體ErbB4基因的改變與精神分裂癥的發(fā)生有著很強的相關(guān)性，NRG1-ErbB4信號通路能夠通過激活NMDA受體亞基蛋白NR2的磷酸化影響受體的功能[9].NRG1屬于一類含有表皮生長因子(Epithelial Growth Factor, EGF)結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，在物種間保持著很高的同源性.哺乳動物的NRG家族成員NRG1～NRG4分別由nrg1～nrg4基因編碼，通過激活酪氨酸激酶受體ErbB參與到早期神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)信號傳導(dǎo)以及突觸的可塑性中[10].已有研究發(fā)現(xiàn)，ErbB4通過其PDZ(Post Synaptic Density protein(PSD95)， Drosophila disc large tumor suppressor(D1g1)， zonula occludens-1 protein(zo-1))結(jié)構(gòu)域與谷氨酸能突觸后致密蛋白PSD95相互作用而錨定在突觸后膜上[11].NRG1雜合突變(NRG1+/-)的小鼠產(chǎn)生了精神分裂癥樣行為，并且在分子層面上表現(xiàn)出NMDA受體表達量和磷酸化水平的降低，以及谷氨酸能突觸功能的減退[12-13].果蠅神經(jīng)細(xì)胞在種類上與復(fù)雜程度上與人腦相似，且使用著與哺乳動物類似的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白[14].其中，vein(vn)蛋白及其受體EGFR分別為哺乳動物NRG和ErbB家族蛋白的唯一同源物[15]，vn/EGFR信號通路曾被發(fā)現(xiàn)參與到果蠅腹神經(jīng)束(VNC)等軸突發(fā)育中[16].

臨床證據(jù)表明，精神分裂癥與性別焦慮癥(Gender Dysphoria, GD)存在一定的共病性(comorbidity)，患者對性別身份認(rèn)知的扭曲被認(rèn)為與疾病的陽性癥狀(幻覺、妄想)有關(guān)[17].但是，目前對于精神分裂癥患者的性別障礙的研究大多基于心理學(xué)投射實驗(projective test)或性別角色測驗[18]，對實驗結(jié)果摻雜主觀性判斷，并且缺乏對其遺傳機制的深入探討.因此，尋找合適的動物模型對疾病的性別認(rèn)知行為學(xué)進行研究將有助于證實上述的關(guān)聯(lián)性.果蠅憑借其強大的行為能力和遺傳學(xué)背景，成為模擬神經(jīng)精神疾病行為學(xué)研究的理想系統(tǒng)，其中最重要的是求偶交配行為[19].果蠅區(qū)分雄雌的能力受基因控制，并且涉及到不同腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞和感官系統(tǒng)參與下對化學(xué)信息素，如7-三氯乙烯和順式醋酸乙烯酯(cVA)的感知[20]，而無法感知這些信息素的雄性果蠅會不恰當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)同性求愛的行為[19].腦中多種神經(jīng)遞質(zhì)信號紊亂曾被報道與果蠅異常的交配行為相關(guān)，比如，腦中降低的多巴胺水平能夠?qū)е鹿壔顒有院徒慌涑晒β实慕档?，而多巴胺表達水平上調(diào)的果蠅則表現(xiàn)出雄-雄交配的表型[4,21]，但是具體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控機制有待進一步研究.

本研究重點關(guān)注果蠅交配取向這一重要行為特征，首次證明了果蠅橢球體(EB)區(qū)NMDA受體表達能夠?qū)е缕浣慌淙∠蛐袨榈漠惓?同時，我們發(fā)現(xiàn)果蠅精神分裂癥易感同源基因vn和NMDA受體存在一定的信號聯(lián)系，共同調(diào)控這一行為過程.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

本研究中所使用的雄果蠅均以每組10～15只成群培養(yǎng)于食物管中，其中w1118，elav-Gal4;+;+(后文簡寫為elav-Gal4)，vnγ3果蠅來自本實驗室保種；UAS-dsNR1，UAS-dsNR2，UAS-dNR1，UAS-dNR2由臺灣省清華大學(xué)Ann-Shyn Chiang教授實驗室饋贈；UAS-vn(#58498)來自美國印第安納大學(xué)的Bloomington果蠅中心(Bloomington Stock Center)；UAS-vnRNAi(#108432)來自奧地利維也納果蠅資源中心(Vienna Drosophila Resource Center, VDRC).實驗果蠅培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)玉米粉-紅糖培養(yǎng)基上，放置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照條件為1 000 lux，相對濕度控制在60%左右，光照周期為明暗12 h交替(9：00 am開燈，21：00 pm關(guān)燈)；實驗中用到的普通體式顯微鏡購于意大利OPTIKA公司，透明果蠅食物管和UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒(B511321)購于生工生物工程(上海)股份有限公司，StepOne型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司.

