短期培養(yǎng)下抑制劑烯丙基硫脲對(duì)土壤硝化作用及微生物的影響*

沈曉憶，夏圍圍?，次仁拉姆，李乙坤

短期培養(yǎng)下抑制劑烯丙基硫脲對(duì)土壤硝化作用及微生物的影響*

沈曉憶，夏圍圍?，次仁拉姆，李乙坤

（南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院/江蘇省農(nóng)業(yè)氣象重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210044）

硝化抑制劑烯丙基硫脲（ATU）對(duì)土壤硝化作用及溫室效應(yīng)的影響及機(jī)理尚不清楚。采集典型旱地土壤，進(jìn)行21 d室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)，探究氮肥與不同劑量ATU（分別為氮素用量的1%、5%、10%、15%和20%）配施對(duì)土壤硝化作用及N2O和CO2排放通量的影響，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序16S rRNA基因技術(shù)監(jiān)測(cè)硝化微生物群落變化，同時(shí)與傳統(tǒng)硝化抑制劑雙氰胺（DCD）進(jìn)行保氮減排效果的對(duì)比。結(jié)果表明，與未施加氮肥的對(duì)照（CK）相比，單施氮肥（N）顯著提高土壤硝化強(qiáng)度并促進(jìn)N2O排放。DCD能顯著抑制硝態(tài)氮和N2O的積累，抑制效率分別為68.6%和93.3%。而低濃度ATU對(duì)土壤硝化作用無(wú)影響，僅在高濃度具有抑制效應(yīng)，且抑制效率最高僅為14.7%。所有ATU處理N2O排放量均顯著降低，降幅為60.3%～68.2%，仍遠(yuǎn)高于DCD處理。處理間N2O和CO2的綜合溫室效應(yīng)強(qiáng)弱順序?yàn)镹>ATU+N>DCD+N≈CK，不同ATU施用量處理之間差異不顯著。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)氨氧化細(xì)菌（AOB），而不是氨氧化古菌（AOA）和全程氨氧化細(xì)菌（Comammox），與土壤硝態(tài)氮積累和N2O排放顯著正相關(guān)，與土壤pH顯著負(fù)相關(guān)。高通量測(cè)序結(jié)果表明類型AOB對(duì)氮肥誘導(dǎo)的硝化過(guò)程起主導(dǎo)作用。此外，ATU和DCD還能顯著提高，并降低、、、和等微生物屬在群落中的相對(duì)豐度。該研究為深化土壤碳氮循環(huán)理論，合理使用硝化抑制劑以及減緩溫室氣體排放提供科學(xué)依據(jù)。

烯丙基硫脲（ATU）；雙氰胺（DCD）；硝化作用；N2O；土壤微生物

POD數(shù)據(jù)后處理應(yīng)用程序包由數(shù)據(jù)輸入模塊、POD數(shù)據(jù)處理核心模塊和數(shù)據(jù)輸出模塊等3個(gè)功能模塊組成(見(jiàn)圖1)。

硝化作用由氨氧化微生物和亞硝酸鹽氧化微生物（NOB）共同催化完成。由于氨氧化是硝化作用第一步且是限速步驟，因此，氨氧化微生物成為全球氮循環(huán)的研究熱點(diǎn)。氨氧化微生物主要包括氨氧化古菌（AOA）、細(xì)菌（AOB）和新發(fā)現(xiàn)的全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）[3]。土壤中 AOA數(shù)量通常高于AOB[4]。然而，AOA和AOB生理活性受土壤pH、氮的來(lái)源和濃度等環(huán)境因素的影響。其中，AOA傾向于貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境生長(zhǎng)，在酸性土壤中主導(dǎo)硝化過(guò)程[5]，而AOB則更加適應(yīng)銨態(tài)氮濃度較高的環(huán)境，如中性-堿性土壤[6]。Comammox可以進(jìn)行一步硝化，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)分步硝化理論。已培養(yǎng)的Comammox具有貧營(yíng)養(yǎng)生活方式[7]，但最近Li等[8]發(fā)現(xiàn)Comammox在施用氮肥的農(nóng)田土壤中也具有硝化活性，表明Comammox在氮循環(huán)中的生態(tài)作用仍需深入評(píng)估。

