費(fèi)氏弧菌檢測(cè)土壤聯(lián)合毒性模型分析

江偉，肖昕，王昆，吳晉芝，張良，陸方筱

(1.華僑大學(xué) 福建省生物化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021；2.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

被污染土壤中的重金屬離子往往表現(xiàn)出化學(xué)污染物的聯(lián)合毒性，即幾種污染物會(huì)同時(shí)存在于現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，暴露在其中的生物機(jī)體會(huì)受其影響而產(chǎn)生完全不同于單一化學(xué)污染物的生物學(xué)效應(yīng).這類(lèi)兩種或兩種以上的化學(xué)污染物共同作用而產(chǎn)生的綜合毒性作用，稱(chēng)為化學(xué)污染物的聯(lián)合毒性作用[1-2].

發(fā)光細(xì)菌是一類(lèi)在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見(jiàn)熒光的細(xì)菌，熒光波長(zhǎng)在420～660 nm之間[3].常見(jiàn)的菌屬有異短桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、希瓦氏菌屬和弧菌屬等[4].朱麗娜[5]等指出發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、對(duì)有毒物質(zhì)反應(yīng)靈敏、檢測(cè)周期短、具有同高等動(dòng)物相類(lèi)似的理化特性(如呼吸作用，ATP水平變化，酶活性變化等)，能在短時(shí)間內(nèi)得到準(zhǔn)確的毒性數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn).發(fā)光細(xì)菌中的費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)屬弧菌屬，曾用來(lái)檢測(cè)污水中的毒性物質(zhì)[6]并作為一種單一重金屬離子毒性的表征試劑[7].同時(shí)，費(fèi)氏弧菌擁有培養(yǎng)成本低、繁殖周期短，耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是探究聯(lián)合毒性檢測(cè)的理想材料.本文通過(guò)費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與重金屬離子的綜合含量的關(guān)系，建立一個(gè)對(duì)土壤重金屬綜合含量進(jìn)行定量分析的數(shù)學(xué)模型.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器有AOL-1型全光譜超微弱光檢測(cè)器、搖床等.主要試劑有氯化鈉、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鉛、乙酸鉻、乙酸鎳.五處采樣地點(diǎn)的土壤樣品.費(fèi)氏弧菌凍干粉購(gòu)自浙江托科司生物科技有限責(zé)任公司.

1.2 菌種的復(fù)蘇及菌液的制備

取一份費(fèi)氏弧菌凍干粉和一只復(fù)蘇液，置于室溫下平衡15 min.將2 mL復(fù)蘇液注入凍干粉試劑瓶中，靜置10 min.復(fù)蘇完成后將費(fèi)氏弧菌以1∶4的比例用2%的氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)镁♂屢?

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

分別配制濃度為0.3 mg·L-1的硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鉛、乙酸鉻、乙酸鎳溶液作為單因素實(shí)驗(yàn)的待測(cè)液.將菌稀釋液以1∶90的比例與待測(cè)液混合，反應(yīng)時(shí)間為15 min.采用AOL-1型全光譜超微弱光檢測(cè)器對(duì)混合后的樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄費(fèi)氏弧菌在不同種類(lèi)重金屬離子中的發(fā)光強(qiáng)度.

在單因素實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白組，將費(fèi)氏弧菌稀釋液與2%氯化鈉溶液以1∶90的比例混合15 min后檢測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度，并計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=樣品發(fā)光強(qiáng)度/空白發(fā)光強(qiáng)度).

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

計(jì)算單因素實(shí)驗(yàn)中每種重金屬離子的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度.為確保模型的上限毒性足夠大，選擇毒性較大的3種重金屬離子作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素.參考趙莉等[8]的研究，設(shè)置水平分別為0.10，0.20，0.30 mg·L-1Pb2+；0.10，0.45，0.80 mg·L-1Ni2+；0.10，0.35，0.60 mg·L-1Cu2+，使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析.