1.2 果蠅交配取向?qū)嶒?/h3>

果蠅交配取向?qū)嶒炗诿咳胀粫r間(7:00～9:00 am)進行，實驗前大量收集羽化4 h內(nèi)的果蠅.其中，測試需要用的雄果蠅(test fly)單只獨立培養(yǎng)于食物管中至羽化后7 d進行實驗，而供其選擇交配的目標(biāo)雄性果蠅和雌性果蠅(testee male or female)則以每組10～15只成群培養(yǎng)于食物管中.實驗起始階段，將成群培養(yǎng)的雄果蠅和雌果蠅各一只分別斷頭后固定在直徑1.5 cm，高度2 cm的小型交配場地(圓柱體直徑15 mm×高20 mm)兩端.隨后，放入CO2麻醉后的受試雄性果蠅，其蘇醒后將在兩只去頭的目標(biāo)果蠅中任意選擇其交配對象.整個實驗過程被錄像記錄，時長為2 h.交配取向指數(shù)(Preference Index, PI)反映了2 h實驗過程中受試果蠅分別與斷頭雌性果蠅和雄性果蠅的交配時間差異，參見文獻[4]公式如下:

PI=(T雌-T雄)/(T雌+T雄)×100%.

1.3 Western blot

分別選取20只羽化7 d左右的野生型w1118、elav-Gal4;UAS-dsNR1和elav-Gal4;UAS-dsNR2果蠅進行實驗.在90倍體式顯微鏡下，使用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基在冰上剪取頭部.在4 ℃環(huán)境下，通過12 000×g離心10 min去除表皮碎片.頭部蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，檢測dNR1和dNR2蛋白的表達情況.Western blot實驗中使用的dNR1和dNR2抗體由Ann-Shyn Chiang教授饋贈.

1.4 實時熒光定量PCR

挑選羽化后7 d左右的elav-UAS-vnRNAi，UAS-vnRNAi和elav-Gal4果蠅各50只，在冰上剪取頭部，于液氮中分組凍存.用TRIzol試劑盒提取各組果蠅的總RNA，并進行電泳檢測.隨后，利用StepOne型熒光定量PCR儀完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄，并使用SYBR Green和所設(shè)計的RT-PCR引物對各組RNA進行實時定量PCR.反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s和60 ℃退火30 s，循環(huán)45次.整個反應(yīng)體系結(jié)束后，根據(jù)ct值，使用2-ΔΔCt方法計算表達量的相對變化.反應(yīng)引物的設(shè)計使用Oligo 7.0軟件，并以rp49為內(nèi)參基因，引物由擎科生物科技有限公司合成，序列信息見表1.

表1 實時熒光定量PCR引物序列信息Tab.1 Sequence information of genes fluorescencequantitative Real-time PCR primer

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗獲得數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM).正態(tài)分布的兩種基因型參數(shù)的組間均值比較采用Studentt檢驗(Sigma Plot 14.0)，并使用Graphpad Prism 6.0、CorelDRAW 2018等軟件作圖分析.統(tǒng)計學(xué)顯著性差異設(shè)置為當(dāng)*P<0.05時，即為有顯著性差異，同時設(shè)定**P<0.01，***P<0.001，n.s.為無顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 NMDA受體表達影響果蠅交配行為

2008年，Grosjean等[19]為研究果蠅同性交配相關(guān)基因，設(shè)計了果蠅交配取向的實驗量化方法(如圖1(a)所示)，通過記錄被測試雄性果蠅選擇雄性或雌性果蠅的時間段總和，計算交配取向指數(shù)(Preference Index, PI)來描述被測試果蠅的選擇配偶偏向性.