設(shè)計(jì)思維是一種新型思維方式，在問(wèn)題學(xué)生教育轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用尚處于起步階段。我們?cè)趹?yīng)用設(shè)計(jì)思維教育轉(zhuǎn)化問(wèn)題學(xué)生時(shí)，最好先從典型案例出發(fā)，以便充分體會(huì)設(shè)計(jì)思維在教育轉(zhuǎn)化問(wèn)題學(xué)生方面的精妙之處。

硝化抑制劑主要通過(guò)影響氨單加氧酶AMO活性、抑制硝化細(xì)菌呼吸、改變土壤微域環(huán)境或影響土壤氮礦化和固持過(guò)程等方式，抑制硝化作用[9]。硝化抑制劑與氮肥配施已被證明是一項(xiàng)現(xiàn)實(shí)有效的保氮減排措施。其中，雙氰胺（DCD）的應(yīng)用最為廣泛，在較多田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著抑制硝酸鹽積累，并降低N2O排放的效果[10]。烯丙基硫脲（ATU）在眾多液體培養(yǎng)基和污泥反應(yīng)器研究中顯示出優(yōu)越的抑制細(xì)菌硝化的性能[11]，表明其在調(diào)控AOB主導(dǎo)的土壤硝化過(guò)程中具有應(yīng)用潛力。一些研究表明ATU可以顯著抑制土壤AOB生長(zhǎng)和硝酸鹽積累[12-13]，也有研究表明ATU不能有效抑制土壤硝化作用[14]，以上結(jié)果差異可能與ATU施用量和土壤類型有關(guān)。張苗苗等[9]還指出ATU可能存在一定化學(xué)毒性不宜推廣，但可能引發(fā)何種生態(tài)效應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。因此，系統(tǒng)探究ATU在土壤中的有效抑制濃度和微生物機(jī)理，有利于明確ATU施用的生態(tài)環(huán)境后果。

在0、7、14、21 d分別采集培養(yǎng)瓶上部氣體，用氣相色譜儀（Agilent7890）分別對(duì)CO2、N2O和CH4的濃度進(jìn)行檢測(cè)。采完氣后，將培養(yǎng)瓶橡膠塞打開，更新瓶?jī)?nèi)空氣，再塞緊橡膠塞，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每種氣體的累積排放量以其周排放量之和表示。經(jīng)檢測(cè)，CH4排放量低于檢測(cè)限，故僅以圖表展示CO2和N2O動(dòng)態(tài)排放情況。

培養(yǎng)21 d后，土壤AOB群落組成在處理間存在明顯差異（圖4a），而AOA和NOB群落組成在處理間較為相似（圖4b，圖4c）。高通量測(cè)序結(jié)果顯示屬在AOB群落中占主導(dǎo)地位（>93%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于屬AOB。在分類種水平可將屬AOB分為四個(gè)類型，其中，CK處理AOB群落中，unclassified占比最大，其次為。類AOB在氮肥刺激下快速生長(zhǎng)，但受到DCD強(qiáng)烈抑制，表明類AOB主導(dǎo)土壤硝化作用和高水平N2O的產(chǎn)生。ATU對(duì)sp. Nsp65類AOB抑制作用隨ATU用量增加而增強(qiáng)，可能與N2O排放的降低有關(guān)。AOA共檢測(cè)到5個(gè)屬，但各處理土壤AOA群落組成基本保持一致，其中，unclassified所占比例最大（86%～90%），其次為（10%～14%）。NOB群落共檢測(cè)到兩個(gè)屬，其中的生長(zhǎng)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（97%～99%）。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

培養(yǎng)設(shè)8個(gè)處理：（1）CK處理：以等體積去離子水代替其他底物加入土壤；（2）N處理：氮肥選用硫酸銨，以N 200mg·g–1施入土壤，其他施氮處理的氮肥形式和用量與此相同；（3）1-ATU+N處理：ATU用量為施氮量的1%，按2mg·g–1施入土壤；（4）5-ATU+N處理：ATU用量為施氮量的5%，按10mg·g–1施入土壤；（5）10-ATU+N處理：ATU用量為施氮量的10%，按20mg·g–1施入土壤；（6）15-ATU+N處理：ATU用量為施氮量的15%，按30mg·g–1施入土壤；（7）20-ATU+N處理：ATU用量為施氮量的20%，按40mg·g–1施入土壤；（8）10-DCD+N處理：DCD用量為施氮量的10%，按20mg·g–1施入土壤。