1.5 樣品土壤的采集和預(yù)處理

本研究選取五處土壤樣品采集點(diǎn)，布置如表1所示.每一個(gè)采樣點(diǎn)采集4份土樣，分別采集距地表20 cm處深層土和地表淺層土，取樣點(diǎn)分布在排污口和車(chē)間兩處，采用隨機(jī)取樣的方法進(jìn)行取樣.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

采集到土樣后，剔除土壤中砂礫、石塊、木棒、雜草、植物殘根、昆蟲(chóng)尸體、石塊，以及新生體錳結(jié)核和石灰結(jié)核等雜物，然后將土壤平鋪在墊襯有干凈白紙的晾曬板或木板上自然風(fēng)干(嚴(yán)禁暴曬).當(dāng)樣品達(dá)到半干狀態(tài)時(shí)，將大塊土打碎，以免結(jié)成硬塊，并在風(fēng)干過(guò)程中，隨時(shí)揀掉石礫、動(dòng)植物殘?bào)w.風(fēng)干室保持干燥通風(fēng)，風(fēng)干溫度為30～35 ℃，風(fēng)干時(shí)間為3～7 d.將風(fēng)干土用研磨棒磨碎，首先需將其過(guò)孔徑為2 mm尼龍篩，再進(jìn)一步用研缽反復(fù)研磨，過(guò)篩3～4遍，直至僅有少量沙粒方可停止，最后再過(guò)100目細(xì)篩.

1.6 土壤樣品的制備

稱(chēng)取過(guò)篩后的土樣，以土壤∶水=1∶5的比例配成土壤懸濁液，搖床震蕩8 h，靜置16 h后取得上清液；然后，用20 μm超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，將濾液以轉(zhuǎn)速5 000～9 000 r·min-1，時(shí)間為3 min進(jìn)行離心，得到無(wú)色透明的溶液即為待測(cè)土壤樣品.

1.7 土壤樣品的檢測(cè)

將菌稀釋液以1∶90的比例與待測(cè)樣品混合，同時(shí)設(shè)立空白組.此空白組與單因素實(shí)驗(yàn)中的空白組相同.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算可得硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鉛、乙酸鉻和乙酸鎳的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(Ire)分別為17.12%，22.51%，12.52%，19.29%和12.10%.相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最低的前3種金屬離子分別為Ni2+，Pb2+，Cu2+，故將它們作為響應(yīng)面分析的3因素.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)，如表2所示.使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析，如表3所示.表3中：I為發(fā)光強(qiáng)度.Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析，如表4所示.表4中：“*”表示P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“**”表示P<0.01，極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“-”表示P>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.由表4可知：模型的F=10.98，說(shuō)明該模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.238 9>0.05，即不顯著，表明該模型在零水平處擬合較好，模型選擇正確.

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析

各金屬離子濃度交互作用對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(I)影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖，如圖1所示.

(a)A(Pb2+)-B(Cu2+)

運(yùn)用構(gòu)建好的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)進(jìn)行分析.對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行二階回歸擬合，得到回歸方程為

上式中：A，B，C分別代表Pb2+，Cu2+，Ni2+，其中C的系數(shù)最大，表明Ni2+的濃度對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度的影響最顯著.這可能是由于Ni2+的濃度梯度范圍過(guò)大所導(dǎo)致，但本研究并未進(jìn)行深入探討.因素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度影響的主次順序依次為Ni2+，Pb2+，Cu2+.當(dāng)Ni2+濃度不變時(shí)，可以看出費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度隨著Cu2+濃度的上升先減小后變大，BC交互項(xiàng)(P>0.05)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響并不顯著.

在最優(yōu)條件下，各因素及響應(yīng)值的取值如圖2所示.從圖2可知：當(dāng)理論上的濃度值Pb2+=0.3 mg·L-1，Cu2+=0.1 mg·L-1，Ni2+=0.737 602 mg·L-1時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度可以達(dá)到最大值960.015.

圖2 各因素及響應(yīng)值在最優(yōu)條件下的取值

2.3 聯(lián)合毒性模型的構(gòu)建

利用響應(yīng)面分析，擬合出不同離子配比下相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度由強(qiáng)到弱的線(xiàn)性關(guān)系模型；然后，將此線(xiàn)性模型中離子綜合濃度等比例放大和縮小，結(jié)果如表5，圖3所示.圖3中：Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度；n為濃縮倍數(shù).從表5，圖3可知：不同倍數(shù)下，斜率相同，線(xiàn)性關(guān)系仍然成立，即在濃度條件改變下，配比不變，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度差值不變.但是在同一配比下，離子綜合濃度不同，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度不同.

表5 不同稀釋倍數(shù)下三元混合體系線(xiàn)性回歸方程

(a)響應(yīng)面模擬 (b)各離子濃度均縮小2倍

在此基礎(chǔ)上，將離子配比固定，改變離子綜合濃度，得到相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度數(shù)值后，再次構(gòu)建聯(lián)合毒性模型，如圖4所示.圖4中：Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度；ξ為毒性系數(shù).首先定義毒性系數(shù)，將Pb2+∶Cu2+∶Ni2+的濃度比例為0.20∶0.35∶0.45時(shí)，定義毒性系數(shù)為1.即放大10倍，毒性系數(shù)就是10，放大0.3倍，毒性系數(shù)就是0.3，放大0.5倍，毒性系數(shù)就是0.5，以此類(lèi)推.其次，進(jìn)行毒性區(qū)間的劃分，即Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)的毒性區(qū)間分別表示土壤的綜合毒性相當(dāng)于重金屬離子含量分別為0.01，10，20 mg·L-1.