圖1 NMDA受體功能性敲除導(dǎo)致果蠅交配取向改變Fig.1 Function-loss of NMDA receptor changes the mating orientation in flies(a) 為果蠅交配取向檢測模式圖.(b)、(c) 為果蠅交配取向指數(shù)統(tǒng)計柱狀圖.其中，Ctr為elav-Gal4，dsNR1為elav-Gal4;UAS-dsNR1，dsNR1+dNR1為elav-Gal;UAS-dsNR1/UAS-dNR1，dsNR2為elav-Gal4;UAS-dsNR2，dsNR1+dNR2為elav-Gal;UAS-dsNR2/UAS-dNR2.N=6～10.均值比較采用Student t檢驗，**P<0.01，*P<0.05，n.s.為無顯著性差異.

我們沿用這一方法，首先利用dsRNA分別在果蠅全神經(jīng)元范圍內(nèi)抑制NMDA受體兩亞基蛋白基因dNR1和dNR2的表達，并觀察比較其交配行為.在酵母轉(zhuǎn)錄因子基因Gal4的控制下，靶向dsRNA干擾能夠在有絲分裂后神經(jīng)元中剔除或關(guān)閉特定基因的表達[22].在實驗中，我們選取的果蠅年齡均為羽化后7 d，由于果蠅的壽命周期較短，7 d的果蠅相較人類而言處于青年時期[3].對亞基蛋白表達水平的定量分析驗證了RNAi干擾的效果，結(jié)果如圖2所示，dNR1/2的表達分別被dsRNA所抑制.我們發(fā)現(xiàn)，相較于親代對照組，亞基蛋白dsNR1(圖1(b))和dsNR2(圖1(c))表達抑制的果蠅均出現(xiàn)異常的交配行為.dsNR1/2果蠅的PI指數(shù)明顯降低，分別為0.30和0.45，其中，dNR1受到抑制后的行為學(xué)差異更為明顯.這一結(jié)果表明，該受體在全神經(jīng)元范圍內(nèi)表達降低時，雄性之間交配行為增加.當(dāng)我們繼續(xù)通過UAS-dNR1/2恢復(fù)dNR1和dNR2兩亞基的表達水平時，突變體果蠅的PI指數(shù)分別被挽救至0.71和0.74，進一步證明了這一異常行為由基因表達降低所引起.這些結(jié)果提示NMDA受體參與調(diào)控了果蠅的交配行為.

圖2 果蠅dNR1和dNR2蛋白表達情況Fig.2 The expression of dNR1 and dNR2 proteins in fliesWestern blot實驗證明dNR1/2蛋白的表達均為dsRNA所抑制，其中syn(syntaxin)為內(nèi)參蛋白.

2.2 NMDA受體對果蠅交配取向的影響與特定神經(jīng)元有關(guān)

為了研究NMDA受體的行為學(xué)作用機制，我們必須首先確定哪類神經(jīng)元參與了該行為.影響果蠅社交行為的神經(jīng)元有很多，在這里我們主要關(guān)注幾種與果蠅認(rèn)知行為相關(guān)的神經(jīng)元，包括投射神經(jīng)元(Projection Neurons, PNs)、蘑菇體區(qū)神經(jīng)元(Mushroom Body Neurons, MBNs)以及蘑菇體后側(cè)緊挨著的橢球體區(qū)神經(jīng)元(Ellipsoid Body Neurons, EBNs)，并使用3類表達范圍更小的Gal4分別在上述神經(jīng)元內(nèi)驅(qū)動表達dsNR1(圖3(a)和dsNR2(圖3(b))，實現(xiàn)對NMDA受體功能的抑制.實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)我們通過GH146-Gal4、201Y-Gal4在PNs和MBs兩類神經(jīng)元內(nèi)抑制dNR1/2的功能時，果蠅的交配行為與對照組無異，PI指數(shù)保持在對照組區(qū)間范圍內(nèi)([0.78,0.83])，說明這兩類神經(jīng)元中NMDA受體的表達水平與交配取向無關(guān).幸運的是，當(dāng)我們用Feb170-Gal4分別驅(qū)動dsNR1和dsNR2在EB區(qū)域表達時，由圖3可以看出，果蠅交配取向行為均呈現(xiàn)與全神經(jīng)元表達一致的結(jié)果(圖1(b)、(c)).果蠅的PI指數(shù)分別為0.41和0.49，與對照組相比分別降低了48.3%和38.6%.該結(jié)果提示EB區(qū)域NMDA受體表達水平與果蠅的交配行為相關(guān).