1.2 微宇宙培養(yǎng)

土壤取自安徽省巢湖市欄桿集鎮(zhèn)（117°50′E，31°59′N），土壤類型為黃棕壤，種植作物為玉米，采集于2019年10月玉米收獲后。采用五點(diǎn)交叉法進(jìn)行采樣，用土鉆采集耕層0～20 cm土壤混合組成代表土樣。將土樣去除石塊、植物殘?bào)w，過(guò)2 mm篩并混合均勻，4℃保存待用。土壤基本理化性質(zhì)為：pH（H2O）5.99；硝態(tài)氮9.20 mg·kg–1；銨態(tài)氮1.18 mg·kg–1；全碳7.41 g·kg–1；全氮0.75 g·kg–1；碳氮比9.92；含水量5.88%；最大持水量（SWHC）61.5%。

具體實(shí)驗(yàn)操作[15]如下：稱取5.29 g新鮮土壤（相當(dāng)于5.0 g干土），均勻平鋪于120 mL玻璃培養(yǎng)瓶瓶底，用微量注射器逐滴均勻向土壤中加入滅菌去離子水，調(diào)節(jié)土壤水分至最大持水量40%，用橡膠塞密封，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光預(yù)培養(yǎng)3 d，以恢復(fù)土壤微生物活性。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶取出，打開橡膠塞，更新培養(yǎng)瓶上部空氣，用微量注射器逐滴均勻向土壤加入對(duì)應(yīng)底物，使土壤水分達(dá)最大持水量60%，塞緊橡膠塞，重新置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)21 d。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 溫室氣體CO2、N2O和CH4的排放動(dòng)態(tài)

本研究以DCD為參考，采用室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)法，評(píng)價(jià)ATU施用量對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化及N2O和CO2排放的影響，進(jìn)一步結(jié)合分子生物學(xué)手段，明確不同土壤微生物類型對(duì)ATU的響應(yīng)機(jī)制。該研究將加深碳氮循環(huán)微生物機(jī)理的理解，為指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和緩解氣候變化提供理論依據(jù)。

N2O的增溫潛勢(shì)是100年時(shí)間尺度上單位質(zhì)量CO2的298倍。由CO2和N2O的累積排放量，可計(jì)算綜合溫室效應(yīng)（Global warming potentials，GWP），公式如下：

1.4 土壤無(wú)機(jī)氮與pH測(cè)定

在7、14、21 d進(jìn)行破壞性采樣。從每個(gè)培養(yǎng)瓶中各取1.5 g土壤置于無(wú)菌離心管，保存于–20℃，以備后續(xù)分子生物學(xué)分析。再取出1.5 g于10 mL離心管中，以1︰5（w/v）加入1 mol·L–1KCl溶液，充分震蕩并靜置30 min，用玻璃電極測(cè)定土壤pH[16]；剩余土壤（約3.8 g）以1︰5（w/v）加入2 mol·L–1KCl溶液，以200 r·min–1振蕩60 min，過(guò)濾后將濾液經(jīng)流動(dòng)分析儀（Skalar，Inc.，Breda，Netherlands）測(cè)定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。

1.5 土壤微生物DNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)

利用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）試劑盒提取土壤微生物總DNA，并溶解于100 μL無(wú)菌水。通過(guò)Nano Drop?ND-2000微量紫外分光光度計(jì)，測(cè)定土壤總DNA濃度和純度，確保大部分DNA樣品OD260/OD280值在1.8～2.0之間以保證DNA質(zhì)量。最后將DNA稀釋10倍后，保存于–20℃。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和反應(yīng)條件，見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10 μL的TB Green? Premix Ex Taq? II（Takara），上、下游引物（20 μmol·L–1）各1.0 μL，1.0 μL稀釋10倍的DNA模板，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至20 μL。采用無(wú)菌水代替DNA作為嚴(yán)格的陰性對(duì)照。定量PCR反應(yīng)在CFX96 Optical Real-Time Detection System（Bio-Rad）上進(jìn)行。獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，通過(guò)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物和反應(yīng)條件