圖4 聯(lián)合毒性模型

2.5 模型在土壤檢測(cè)中的應(yīng)用

在對(duì)土壤檢測(cè)的應(yīng)用中，本實(shí)驗(yàn)分別采集了上述5個(gè)企業(yè)的深層和表層的土壤進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表6所示.表6中：Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度；取樣地靠近排污口為“樣一”，靠近車(chē)間為“樣二”.

表6 五個(gè)取樣地點(diǎn)深層與表層土上清液對(duì)應(yīng)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度

同一工廠不同采樣點(diǎn)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)差(SD)對(duì)比，如圖5所示.深層層土與表層層土的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(Ire)對(duì)比，結(jié)果如圖6所示.

(a)深層樣一，深層樣二 (b)表層樣一，表層樣二

圖6 深層層與表層土相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)比

從圖5可知：同一工廠“深層樣一，深層樣二”和“表層樣一，表層樣二”的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度有著相同的變化趨勢(shì)，其中二化化工廠排污口和車(chē)間的土壤污染程度存較其他工廠存在較為明顯的差異.從圖6可知：深層土的生物毒性比表層土的要弱，即深層土壤的污染程度略低于表層土壤的污染程度.此外，所有土樣毒性區(qū)間都在Ⅱ區(qū)，土壤的生物毒性相當(dāng)于重金屬離子含量101mg·L-1等級(jí)，生物毒性較小.

3 討論

本研究采用響應(yīng)面分析法得出費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與重金屬離子的綜合含量的關(guān)系，將不同重金屬的含量范圍定義為不同的毒性區(qū)間，從而建立了一個(gè)可以對(duì)土壤重金屬綜合含量進(jìn)行定量的數(shù)學(xué)模型.單因素實(shí)驗(yàn)中所得出的離子毒性從大到小排序?yàn)镹i2+>Pb2+>Cu2+>Cr6+>Fe2+，這與趙莉等[8]、楊虹[7]研究中Pb2+，Cu2+，Cr6+的毒性大小排序相符合.同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)增加檢測(cè)了鎳、鉻的毒性，而鎳是合金、陶瓷染料等生活中常見(jiàn)的物品配方.此外，近年來(lái)推廣的混合動(dòng)力汽車(chē)多數(shù)使用的是鎳氫動(dòng)力電池[9]，報(bào)廢的鎳氫電池造成的城市污染也是不容小覷的.鉻則一直作為合金生產(chǎn)等工業(yè)生產(chǎn)的重要元素，因此，鉻渣帶來(lái)的污染也同樣值得關(guān)注.

不同放大倍數(shù)下費(fèi)氏弧菌毒性的變化趨勢(shì)，如圖7所示.圖7中：Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度；ξ為毒性系數(shù).從圖7可知：費(fèi)氏弧菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度在不同濃度重金屬離子的作用下，存在“低濃度促進(jìn)，高濃度抑制”的現(xiàn)象，即毒物興奮效應(yīng)(hormesis).此效應(yīng)廣泛存在于各類(lèi)發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)中.它是指某種毒物在高濃度時(shí)對(duì)生物體產(chǎn)生負(fù)面作用，但在低濃度時(shí)對(duì)生物體卻產(chǎn)生正面作用[10].Shen等[11]研究了Cu2+，Zn2+，Cd2+，Cr6+作為單一毒物對(duì)青?；【挠绊懀舶l(fā)現(xiàn)了上述效應(yīng)，并且還發(fā)現(xiàn)這種效應(yīng)不隨接觸時(shí)間的改變而改變.此現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因是，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)是一種氧化反應(yīng)，它會(huì)產(chǎn)生一種氧化產(chǎn)物黃素單核苷酸(FMN)[12].研究表明，F(xiàn)MN能夠結(jié)合煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)提供的H+而被還原重新生成FMNH2[13]，從而使得發(fā)光能夠連續(xù)進(jìn)行.