圖3 降低果蠅EB區(qū)神經(jīng)元NMDA受體表達水平導(dǎo)致果蠅交配取向異常Fig.3 Reduced NMDA receptor expression in EB region neurons leads to abnormal mating orientation in flies(a)、(b)分別為在3種神經(jīng)元內(nèi)抑制dNR1和dNR2亞基表達時的果蠅交配取向指數(shù)統(tǒng)計柱狀圖.其中，Ctr1和Ctr2分別為UAS-dNR1和UAS-dNR2，GH146>dsNR1/2、201Y-Gal4>dsNR1/2和Feb170-Gal4>dsNR1/2分別對應(yīng)的果蠅基因型為GH146-Gal4;UAS-dsNR1/2、201Y-Gal4;UAS-dsNR1/2和Feb170-Gal4;UAS-dsNR1/2.N=8～10.均值比較采用Student t檢驗，*P<0.05，n.s.為無顯著性差異.

2.3 vn突變體果蠅出現(xiàn)異常的交配取向行為

由于果蠅的交配行為具有復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控機制，在確定了NMDA受體在此過程中的作用后，我們繼續(xù)考慮是否還存在其他相關(guān)基因參與調(diào)節(jié)這一過程.通過選擇性地對一些精神分裂癥相關(guān)的果蠅易感同源基因進行行為學(xué)篩選，我們觀察到果蠅類神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白vn基因突變的雄性果蠅在交配時選擇雌性配偶的總時長顯著降低，結(jié)果見圖4(a)(第650頁).vn突變體果蠅vnγ3的PI指數(shù)僅為0.37，相比于野生型w1118和其親代對照組UAS-vn分別降低了52.2%和54.1%.隨后，我們使用vnRNAi對vn基因進行功能性敲除，以證實該基因在此行為學(xué)過程中的作用.由圖4(b)(見第650頁)可以看出，vnRNAi果蠅展現(xiàn)出與vnγ3突變體極為相似的行為學(xué)缺陷，PI指數(shù)僅為0.41.為了進一步確認(rèn)該結(jié)果是由于基因表達水平降低，而非插入位點等其它影響，我們通過UAS-vn恢復(fù)突變體果蠅的vn基因表達水平.比較分析后發(fā)現(xiàn)兩種突變體果蠅行為異常情況得到了挽救，恢復(fù)率達到90%以上，相較對照組果蠅無統(tǒng)計學(xué)顯著差異.上述結(jié)果說明vn參與到果蠅交配取向行為的調(diào)節(jié)中.

圖4 vn突變體果蠅交配取向異常Fig.4 vn mutants have abnormal mating orientation(a)、(b)分別為vnγ3與vnRNAi突變體果蠅交配取向指數(shù)統(tǒng)計柱狀圖，過表達vn能夠挽救其交配取向的損傷.其中Ctr1為w1118，Ctr2為UAS-vn，vnγ3為vn突變體，vnγ3+vn為elav-Gal4;UAS-vn;vnγ3，vnRNAi為elav-Gal4;UAS-vnRNAi，vnRNAi+vn為elav-Gal4;UAS-vnRNAi/UAS-vn.N=9～10.均值比較采用Student t檢驗，**P<0.01，*P<0.05，n.s.為無顯著性差異.