1.6 高通量測(cè)序16S rRNA基因分析土壤微生物群落

由上海派森諾生物科技股份有限公司（Shanghai Personal Biotechnology Co.，Ltd）對(duì)土壤樣品中微生物16S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增（引物515F/907R）和建庫(kù)，最后在Illumina NovaSeq PE250測(cè)序系統(tǒng)上進(jìn)行雙端測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)先根據(jù)barcode信息進(jìn)行樣本劃分，去除barcode序列。再通過(guò)FLASH[17]軟件進(jìn)行雙端合并（-m 15 -M 300 -x 0.2 -p 33 -t 6）。最后利用QIIME2[18]流程進(jìn)行ASV（100%相似度聚類）分析，主要步驟為：使用dada2 denoise-single插件[19]進(jìn)行質(zhì)控和特征序列ASV提?。?-p-trim-left 0 --p-trunc-len 350），獲取ASVs豐度表；再將ASVs用classify-consensus-blast插件，按照默認(rèn)參數(shù)[20]，以silva138數(shù)據(jù)庫(kù)[21]為參考進(jìn)行物種注釋。最后，在各分類水平統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成和各分類單元的相對(duì)豐度。相對(duì)豐度，以各樣本中每個(gè)分類單元的ASV序列除以總序列條數(shù)的值表示。所測(cè)序列已提交至NCBI SRA（Sequence Read Archive），序列號(hào)PRJNA699396。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)培養(yǎng)21 d后土壤整體微生物群落組成進(jìn)行分析可知，不同處理AOB的16S rRNA基因相對(duì)豐度與其基因豐度的變化趨勢(shì)較為一致（圖3e）。N處理AOB相對(duì)豐度增加到0.179%，是CK處理4.34倍。與N處理相比，高濃度ATU（20-ATU+N）顯著抑制了AOB的增加，AOB相對(duì)豐度僅為N處理的0.53倍。10-DCD+N處理AOB相對(duì)豐度與CK處理無(wú)顯著差異，進(jìn)一步證明DCD能夠通過(guò)抑制AOB生長(zhǎng)而較大程度抑制硝化作用。N處理對(duì)AOA相對(duì)豐度的影響不顯著（圖3f）。相比于單施氮肥，中等濃度ATU（5-ATU+N、10-ATU+N 和15-ATU+N）和DCD與氮肥配施使AOA相對(duì)豐度有所提高，但彼此之間無(wú)顯著差異。氮肥及與硝化抑制劑配施處理均檢測(cè)到大量NOB生長(zhǎng)（圖3g），NOB相對(duì)豐度（0.840%～1.061%）均顯著高于CK處理（0.454%）。

2 結(jié) 果

2.1 土壤無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化強(qiáng)度

2.2 N2O和CO2通量變化及綜合溫室效應(yīng)

N2O和CO2累積排放量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但處理間存在明顯差異（圖2）。N2O的排放情況，如圖2a所示。在21 d培養(yǎng)期內(nèi)，CK處理N2O累積排放量最低，僅為0.04 μg·g–1。而單獨(dú)施氮（N處理）強(qiáng)烈刺激了N2O排放，N2O累積排放量在所有處理中最高，達(dá)3.15 μg·g–1，較CK處理提高87.6倍。ATU與N配施顯著抑制了N2O排放，但不同ATU用量間差異不顯著。ATU+N處理中N2O累積排放量較N處理降低了60.3%～68.2%。與ATU+N相比，10-DCD+N處理對(duì)N2O抑制作用更為強(qiáng)烈，N2O累積排放量?jī)H為N處理的6.7%。各處理CO2累積排放量（圖2b）均高于N2O，是N2O的118.7倍以上。培養(yǎng)21 d后，1-ATU+N與5-ATU+N處理CO2累積排放量顯著低于N處理，其他施氮處理間無(wú)顯著差異。

而“特征感知”包含“機(jī)構(gòu)實(shí)力”“師資力量”“項(xiàng)目質(zhì)量”這三個(gè)概念范疇。之所以將其概括為“特征感知”，是因?yàn)樗鼈兎从车亩际莻€(gè)體對(duì)再就業(yè)培訓(xùn)項(xiàng)目及相關(guān)要素（如，培訓(xùn)機(jī)構(gòu)及師資）的特征感知。基于這些感知，可獲得對(duì)“項(xiàng)目質(zhì)量”“機(jī)構(gòu)實(shí)力”“師資力量”的評(píng)價(jià)信息。

