改變血清三酰甘油測定方法的可行性研究

郝世奇 徐翠玲 張柳 王閩楠 劉繼勇

血清三酰甘油是3分子長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，為所有脂蛋白中的三酰甘油總和，常作為臨床上一項(xiàng)重要的血脂常規(guī)測定指標(biāo)。同時(shí)血漿三酰甘油升高可作為冠心病的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。尤為重要的是當(dāng)三酰甘油>11.3 mmol/L時(shí)，患者罹患急性胰腺炎的危險(xiǎn)性極大增加[2]。目前對于超出線性范圍的三酰甘油檢測標(biāo)本，均采用稀釋復(fù)查的方法進(jìn)行檢測，但通過改變檢測測定時(shí)間點(diǎn)，擴(kuò)大三酰甘油的線性范圍，提高三酰甘油測定的準(zhǔn)確性的研究筆者所見極少。本研究通過改進(jìn)三酰甘油在AU-5800生化儀上時(shí)間監(jiān)測點(diǎn)，擴(kuò)大測定的線性范圍，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，避免稀釋產(chǎn)生的偶然誤差，為患者能夠獲得及時(shí)、準(zhǔn)確的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2018年6～8月門診和住院就診患者脂類測定空腹肘部靜脈血的血清三酰甘油檢測標(biāo)本45例(其中超出線性范圍標(biāo)本12例，未超出線性范圍標(biāo)本33例)，原參數(shù)設(shè)定測定點(diǎn)的檢測結(jié)果作為對照組，參數(shù)測定點(diǎn)設(shè)定為0～1 min、0～2 min、0～3 min、0～4 min的45例標(biāo)本的各測定點(diǎn)的檢測結(jié)果作為試驗(yàn)組，分別為1、2、3、4試驗(yàn)組。

1.2 方法 45例檢測標(biāo)本均來源于來我院就診的門診和住院患者檢測血脂項(xiàng)目時(shí)采集的空腹肘靜脈血。以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離獲取血清，并在-70℃條件下保存，且開展三酰甘油檢測。檢測主要儀器及試劑：(1)采用美國BEKMAN COULTER AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測；(2)試劑采用上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的三酰甘油試劑盒(甘油磷酸氧化酶法)進(jìn)行檢測。并在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)開始前先進(jìn)行質(zhì)控檢測，所用質(zhì)控為伯樂實(shí)驗(yàn)有限公司生產(chǎn)的生化多項(xiàng)質(zhì)控物，水平2(批號：26421)、水平3(批號：26422)2個(gè)濃度水平，所有質(zhì)控結(jié)果在控。

2 結(jié)果

2.1 5組三酰甘油測量結(jié)果比較 采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，組間平方和=25.326，均方=6.322；組內(nèi)平方和=12430.717，均方=56.503，F(xiàn)=0.112，P=0.978，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組三酰甘油測量結(jié)果

2.2 試驗(yàn)組與對照組間三酰甘油測量結(jié)果比較 Dunnett-t(雙側(cè))檢驗(yàn)結(jié)果比較，將對照組作為控制組，4組試驗(yàn)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。比較無顯著性差異2組間進(jìn)一步比較均值標(biāo)準(zhǔn)差。見表2。

表2 試驗(yàn)組與對照組組間三酰甘油測量結(jié)果比較Dunnet-t(雙側(cè))

2.2.1 從表2數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)1組(0～1 min)、試驗(yàn)2組(0～2 min)、試驗(yàn)3組(0～3 min)、試驗(yàn)4組(0～4 min)兩點(diǎn)終點(diǎn)法所得顯著性水平分別為0.934、0.984、1.000、1.000，顯著性水平越高，說明試驗(yàn)組與對照組差異越小，所以試驗(yàn)組3組和4組顯著性水平優(yōu)于其他2組；試驗(yàn)1組(0～1 min)、試驗(yàn)2組(0～2 min)、試驗(yàn)3組(0～3 min)、試驗(yàn)4組(0～4 min)兩點(diǎn)終點(diǎn)法所得均值標(biāo)準(zhǔn)差分別為-0.96330、-0.65800、0.04111、-0.1966，均值標(biāo)準(zhǔn)差越小，說明試驗(yàn)組與對照組越接近，所以試驗(yàn)3組明顯優(yōu)于其他3組。經(jīng)過Dunnett-t檢驗(yàn)分析，選取試驗(yàn)3組(0～3 min)為最佳測定終點(diǎn)，將三酰甘油的測定終點(diǎn)提前到3 min，所得到的檢測結(jié)果與稀釋標(biāo)本所得到的結(jié)果無顯著性差異，即為三酰甘油的檢測結(jié)果。

2.2.2 對更改后的試驗(yàn)方法進(jìn)行線性范圍測定，選取一個(gè)低濃度和一個(gè)超出正常檢測范圍的高濃度標(biāo)本，按照4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，五種配比方式混勻，上機(jī)進(jìn)行檢測，測量到通過更改試驗(yàn)終點(diǎn)可將三酰甘油的檢測范圍擴(kuò)大到22 mmol/L。較之前方法極大提高了標(biāo)本的檢測范圍，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

