甘肅東部地區(qū)羊傳染性膿皰皮炎病的調查及防治試驗

常 亮

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平涼 744000)

羊傳染性膿皰皮炎(contagious pustular dermatitis)俗稱羊口瘡，是由羊傳染性膿皰皮炎病毒(Orf virus, ORFV)引起綿羊和山羊以口唇等處的皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結成疣狀厚痂的接觸性嗜上皮性傳染病[1]。該病可感染人、犢牛、駱駝等。感染羊群后發(fā)病率高達90%，病死率為1%～25%[2]，經常造成養(yǎng)羊企業(yè)和養(yǎng)羊戶的巨大經濟損失。

此病臨床上和羊痘、羊口蹄疫等羊的潰爛性皮炎病癥狀極為相似，所以，臨床診斷容易導致誤診，要想進一步確定該病，需要進行血清抗體和病原的檢測。目前，關于羊傳染性膿皰皮炎病的血清學檢測主要有病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗和蛋白質印跡技術等，病原學檢測方法主要有電鏡法、PCR法以及目前研究較熱的環(huán)介導等溫擴增技術等[3]。由于該病治療無特效藥，所以免疫預防就顯得尤為重要，疫苗接種更是預防本病的重要手段。傳統(tǒng)疫苗有滅活疫苗、弱毒疫苗等，這些都是將羊傳染性膿皰皮炎病毒經過特殊處理后制作成具有產生抗體的疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，新型疫苗是近幾年研究的熱門，比如DNA疫苗、亞單位疫苗和基因工程苗等技術都在羊傳染性膿皰皮炎疫苗研發(fā)中得到應用[4]。Zhao等[5]和李鵬飛等[6]構建的表達載體給小鼠接種后攻毒表明DNA疫苗可以作為羊口瘡預防方法；在基因克隆及表達上，大多選擇ORFV全基因組中的第11號基因，即B2L基因。因為該基因位于皮膚傳染病區(qū)，基因全長1 137 bp，為一個完整的閱皮膚以及粘膜增生性病變基因。

紅茂草又名禿瘡花，主要在中國西北高寒地區(qū)生長，其生物堿抗病毒作用近年來也得到驗證。禿瘡花水溶性制劑主要應用于山羊痘(GP)、羊傳染性膿皰皮炎(CPD)、雞新城疫(ND)、雞傳染性支氣管炎(IB)及羊的外科創(chuàng)傷、疥癬和瘺管外科疾病的防治上。關于紅茂草在羊傳染性膿皰皮炎的研究上，早在1998年，王廷璞等[7]就已經發(fā)現紅茂草對ORFV有抑制作用。近年來，許多科研工作者在紅茂草對羊傳染性膿皰皮炎的治療已做大量研究。馬志宏等[8]利用紅茂草不同劑型和濃度治療羊傳染性膿皰皮炎，顯示出較好的效果。

近年來，羊傳染性膿皰皮炎在國內的發(fā)生呈上升趨勢。本病在甘肅省存在已久，從上世紀中葉起就有該病的報道[9]。近年來，隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和飼喂模式的改進，本病在甘肅省呈不斷擴展、蔓延之勢。甘肅東部地區(qū)又是甘肅省養(yǎng)羊業(yè)比較集中的區(qū)域，該病有較高的發(fā)生率，為了摸清羊傳染性膿皰皮炎在甘肅東部地區(qū)的發(fā)病情況，進行抽樣調查，對發(fā)生該病羊群針對性地開展防治試驗，以便為科學防治羊傳染性膿皰皮炎病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

臨床血樣(采自甘肅省平涼市、慶陽市羊只，-20 ℃保存)。DNA提取試劑盒購自Qiagen 公司，PCR擴增試劑(TaqDNA聚合酶、PCR 反應緩沖液、dNTP)、DL2000 DNA Marker 和瓊脂糖等均購自寶生物工程(大連)有限公司。紅茂草獸用制劑(Ⅰ組為擦劑，Ⅱ組為粉劑、Ⅲ組為噴劑)、羊傳染性膿包皮炎耐熱性活疫苗由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 羊傳染性膿皰皮炎病毒的PCR檢測方法建立 引物設計與合成：參照GenBank中公布的B2L基因序列，應用Primer 5.0軟件設計一對檢測引物，上游引物：5′-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3′，下游引物：5′-TCCCGCTCG-AAGACCGCAGACAG-3′，上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