各處理產(chǎn)生的綜合溫室效應(yīng)（GWP），如表2所示，總體而言，N>ATU+N>10-DCD+N≈CK，且不同ATU施用量差異不顯著。N處理產(chǎn)生的綜合溫室效應(yīng)最高，約為1 314.4 μg·g–1（以CO2當(dāng)量計(jì)），較CK處理增加227.9%，而ATU+N處理GWP較CK處理增加53.4%～81.9%。CK處理CO2排放對(duì)總GWP的貢獻(xiàn)高達(dá)97.3%。單獨(dú)施N促進(jìn)N2O的排放，使N2O對(duì)GWP的貢獻(xiàn)由2. 7%上升至71.5%。硝化抑制劑ATU降低了N2O的排放，從而使N2O對(duì)GWP的貢獻(xiàn)下降到48.6%～55.5%，DCD使N2O的貢獻(xiàn)降至更低水平（13.8%）。

表2 培養(yǎng)期間CO2和N2O的累積排放量和溫室效應(yīng)

2.3 土壤硝化微生物數(shù)量

通過(guò)熒光定量PCR評(píng)估了土壤不同微生物類群對(duì)氮肥及硝化抑制劑的響應(yīng)。研究表明土壤總體微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)約為（3.65～5.10）×109g–1，在施氮處理間變化不顯著（圖3a）。但是，AOB、AOA以及Comammox這三類硝化微生物對(duì)不同處理的響應(yīng)規(guī)律不同（圖3b-圖3d）。單施氮肥促進(jìn)AOB生長(zhǎng)，培養(yǎng)21 d后AOB基因達(dá)到3.59×108g–1，是CK處理1.60倍。DCD+N能夠顯著抑制AOB增長(zhǎng)，與CK相比無(wú)顯著變化。ATU對(duì)AOB的影響表現(xiàn)為：低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。1-ATU+N處理中AOB基因數(shù)量最多（3.88×108g–1），是N處理1.08倍，20-ATU+N處理AOB基因最低（2.56×108g–1），僅為N處理的0.71倍。ATU+N對(duì)AOA和Comammox特征基因的拷貝數(shù)無(wú)顯著影響。而DCD+N顯著刺激了AOA和Comammox生長(zhǎng)，其基因拷貝數(shù)分別為2.56×108g–1和3.45×108g–1，是N處理的1.58倍和1.22倍。

采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析檢驗(yàn)同一時(shí)刻不同處理樣品間的差異顯著性（<0.05）。采用雙尾檢驗(yàn)分析土壤微生物指標(biāo)與溫室氣體排放量以及土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。

天色接近黃昏時(shí)，太陽(yáng)收了通紅的光線，我和堂妹仍然歡天喜地地走出去，公園門外站著父親，一邊說(shuō)：“怎么出來(lái)得這么遲？”一邊笑著邀我們?nèi)コ酝聿?。我們都覺(jué)得疲倦，于是父親便帶我們回奶奶家看電視，新聞?lì)l道過(guò)后的節(jié)目《西游記》確是一番刺激不過(guò)，我們都盼著呢。

DCD和ATU均能通過(guò)抑制硝化，減緩?fù)寥浪峄?。與CK相比，N處理顯著降低了土壤pH，在14和21 d分別降低0.41和0.63。ATU和DCD在14和21 d土壤pH則均顯著高于N處理。10-DCD+N處理在14和21 d土壤pH與CK處理無(wú)顯著差異。

化學(xué)類實(shí)驗(yàn)室包括無(wú)機(jī)化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)、分析化學(xué)、藥物化學(xué)、藥物分析、天然藥物化學(xué)、中藥分析、生物化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室，其中有機(jī)試劑、有毒有害有腐蝕性物品、易燃易爆物品等是安全環(huán)保防控點(diǎn)。