(a)最弱毒性 (b)最強(qiáng)毒性

通過(guò)研究鹽酸四環(huán)素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光的影響，湯淼等[14]發(fā)現(xiàn)低濃度的鹽酸四環(huán)素會(huì)促進(jìn)發(fā)光的原因在于，鹽酸四環(huán)素相較于NADH更能提供所需的質(zhì)子.一般情況下，重金屬離子在水溶液中會(huì)存在一種水解反應(yīng)，且濃度越低越能促進(jìn)水解反應(yīng)的發(fā)生.水解反應(yīng)會(huì)使得溶液中存在一定量的H+，這一定量的H+可能促使FMN重新還原為FMNH2.這種效應(yīng)的存在會(huì)產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最大值，在本實(shí)驗(yàn)的模型中將它稱(chēng)之為“拐點(diǎn)”.方便起見(jiàn)，將Pb2+∶Cu2+∶Ni2+濃度比例為0.20∶0.35∶0.45時(shí)的模型作為初步模型.

由于拐點(diǎn)的存在，本實(shí)驗(yàn)的模型在應(yīng)用時(shí)可以借助其他數(shù)據(jù)來(lái)細(xì)化區(qū)間.根據(jù)趙莉等[8]的研究，汞離子對(duì)于費(fèi)氏弧菌的毒性較強(qiáng)，不存在拐點(diǎn).因此，當(dāng)待測(cè)樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度可同時(shí)對(duì)應(yīng)Ⅰ級(jí)毒性區(qū)間和Ⅲ級(jí)毒性區(qū)間，將該樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度帶入汞離子與費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比.若該發(fā)光強(qiáng)度與汞離子濃度的對(duì)應(yīng)值在0.09 mg·L-1以上，則認(rèn)為毒性在Ⅲ級(jí)毒性區(qū)間；否則，在Ⅰ級(jí)毒性區(qū)間.此處，將0.09 mg·L-1作為判斷Ⅰ和Ⅲ區(qū)間的原因是，正如楊虹[7]所述，發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨汞離子濃度的增加而逐漸減弱，當(dāng)汞離子濃度大于等于0.09時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度趨近于0，此濃度范圍以上已經(jīng)超過(guò)了生物法檢測(cè)的范圍，生物已經(jīng)失活.在本文的模型中，金屬離子綜合濃度在200 mg·L-1濃度范圍時(shí)，發(fā)光細(xì)菌尚未失活，但發(fā)光強(qiáng)度在逐漸減弱.因此，將0.09 mg·L-1作為判斷離子濃度在Ⅰ還是Ⅲ區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn).

此外，毒性區(qū)間Ⅱ區(qū)的這個(gè)“拐點(diǎn)”，在理論上是難以通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法找出的，這與菌種對(duì)生物毒性的敏感度有關(guān)；再者，對(duì)于并非單因素水平實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合毒性受限于實(shí)驗(yàn)菌種的生物敏感性和各因素水平變化幅度的精確性，在實(shí)驗(yàn)水平上只能無(wú)限逼近這個(gè)拐點(diǎn)而很難找到拐點(diǎn)的具體數(shù)值.當(dāng)然，“拐點(diǎn)”可以通過(guò)進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)縮小，得到更為精確的區(qū)間范圍.

在現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15441-1995《水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法》中，所用發(fā)光細(xì)菌為明亮桿菌，所測(cè)發(fā)光值對(duì)應(yīng)的Hg2+濃度為土壤污染標(biāo)準(zhǔn).相比費(fèi)氏弧菌而言，明亮桿菌較喜低溫環(huán)境，發(fā)光最適溫度在18 ℃[15]；而費(fèi)氏弧菌的發(fā)光最適溫度在25 ℃[16]，更加方便在室溫條件下進(jìn)行操作.此外，土壤的成分復(fù)雜，其中可能包括多種金屬氧化物或金屬化合物，它們之間往往存在著復(fù)雜的聯(lián)合毒性作用[17].本研究模型采用的是Pb2+，Ni2+，Cu2+等3種重金屬離子三因素三水平聯(lián)合毒性，相比于單因素或兩因素單水平的毒性探究而言更加復(fù)雜，也能夠更好地模擬土壤重金屬生物毒性的復(fù)雜性.

本研究通過(guò)費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與重金屬離子的綜合含量的關(guān)系，將不同重金屬的含量范圍定義為不同的毒性區(qū)間，建立了一個(gè)可以對(duì)土壤重金屬綜合含量進(jìn)行定量的數(shù)學(xué)模型.此模型可以表示土壤中重金屬離子的綜合含量，同時(shí)也能表征土壤中重金屬離子的聯(lián)合毒性，可為后續(xù)的研究發(fā)展提供了新思路.