B2L基因的擴增與擴增體系優(yōu)化：按照 Qiagen 公司的DNA提取試劑盒操作說明進行臨床血樣的DNA提取。按照下列擴增體系進行B2L基因的PCR擴增:10×PCR Buffer 3 μL、TaqDNA聚合酶 0.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板2.5 μL、ddH2O 17 μL。反應條件：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32個循環(huán),72 ℃延伸10 min。利用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行結果檢測。將擴增體系中各成分含量和退火溫度設置梯度進行優(yōu)化。

1.2.2 流行病學調查 羊痘在臨床上主要表現為發(fā)熱、無毛或少毛皮膚部出現丘疹和皰疹，而羊口瘡則表現在以口唇、舌、鼻和乳房等部位形成丘疹、水皰或膿皰等，缺乏養(yǎng)殖經驗的散戶僅憑臨床癥狀很容易將該病和羊痘相混淆。本次流行病學調查根據甘肅省平涼市和慶陽市羊產業(yè)養(yǎng)殖分布特點和養(yǎng)殖模式，采用整群抽樣、問卷調查和隨機抽樣等為主的調查方法。隨機抽樣是根據在畜牧管理部門登記在冊的養(yǎng)羊場隨機抽樣調查，并按比例隨機抽樣采集羊只血液，運用本試驗建立的羊傳染性膿皰病毒的PCR檢測方法進行臨床血樣ORFV的PCR檢測。

1.2.3 防治試驗 治療試驗：對己患羊傳染性膿皰皮炎的羊群，按群隨機分組應用不同劑型的紅茂草制劑進行治療，以確定不同劑型的紅茂草制劑的治愈率和治療效果。治療程序是對羊只的丘疹、水疤、膿疤、潰爛和疵狀癡皮，先劃破丘疹、水疤、膿痂，清除癡皮，用生理鹽水沖洗傷口，用無菌藥棉蘸干傷口殘留的液體；再用不同劑型的紅茂草制劑涂抹于水疤、膿瘡、潰爛和疵狀癡皮清除部，每天1～2次，連續(xù)治療5 d，并觀察療效。

免疫預防：在羊傳染性膿皰皮炎流行嚴重區(qū)域用羊傳染性膿皰皮炎耐熱性活疫苗對羊群免疫接種，統(tǒng)計接種羊群羊只數量及一個發(fā)病周期內免疫接種羊的免疫保護率。

2 結果與分析

2.1 羊傳染性膿皰皮炎病毒的PCR檢測方法 建立

B2L基因的PCR優(yōu)化擴增體系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL、TaqDNA聚合酶 0.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 18 μL。最佳退火溫度為：56 ℃ 30 s。

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，PCR擴增產物大小為1 137 bp(圖1)，與預期結果一致，該反應體系經過優(yōu)化后建立的羊傳染性膿皰皮炎病毒的PCR檢測方法可用于實際檢測應用中。

2.2 流行病學的調查

2018—2020年在甘肅東部地區(qū)的平涼和慶陽兩市對230個羊場進行羊傳染性膿皰皮炎問卷調查，統(tǒng)計2019年不同飼養(yǎng)模式下羊傳染性膿皰皮炎的發(fā)病情況，統(tǒng)計結果見表1，并隨機對羊只采集血樣，用“羊接觸傳染性膿皰皮炎臨床PCR診斷方法的建立及應用”課題組(以下稱本課題組)建立的羊傳染性膿皰皮炎PCR檢測方法進行檢測，結果見表2。

從表1可以看出，3種類型養(yǎng)羊模式下羊場羊傳染性膿皰皮炎發(fā)病率分別為25.6%、59.7%和39.6%，說明本病在甘肅東部地區(qū)有較高的感染率，呈地方性流行。但不同的養(yǎng)殖模式羊傳染性膿皰皮炎的發(fā)病率相差較大，養(yǎng)殖小區(qū)本病的發(fā)生率是規(guī)模養(yǎng)殖場的近兩倍，個體養(yǎng)羊戶也有較高的發(fā)生率，由此看來，規(guī)模養(yǎng)殖場管理規(guī)范，對防疫工作重視程度高，發(fā)病率相對較低，養(yǎng)殖小區(qū)羊數量雖然沒有規(guī)模養(yǎng)殖場多，但羊群也比較集中，因此，防疫工作不到位容易導致該病的發(fā)生，而個體養(yǎng)羊戶相對其他兩種模式來說羊只數量明顯減少，通過接觸大面積傳播的機率相對減少。從表2可知，經連續(xù)3 a采集血樣，經本課題建立的羊傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法檢測，結果顯示甘肅東部地區(qū)每年羔羊患羊傳染性膿皰皮炎核酸陽性率在16%以上。且陽性率在逐年降低，這可能與本地區(qū)近幾年對該病防疫工作的重視程度有關。