2.4 土壤硝化微生物群落組成

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)用大黃魚購(gòu)自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，于4.0 m×4.0 m×4.0 m的海水網(wǎng)箱中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期投喂對(duì)照組飼料。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前，所有大黃魚饑餓24 h，使用1∶10 000稀釋的丁香酚麻醉。選取規(guī)格一致的大黃魚，稱重并隨機(jī)分配到9個(gè)2.0 m×2.0 m×2.5 m的網(wǎng)箱中，每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)50尾。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間，每天飽食投喂兩次（6:00和18:00），養(yǎng)殖周期9周，水溫18～28 ℃，鹽度28～32 g/l，溶氧6.2～8.3 mg/l。

表3 土壤硝化微生物的豐度與溫室氣體N2O、CO2累計(jì)排放量以及土壤理化性質(zhì)的相關(guān)分析

注：雙尾顯著性檢驗(yàn)，=24；*，<0.05：**，<0.01：***，<0.001。Note：’stwo-tailedtest，=24：*，<0.05：**，<0.01：***，<0.001.

2.5 其他類型土壤微生物

高通量測(cè)序結(jié)果的生物信息分析顯示，在分類屬水平，特定微生物在處理間存在顯著差異。如圖5所示，N與CK處理相比、20-ATU+N與N處理相比、以及10-DCD+N與N處理相比，分別存在22個(gè)、25個(gè)以及27個(gè)顯著改變的微生物屬。其中，除AOB屬外，在三組比較中存在6個(gè)共有微生物屬發(fā)生顯著改變，分別為、、、、和。單獨(dú)施N促進(jìn)前5個(gè)屬微生物相對(duì)豐度顯著增加，其中和增加最多。同時(shí)單獨(dú)施N還對(duì)產(chǎn)生了一定抑制，其相對(duì)豐度低于CK。ATU和DCD與N配施對(duì)這6個(gè)屬微生物的影響趨勢(shì)與N處理相反，且和降幅最大，一定程度上緩解了施N引起的微生物變化。此外，單獨(dú)施N顯著刺激了生長(zhǎng)，而ATU和DCD均未對(duì)其產(chǎn)生明顯作用；ATU最大程度促進(jìn)了的增加，而DCD對(duì)MND1有最強(qiáng)的刺激作用。

3 討 論

AOA和AOB對(duì)ATU的響應(yīng)并不一致。多數(shù)AOB菌株對(duì)ATU敏感，小于100 μmol·L–1ATU即對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制[23]。而AOA對(duì)ATU敏感范圍較廣，100 μmol·L–1ATU能夠完全抑制一些嗜酸類AOA，但中性類AOA則需要在更高ATU濃度（>500 μmol·L–1）才有較強(qiáng)抑制[23-24]。本研究設(shè)置了一系列ATU與氮肥的施用配比，發(fā)現(xiàn)20% ATU（40 μg·g–1）與氮肥配施對(duì)土壤硝化作用的抑制最強(qiáng)，此時(shí)土壤溶液中ATU濃度約為500 μmol·L–1，顯著抑制了AOB生長(zhǎng)并改變了AOB群落結(jié)構(gòu)。sp.Nsp65類AOB在群落中的占比明顯下降，表明其對(duì)ATU較為敏感，與幾株代表性AOB菌株的動(dòng)力學(xué)特征較為相似[23，25]，而類 AOB在群落中的占比增加，表明其具有較強(qiáng)ATU耐受能力，與上述類型有所不同，表明AOB群落具有較高的生理多樣性。主導(dǎo)供試土壤AOA群落的中性類和unclassfiedAOA未受明顯影響，表明其對(duì)ATU耐受能力較強(qiáng)，與先前研究較為一致[23]。

ATU在土壤中的施用效果差異較大。如Li等[12]發(fā)現(xiàn)14% ATU（14 μg·g–1）在草地土壤中顯著降低了AOB和Comammox的數(shù)量，但在中性農(nóng)田土壤中卻明顯刺激了Comammox的生長(zhǎng)。另一些農(nóng)田或草地土壤中觀測(cè)到100 μmol·L–1ATU降低了AOB的生長(zhǎng)活性[26-27]，但在冰島草地土壤中相同濃度ATU似乎未對(duì)AOB和AOA生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[14]。由此可見(jiàn)，硝化微生物對(duì)ATU的響應(yīng)規(guī)律因土壤類型而異。硝化微生物群落組成差異、微生物的相互作用以及土壤本身的高度異質(zhì)性等因素，都可能使土壤硝化微生物對(duì)ATU的響應(yīng)機(jī)制更加復(fù)雜。