2.2.3 原參數(shù)設(shè)定測定超出線性范圍標(biāo)本三酰甘油反應(yīng)曲線圖及標(biāo)本稀釋后測量反應(yīng)曲線分析，在超出線性范圍標(biāo)本測量的反應(yīng)曲線中可以觀察到在測量點(diǎn)16點(diǎn)時(shí)反應(yīng)曲線出現(xiàn)下降現(xiàn)象，儀器測定對于超出檢測范圍的標(biāo)本反應(yīng)曲線終點(diǎn)OD值遠(yuǎn)低于樣本真實(shí)結(jié)果，儀器所檢測出的結(jié)果為11.2 mmol/L。將超出線性范圍標(biāo)本進(jìn)行3倍稀釋，稀釋后檢測反應(yīng)曲線圖顯示，反應(yīng)曲線上升后呈平緩曲線，符合線性范圍內(nèi)測量反應(yīng)曲線模式，稀釋后儀器所檢測出的結(jié)果為21.8 mmol/L。見圖1、2。

圖1 超出線性范圍標(biāo)本三酰甘油測量反應(yīng)曲線圖

2.2.4 參數(shù)設(shè)定將三酰甘油的測定終點(diǎn)提前到3 min時(shí)(試驗(yàn)3組)的反應(yīng)曲線圖分析，從儀器監(jiān)測反應(yīng)曲線圖顯示，反應(yīng)曲線上升后呈平緩曲線，符合線性范圍內(nèi)測量反應(yīng)曲線模式，儀器所檢測出的結(jié)果為21.3 mmol/L。見圖3。

圖2 超線性范圍標(biāo)本稀釋3倍三酰甘油測量反應(yīng)曲線圖

圖3 試驗(yàn)3組三酰甘油測量反應(yīng)曲線圖

2.2.5 相關(guān)性 對照組與4組試驗(yàn)組均高度相關(guān)，4組試驗(yàn)組與對照組見回歸方程依次為Y1=1.200X-0.4259(r=0.9702)；Y2=1.142X-0.3379(r=0.9962)；Y3=0.9843X-0.1118(r=0.9993)；Y4=1.0249X-0.1339(r=0.9993)。

3 討論

兩點(diǎn)終點(diǎn)法是取反應(yīng)尚未開始時(shí)讀取一個(gè)點(diǎn)的吸光度，待反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)再取第二點(diǎn)的吸光度。用第二點(diǎn)吸光度減去第一點(diǎn)吸光度的差值來計(jì)算結(jié)果，主要用于扣除試劑和樣品空白，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般用于雙試劑。 在AU5800生化全自動(dòng)生化分析儀的終點(diǎn)檢測法兩點(diǎn)檢測(自身空白對照方法)中是用于要求空白調(diào)零的終點(diǎn)檢測法。應(yīng)減去加注試劑2之前的OD值以作為空白管。從加入試劑2之后所測得的數(shù)值中減去空白管的OD值以得到不受血清的濁度和顏色影響的數(shù)據(jù)。此法的OD值如下所示：K2=[R1.V/(R1.V+R2.V+S.V)];K3=[(R1.V+S.V)/(R1.V+R2.V+S.V)];反應(yīng)物OD值=(Px-K2×P0)-(K3×Pz-K2×P0)，計(jì)算結(jié)果即為反應(yīng)物OD值。三酰甘油反應(yīng)原理基于Trinder反應(yīng)，在以往研究報(bào)道中，兩點(diǎn)終點(diǎn)法優(yōu)于一點(diǎn)終點(diǎn)法的檢測[3,4]。本試驗(yàn)研究中，則依據(jù)此原理進(jìn)行測定點(diǎn)的參數(shù)設(shè)定，通過Dunnett-t(雙側(cè))檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性綜合分析，試驗(yàn)選取測定點(diǎn)0～3 min時(shí)的最佳參數(shù)設(shè)定點(diǎn)。

高三酰甘油血癥是引起相關(guān)性急性胰腺炎的常見病因，重癥患者可發(fā)生多器官功能衰竭甚至死亡[5-8]。急性胰腺炎是多種病因?qū)е碌囊认俳M織自身消化引起的胰腺水腫、出血及壞死等炎性損傷，有研究表明高三酰甘油血癥患者有12%～38%發(fā)生急性胰腺炎[9]。高三酰甘油血癥相關(guān)性急性胰腺炎由Klatskin于1952年首次報(bào)道，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，該病具有病情進(jìn)展快、并發(fā)癥多、復(fù)發(fā)率高、病死率高等特點(diǎn)[10,11]。高三酰甘油血癥相關(guān)性急性胰腺炎目前在臨床上比較常見，有資料顯示，其發(fā)病率約占急性胰腺炎的10%[12,13]，是臨床醫(yī)生不容忽視的一類疾病。因此及時(shí)檢測血脂變化對高三酰甘油血癥相關(guān)性急性胰腺炎具有重要的臨床意義。