表1 不同飼養(yǎng)管理模式下羊傳染性膿皰皮炎發(fā)病情況

表2 羊傳染性膿皰皮炎血液樣品檢測結果

2.3 不同劑型的紅茂草制劑的治療試驗

在甘肅東部地區(qū)某羊場用不同劑型的紅茂草制劑對不同年齡的患有羊傳染性膿皰皮炎病的病羊的治療效果(表3)。從表3可知，不同劑型的紅茂草制劑對患有羊傳染性膿皰皮炎病的羔羊和成年羊均有效，對成年羊的治療效果略好于羔羊，但治愈率均能達到86.9%以上。

表3 紅茂草制劑對羊傳染性膿包皮炎治療效果

2.4 免疫預防試驗效果

在2019年用3個批次的耐熱性羊傳染性膿皰皮炎弱毒疫苗在甘肅東部地區(qū)示范應用16萬只。從表4可知，3批次疫苗在接種后觀察均無異常反應，接種21 d后統(tǒng)計結果顯示，發(fā)病率為0.85%，比接種前下降24.15個百分點，說明羊傳染性膿皰皮炎耐熱性弱毒疫苗能有效地預防該病的發(fā)生和流行，由此反應，預防本病的發(fā)生必須做好免疫預防。

表4 羊傳染性膿皰皮炎耐熱性弱毒疫苗應用及效果統(tǒng)計

3 討 論

羊傳染性膿皰皮炎在所有養(yǎng)羊的國家和地區(qū)均有發(fā)生。近年來，傳染性膿皰皮炎在中國甘肅、新疆、內蒙古、陜西、西藏、四川和云南等省區(qū)流行,給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大損失。隨著國家封山育林政策的實施，羊飼養(yǎng)模式由原來的放牧轉變?yōu)樯犸曪曫B(yǎng)；市場需求的變化，跨區(qū)調羊更頻繁，飼養(yǎng)規(guī)模向集約化規(guī)?；l(fā)展，這些因素，更容易造成也羊傳染性膿皰皮炎病的發(fā)生和流行。原來羊傳染性膿皰皮炎發(fā)生的面窄、數量小，現在發(fā)生的面寬、數量大，且在多數省份或地區(qū)呈流行態(tài)勢，影響了養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展和收益[10]。

甘肅東部是西北地區(qū)畜牧業(yè)高度集中區(qū)，目前羊只年存欄達350多萬只。本研究對甘肅東部地區(qū)230個不同規(guī)模羊場的調查發(fā)現，規(guī)模化羊場羊傳染性膿皰皮炎發(fā)病率較低，僅為25.6%，而養(yǎng)殖小區(qū)內的羊場羊傳染性膿皰皮炎發(fā)病率高達59.7%，但散養(yǎng)戶的羊傳染性膿皰皮炎的發(fā)病率高于規(guī)?；驁?4個百分點，低于養(yǎng)殖小區(qū)羊場的20.1個百分點。調查結果說明，規(guī)模化程度越高的羊場，防疫管理越重視，防疫措施越嚴格，羊傳染性膿皰皮炎的感染率和發(fā)病率越低。

對發(fā)病羊用不同劑型的紅茂草制劑治療試驗，證實3種不同劑型對羊只患有羊傳染性膿皰皮炎均有很好的治療效果，這與黨巖等[11]的報道一致。這也進一步證實紅茂草不論注射劑還是外用制劑均對患有羊傳染性膿皰皮炎的羊只有效，治愈率均在86.9%以上。通過預防試驗，證實了甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所研制的羊傳染性膿皰皮炎耐熱性活疫苗能夠很好地預防羊傳染性膿皰皮炎，保護率在99%以上。這一結果與秦崇凱等[12]報道一致。

要徹底地控制當前甘肅東部地區(qū)流行的羊傳染性膿皰皮炎病，必須強化防治工作。要對本地區(qū)所有羊群進行連續(xù)3 a以上預防接種，同時要做好檢測、檢疫、隔離和治療工作，逐步建立起無羊傳染性膿皰皮炎病區(qū)域。只有這樣才能消除和凈化羊群中流行的羊傳染性膿皰皮炎病，減少該地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的經濟損失，促進羊產業(yè)快速發(fā)展。