Comammox對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的貢獻(xiàn)正在重新評(píng)估。已培養(yǎng)的Comammox代表菌株的僅為63 nmol·L–1[7]。供試黃棕壤原位NH3濃度與該值較為接近，并檢測(cè)到了豐富的Comammox基因，證明該土壤在無(wú)外源氮輸入情況下能夠?yàn)镃omammox生長(zhǎng)提供適宜底物條件。而施入氮肥后土壤游離NH3的濃度高于220 nmol·L–1，不利于Comammox生長(zhǎng)，同時(shí)Comammox基因拷貝數(shù)與土壤無(wú)相關(guān)關(guān)系（>0.05），表明Comammox在氮肥誘導(dǎo)的土壤硝化作用中貢獻(xiàn)較小[26]。但最近Li等[8]發(fā)現(xiàn)Comammox能夠在施氮農(nóng)田土壤中硝化并同化13CO2生長(zhǎng)，表明NH3濃度不是決定Comammox生態(tài)功能的唯一因素。相關(guān)研究已證實(shí)ComammoxClade A分支與濃度呈正相關(guān)，而Clade B分支則與土壤pH負(fù)相關(guān)[28]。可見(jiàn)土壤Comammox群落組成直接影響其在不同土壤硝化過(guò)程中的重要性。

近年來(lái)腫瘤免疫治療一直備受關(guān)注。本屆大會(huì)日本近畿大學(xué)Kudo等 （摘要LB-2）報(bào)告，在CheckMate-040研究中Child-Pugh B級(jí)晚期HCC患者應(yīng)用NIVO單抗治療可獲得持久應(yīng)答，安全性情況與Child-Pugh A級(jí)患者相似，中位生存時(shí)間為7.6個(gè)月。

從風(fēng)電齒輪箱涂裝生產(chǎn)線物質(zhì)代謝過(guò)程物質(zhì)輸入看，水、清洗劑和油漆輸入構(gòu)成的物質(zhì)投入量表征了研究系統(tǒng)的物質(zhì)消耗強(qiáng)度，當(dāng)年物質(zhì)輸入總量為2 770.4 t，每生產(chǎn)1臺(tái)風(fēng)電齒輪箱需投入0.9 t物料，新鮮水（含生產(chǎn)蒸汽）的物質(zhì)投入量占總投入的97.2%，清潔劑及油漆的物質(zhì)投入量占總投入的2.8%。

本研究施用DCD處理中Comammox和AOA基因顯著增加，表明硝化群落中部分氨氧化菌對(duì)DCD不敏感，生長(zhǎng)活性不受DCD抑制，具有區(qū)別于典型氨氧化菌的生理特點(diǎn)。Palomo等[29]已經(jīng)證實(shí)ComammoxClade B可能通過(guò)非氨氧化途徑產(chǎn)能，并還原三羧酸循環(huán)進(jìn)行CO2固定，為其適應(yīng)更多生境提供了能量代謝基礎(chǔ)。未來(lái)在純培養(yǎng)體系中展開硝化菌株生理代謝和基因水平研究，可以為揭示復(fù)雜環(huán)境中硝化微生物生態(tài)功能多樣性提供理論依據(jù)。

此外，ATU和DCD可以促進(jìn)多種有益微生物或植物促生菌（PGPR）的生長(zhǎng)。例如，ATU處理中屬和DCD處理中屬均顯著提高，可以固氮或促進(jìn)植物根系氮吸收[30-31]，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。ATU和DCD還刺激了屬的生長(zhǎng)，而已知屬多個(gè)代表菌株均具有固氮結(jié)瘤潛力[32]。DCD處理中屬也顯著增加，而其能夠改變植物激素水平，解除根系生長(zhǎng)抑制[33]。具有降解有機(jī)物能力的微生物屬也在施入抑制劑后迅速增加，如，等。此外，硫脲類化合物具有一定殺菌作用，本研究發(fā)現(xiàn)ATU對(duì)16個(gè)微生物屬有顯著抑制作用（圖5），其中，降幅最大的兩個(gè)屬（和）均屬于放線菌門。DCD也具有相似的抑菌效果。鑒于目前對(duì)更低分類水平上的微生物功能劃分未有準(zhǔn)確認(rèn)知，它們對(duì)土壤生態(tài)功能的影響以及對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