同時(shí)，血液血脂水平是臨床密切關(guān)注的心腦血管疾病監(jiān)測指標(biāo)之一。心腦血管疾病是指若干種危險(xiǎn)因素所導(dǎo)致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病。盡管在實(shí)施生活方式改變和預(yù)防藥物治療方面取得了進(jìn)展，但心腦血管疾病仍然是威脅人類健康并導(dǎo)致死亡的主要原因之一[14]。而血脂異常是冠心病眾多危險(xiǎn)因素中的重要因素之一。研究證實(shí)冠心病的危險(xiǎn)因素主要包括高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低與總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高[15]。研究顯示，餐后血脂可全面反映糖尿病患者的血脂狀況、對其心血管風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測具有重要價(jià)值[16]。由此可見，血清三酰甘油與臨床一些急危重疾病密切相關(guān)，血清三酰甘油檢驗(yàn)結(jié)果快速準(zhǔn)確的發(fā)送，對相關(guān)疾病的治療和預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。

我院血清三酰甘油檢測儀器為AU-5800全自動(dòng)生化分析儀，檢測試劑為上?？迫A三酰甘油試劑盒，三酰甘油試劑盒的線性檢測范圍為0～11.3 mmol/L，檢測方法為終點(diǎn)法。通過對于超出線性范圍的血清三酰甘油標(biāo)本的反應(yīng)監(jiān)測曲線分析發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)在未到達(dá)終點(diǎn)時(shí)反應(yīng)曲線已經(jīng)出現(xiàn)開始下落的現(xiàn)象，這一點(diǎn)在本試驗(yàn)研究中已有證實(shí)。原因是由于全自動(dòng)生化分析儀的反應(yīng)杯口徑通常較小，反應(yīng)體系與空氣接觸面積小，所以氧氣向反應(yīng)體系中擴(kuò)散的速度慢，反應(yīng)體系中三酰甘油濃度過高時(shí)，溶解氧被耗盡，反應(yīng)近于停止，醌亞胺具有氧化性，導(dǎo)致醌亞胺濃度下降，反應(yīng)曲線表現(xiàn)出異常降支，測定結(jié)果出現(xiàn)“倒鉤”現(xiàn)象[17]。本研究AU5800全自動(dòng)生化分析儀所用比色杯是由光程長度為5 mm的光學(xué)玻璃制成的，最大反應(yīng)體積為287 μl，由于三酰甘油測定試劑用量少，比色杯口徑小，導(dǎo)致濃度過高的三酰甘油標(biāo)本更易出現(xiàn)“倒鉤”現(xiàn)象。因此實(shí)際結(jié)果已超線性范圍的標(biāo)本的測定結(jié)果明顯要低于標(biāo)本真實(shí)結(jié)果，超出線性范圍的檢測結(jié)果如被疏忽發(fā)出，必定造成假陰性的結(jié)果，延誤患者診療。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)“倒鉤”現(xiàn)象存在于大多數(shù)氧化酶法測定實(shí)驗(yàn)比如葡萄糖測定(葡萄糖氧化酶法)等中，一旦檢測標(biāo)本真實(shí)結(jié)果超出檢測上限，都會(huì)發(fā)生“倒鉤”現(xiàn)象，對于其他氧化酶法測定是否也能像本實(shí)驗(yàn)一樣通過調(diào)節(jié)測定終點(diǎn)來擴(kuò)大檢測范圍，還有待研究，需要通過進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析去證實(shí)。

對于超出線性范圍的三酰甘油標(biāo)本，可以通過手工稀釋標(biāo)本或者在AU5800上設(shè)置自動(dòng)復(fù)查參數(shù)來實(shí)現(xiàn)，但是這將會(huì)使儀器整體測定速度下降，也會(huì)增加檢測次數(shù)。本研究將三酰甘油終點(diǎn)法改為兩點(diǎn)終點(diǎn)法，本質(zhì)是通過改變系統(tǒng)測定參數(shù)，將三酰甘油測定終點(diǎn)提前，既快速準(zhǔn)確的得出結(jié)果，又?jǐn)U大三酰甘油測定的線性范圍。避免了手工稀釋造成的偶然誤差又減少了自動(dòng)復(fù)查的次數(shù)，同時(shí)對于極高濃度的標(biāo)本也不會(huì)被當(dāng)成假陰性結(jié)果發(fā)出，對患者造成誤診。在保證試驗(yàn)正確度的前提下，既加快檢驗(yàn)速度，又節(jié)約資源。對于>22 mmol/L的極高濃度的標(biāo)本，仍需手工稀釋或儀器自動(dòng)復(fù)查得出結(jié)果。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)類似三酰甘油、血糖等應(yīng)用氧化酶法測定的項(xiàng)目，對于真實(shí)濃度水平超出線性檢測范圍的檢測數(shù)據(jù)很容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，在我們?nèi)粘９ぷ髦袠O易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，因此對于此類項(xiàng)目發(fā)放結(jié)果時(shí)，應(yīng)多結(jié)合反應(yīng)曲線進(jìn)行綜合分析，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果的而導(dǎo)致漏檢問題。