2.4 vn與NMDA受體對果蠅交配取向影響的關(guān)聯(lián)

我們的實驗提示vn和NMDA受體均參與調(diào)控果蠅的交配取向，那么兩者間是否具有一定的關(guān)聯(lián)呢？為了探尋vn和NMDA受體的相互作用，我們首先檢測了vnRNAi果蠅基因dNR1與dNR2的表達情況.由圖5可以看出，當(dāng)我們抑制vn基因表達時，NMDA受體兩亞基蛋白的表達量均有所降低，且2號亞基的表現(xiàn)更為明顯.現(xiàn)有的證據(jù)顯示，只有dNR2亞基的N端包含NMDA受體的主要激活物谷氨酸的結(jié)合位點，并且其C端具有與EGFR類似的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序，能與錨定蛋白PSD95特異性結(jié)合[23].因此相較于dNR1，NMDA受體亞基dNR2似乎更有可能參與到vn/EGFR對神經(jīng)元谷氨酸能信號的調(diào)控中.此外，我們通過dsRNA在先前篩選到的EB神經(jīng)元內(nèi)下調(diào)vn的表達，并挑選雄性果蠅進行交配取向行為測試.統(tǒng)計結(jié)果顯示，果蠅的交配行為未受到顯著的影響(Feb170-Gal4，PI=0.82±0.15；Feb170>vn-RNAi，PI=0.76±0.17；P>0.05)，這說明EB神經(jīng)元內(nèi)vn的表達水平與果蠅的交配決策無關(guān).

圖5 vnRNAi果蠅NMDA受體兩亞基蛋白mRNA的相對表達水平Fig.5 Relative mRNA levels of two NMDA receptor genes in vnRNAi flies(a)、(b)分別為vnRNAi果蠅dNR1與dNR2兩基因mRNA表達量統(tǒng)計柱狀圖.Ctr1為elav-Gal4，Ctr2為w;UAS-vnRNAi，vnRNAi為elav-Gal4;UAS-vnRNAi.均值比較采用Student t檢驗，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.為無顯著性差異.

實際上，vn基因的5’端含有一段DNA編碼的疏水性肽段，Schnepp等[24]對蛋白的功能研究曾證實vn能夠分泌到胞外發(fā)揮作用.為驗證上述猜測是否正確，我們采用雜交的方式在果蠅全神經(jīng)元范圍內(nèi)同時抑制vn和dNR2受體的表達，并觀察雜交后代雄性果蠅的交配行為表現(xiàn).由圖6可以看出，vn和NMDA受體dNR2亞基同時下調(diào)的果蠅，PI指數(shù)為0.41，相較對照組降低了45%，該差異具備統(tǒng)計學(xué)顯著性.而與分別單獨抑制vn和dNR2(PI指數(shù)分別為0.44和0.37)相比，雄性果蠅的交配決策的正確率沒有顯著降低，即沒有出現(xiàn)基因表達抑制的疊加效應(yīng).這就說明在這一行為過程中，vn并非影響果蠅交配取向行為的獨立因素，vn/EGFR與NMBA受體通路在某種程度上存在神經(jīng)信號聯(lián)系.

圖6 同時抑制vn和dNR2不加強果蠅的交配取向異常Fig.6 Simultaneous suppression of vn and dNR2 did not aggravate the abnormal mating orientation in fliesvn和dNR2共表達后對果蠅交配傾向的影響與單獨抑制沒有顯著性差異.圖中Ctr為elav-Gal4，vnRNAi為elav-Gal4;UAS-vnRNAi，dsNR2為elav-Gal4;UAS-dsNR2，vnRNAi+dsNR2為elav-Gal4;UAS-vnRNAi/UAS-dsNR2.N=8～10.均值比較采用Student t檢驗，*P<0.05，n.s.為無顯著性差異.