單施氮素提高了土壤硝化強(qiáng)度和N2O排放，導(dǎo)致土壤pH下降。低濃度烯丙基硫脲對(duì)硝化作用的抑制不明顯，隨烯丙基硫脲濃度提高，抑制效果增強(qiáng)。與烯丙基硫脲相比，雙氰胺能更大程度抑制土壤硝化作用和N2O排放。屬AOB是黃棕壤農(nóng)田土壤硝化過(guò)程的主要驅(qū)動(dòng)者，而AOA和NOB群落對(duì)施肥措施無(wú)明顯響應(yīng)。除硝化微生物外，一些特定微生物屬對(duì)ATU和DCD產(chǎn)生相似響應(yīng)規(guī)律。

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Effect of Allylthiourea on Soil Nitrification and the Underlying Microbial Mechanism in Short-term Laboratory Microcosms

SHEN Xiaoyi, XIA Weiwei?, Cirenlamu, LI Yikun

(Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Meteorology, College of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China)

【Objective】Allylthiourea (ATU) is a promising nitrification inhibitor. However, its effects on soil nitrification and greenhouse gas (GHG) mitigation are still unclear.【Method】In this study, a 21-day microcosm incubation was established with the application of nitrogen (N) and different doses of ATU (1%, 5%, 10%, 15% and 20% of N applied) to a yellow-brown upland soil. Also, dicyandiamide (DCD, 10% of N applied)was applied to compare the inhibition efficiency on nitrification and GHG emission with ATU. The dynamics of inorganic nitrogen and N2O/CO2emission during the incubation were detected, and changes in the different microbial population were analyzed by real-time PCR and 16S rRNA gene-based high through-put sequencing.【Result】N application greatly stimulated soil nitrification activity and promoted N2O emission. DCD had a strong inhibitory effect on soil nitrification (68.6%) and N2O emission (93.3%). ATU did not influence soil nitrification at low doses (<5%), but inhibited the nitrate accumulation at high doses (>10%) with the highest inhibition efficiency of 14.7%. All treatments with ATU decreased N2O emission by 60.3%～68.2% but was still much higher than when DCD was applied. In general, the global warming potential (GWP) of N2O and CO2were the highest in N treatment and seconded by ATU+N treatment. There were no significant differences in GWP between DCD+N and CK treatment, or among different doses of ATU with N treatments. The quantitative real-time PCR ofgenes suggested that ammonia-oxidizing bacteria (AOB) rather than ammonia-oxidizing archaea (AOA) and complete ammonia-oxidizing bacteria (Comammox), had a positive relationship with soil nitrate accumulation and N2O emission, but a negative correlation with pH.Microbial community analysis by high through-put sequencing revealed-like AOB dominated in soil nitrification process which was greatly stimulated by nitrogen. Besides, ATU and DCD significantly increased the relative abundance ofbut reduced the relative abundance of,,,and【Conclusion】This study reveals the exact mechanisms of ATU on soil microbial guilds and GHG emission and plays an important role in the future implementation of agricultural management strategies and the evaluation of global climate change.

Allylthiourea (ATU); Dicyandiamide (DCD); Nitrification: N2O; Soil microorganism

X171；S154.3

A

10.11766/trxb202101080015

沈曉憶，夏圍圍，次仁拉姆，李乙坤.短期培養(yǎng)下抑制劑烯丙基硫脲對(duì)土壤硝化作用及微生物的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2021，58（6）：1552–1563.

SHEN Xiaoyi，XIA Weiwei，Cirenlamu，LI Yikun. Effect of Allylthiourea on Soil Nitrification and the Underlying Microbial Mechanism in Short-term Laboratory Microcosms[J]. Acta Pedologica Sinica，2021，58（6）：1552–1563.

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41501267）和土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（Y20160025）資助Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41501267）and the State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences（No. Y20160025）

Corresponding author，E-mail：wwxia@nuist.edu.cn

沈曉憶（2000—），女，江蘇蘇州人，主要從事農(nóng)田土壤硝化過(guò)程的調(diào)控機(jī)理研究。E-mail：shen_xiaoyi0721@163.com

2021–01–08；

2021–03–22；

2021–06–01

（責(zé)任編輯：盧 萍）