3 討 論

果蠅的交配取向研究有一定的歷史，但目前尚未實現(xiàn)從神經(jīng)環(huán)路水平來解釋這種復(fù)雜調(diào)控的發(fā)生基礎(chǔ).Liu等[21]用遺傳和藥理學(xué)的方法上調(diào)發(fā)育期果蠅腦部的多巴胺水平發(fā)現(xiàn)，雄性果蠅表現(xiàn)出對其他同性果蠅增強的求愛傾向.我們的結(jié)果則首次證明，抑制谷氨酸受體NMDA的表達能夠?qū)е鹿壗慌淙∠蛐袨榈漠惓?，而橢球體(EB)區(qū)域在此過程中起到重要作用.谷氨酸能神經(jīng)元占大腦代謝活動總量的60%至80%，作為大腦中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸神經(jīng)傳遞的改變被發(fā)現(xiàn)與多種精神分裂癥相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)信號紊亂有關(guān)[25].多項研究表明，多巴胺神經(jīng)元是谷氨酸能投射到中腦多巴胺核(midbrain dopamine nucle)來調(diào)節(jié)的，這使得它們對谷氨酸的變化具有潛在的敏感性[26].EB是果蠅中央復(fù)合體的主要結(jié)構(gòu)之一，雖然目前對其功能的研究相對較少，但已有文獻表明EB區(qū)神經(jīng)元的NMDA受體功能與果蠅的認(rèn)知行為，如嗅覺學(xué)習(xí)記憶和行動決策相關(guān)[27-29].對于EB區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其中含有大量GABA的存在[30]；Zhang等[27]使用GABA抗體對EB區(qū)域進行免疫組化染色，同樣證實了該區(qū)約有2/3的Role 2(R2)和Role 4(R4)神經(jīng)元以及部分Role 1(R1)和Role 3(R3)神經(jīng)元都是GABA能的.發(fā)育期GABA能神經(jīng)元中NMDA受體功能的異常是多巴胺異常釋放所必需的[31]，NMDA受體拮抗劑已被證明能降低GABA能中間神經(jīng)元功能[32].結(jié)合本次實驗結(jié)果，我們認(rèn)為多巴胺調(diào)節(jié)增強導(dǎo)致的果蠅交配取向異常可能是繼發(fā)于谷氨酸能功能障礙的.果蠅EB區(qū)NMDA受體表達量的下調(diào)導(dǎo)致谷氨酸能無法有效投射到腦部，對多巴胺神經(jīng)元起到足夠的抑制作用.反過來，受到過度刺激的多巴胺信號導(dǎo)致果蠅的交配取向異常.

在此基礎(chǔ)上，我們又意外地通過行為學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)另一果蠅精神分裂癥易感同源基因vn參與到交配取向的調(diào)節(jié)中.vnγ3突變體果蠅的交配取向改變，隨后的基因的RNAi干擾與過表達實驗進一步證實突變體果蠅vn基因表達量下調(diào)與異常交配行為學(xué)的因果關(guān)系.果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的EGFR信號參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育與相互作用，涉及到不同的分子機制與受體相互作用.除了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類配體vn外，目前在果蠅中還發(fā)現(xiàn)了spitz(spi)、gurken(grk)和Keren(Krn)3類TGF-α配體[15].需要注意的是，哺乳動物神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白NRG1已被證實能夠通過直接影響多巴胺受體的功能來干擾多巴胺能的傳遞[33].因而NRG1-ErbB信號通路的改變被認(rèn)為與精神分裂癥患者腦內(nèi)谷氨酸能和多巴胺能系統(tǒng)的失調(diào)有關(guān)，并直接導(dǎo)致了患者的神經(jīng)發(fā)育性認(rèn)知障礙[34].我們實驗結(jié)果則證明了NRG1的同源蛋白vn能夠影響NMDA受體基因的表達，即兩者在果蠅的交配行為中存在的某種信號聯(lián)系.雖然在EB區(qū)域抑制vn的表達時未發(fā)現(xiàn)果蠅交配取向的改變，但作為一種神經(jīng)元合成并分泌的小分子蛋白[24]，我們認(rèn)為vn仍有通過分泌的方式間接影響果蠅EB區(qū)域神經(jīng)元內(nèi)NMDA受體表達的可能.在后續(xù)的研究中，我們將重點關(guān)注vn對NMDA受體的精確調(diào)控機制，深入研究神經(jīng)遞質(zhì)影響果蠅交配行為的神經(jīng)環(huán)路和細(xì)胞分子基礎(chǔ).

NMDAR之所以成為人們最關(guān)注的精神分裂易感基因之一，不僅在于其本身在認(rèn)知行為方面的重要功能，還在于它具有復(fù)雜且龐大的與之相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)，對這個網(wǎng)絡(luò)及其內(nèi)部相互作用模式的研究將加深我們對精神分裂癥遺傳模式的認(rèn)識.而作為精神分裂癥患者神經(jīng)損傷及發(fā)育異常的標(biāo)志，認(rèn)知功能障礙的病理生理機制仍未得到解析.因此，從理論上講，利用果蠅建立精神分裂癥模型，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的早期風(fēng)險因素，有助于揭示疾病背后復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路，為疾病的治療提供新的目標(biāo).