牛大力葉中總多糖、總黃酮、總皂苷含量及其抗氧化活性的研究

莫宏輝，鄧國(guó)衛(wèi)，李 珊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中和制藥有限公司，長(zhǎng)沙 410205）

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millet?tia speciosaChamp.），以根入藥，屬于藥食同源品種之一，具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)等功效，中醫(yī)臨床上常用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺虛咳嗽、慢性支氣管炎等［1］。據(jù)已有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，牛大力中存在多糖類、三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類、微量元素、氨基酸等多種不同類型成分［2，3］，具有提高免疫、抗疲勞、抗應(yīng)激、保肝、祛痰、止咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［4，5］。

牛大力葉是來(lái)源于美麗崖豆藤的葉子，全年可采收，目前有關(guān)牛大力葉的研究報(bào)道主要集中于專利方面，如“一種牛大力葉或/和花保健茶及其加工方法”“一種牛大力葉茶及其制備方法”等［6，7］，而對(duì)其化學(xué)成分、藥理活性、提取純化工藝等則未見報(bào)道。目前，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)已批準(zhǔn)牛大力作為新食品原料，但在促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時(shí)也引發(fā)了原材料價(jià)格上漲，如能對(duì)其葉子資源進(jìn)行開發(fā)利用，將有望借鑒于枇杷葉、三七花、三七莖葉、白木香葉等作為地方特色食品成為新食品原料［8］。因此，本研究對(duì)牛大力葉中的總多糖、總黃酮、總皂苷等成分含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為其資源的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)，也進(jìn)一步填補(bǔ)相關(guān)研究的空白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（含量98%，CAS號(hào)：50-99-7，成都埃法生物科技有限公司）；蘆丁對(duì)照品（含量98 %，CAS 號(hào)：153-18-4，成都埃法生物科技有限公司）；人參皂苷Rb1 對(duì)照品（含量98%，CAS 號(hào)：41753-43-9，成都埃法生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、香草醛、水楊酸、冰醋酸、高氯酸、鄰苯三酚、苯酚、濃硫酸、鹽酸、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等均為分析純。

牛大力鮮葉由湖南中和制藥有限公司提供，批次分別為01、02、03，每批次2 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李珊副主任藥師鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia speciosaChamp.）的葉子。1.1.2 儀器 UV-1700 雙光束紫外分光光度計(jì)（日本島津）；BP-211D 電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；FreeZone2.5 冷凍干燥機(jī)（美國(guó)LABCONCO）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛大力葉提取物制備［9］將不同批次牛大力葉置于烘箱60 ℃烘干，粉碎成粗粉，準(zhǔn)確稱取100 g，第一次加入20倍量水，浸泡0.5 h，加熱回流提取2 h，提取液離心，取上清液；第二次加入15 倍量水，加熱回流提取2 h，提取液離心，取上清液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中75 ℃減壓濃縮至適宜濃度，真空冷凍干燥后粉碎過(guò)100 目篩，測(cè)得固形物得率分別為：01 批次，16.8%；02 批次，17.3%；03 批次，16.2%。

1.2.2 總多糖的含量測(cè)定［3，10］

1）溶液的配制。精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.25 mg 于100 mL 容量瓶中，加去離子水定容，配制102.5 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物50.13 mg 于100 mL 容量瓶中，加去離子水定容，配制501.3 μg/mL 的供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取102.5 μg/mL 的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到試管中，依次加入水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL，再分別加入5% 苯酚溶液1.0 mL 和濃硫酸溶液5.0 mL，80 ℃水浴20 min，取適量混合液于分光光度計(jì)中490 nm 處測(cè)定吸光值。以D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為X、吸光度值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程：Y=0.084 0X+0.031 7（R2=0.996 8），結(jié)果顯示，在2.56~12.81 μg/mL，吸光值具有良好的線性關(guān)系。

3）方法學(xué)考察。參考文獻(xiàn)［3］和［10］操作，測(cè)得精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為1.03%、0.82%、0.59%、1.06%，表明該方法及儀器均符合要求（回收率具體數(shù)據(jù)見表1）。

4）總多糖含量測(cè)定。按照以上試驗(yàn)操作步驟同法測(cè)定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光值，計(jì)算總多糖含量。

1.2.3 總黃酮的含量測(cè)定［3，11］

1）溶液的配制。精密稱取蘆丁對(duì)照品9.80 mg于10 mL 容量瓶中，加60% 乙醇定容，配制0.98 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物100.13 mg 于10 mL 容量瓶中，加60% 乙醇定容，配制10.013 mg/mL 的供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.98 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到試管中，各加入0.5 mL 的5% 亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加入0.5 mL 的5% 硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，然后加入4.0 mL 的4% 氫氧化鈉溶液，最后加入60% 乙醇定容至10 mL，靜置15 min，取適量混合液于分光光度計(jì)中510 nm 處測(cè)定吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為X、吸光值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=0.008 2X+0.020 5（R2=0.998 8），結(jié)果顯示，在19.60~98.0 μg/mL，吸光值具有良好的線性關(guān)系。

3）方法學(xué)考察。參考文獻(xiàn)［3］和［11］操作，測(cè)得精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為1.10%、2.41%、1.98%、1.03%，表明該方法及儀器均符合要求（回收率具體數(shù)據(jù)見表2）。

4）總黃酮含量測(cè)定。按照以上試驗(yàn)操作步驟同法測(cè)定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光度值，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.4 總皂苷的含量測(cè)定［3，12］

1）溶液的配制。精密稱取人參皂苷Rb1 對(duì)照品8.20 mg 于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制0.82 mg/mL 的對(duì)照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物150.24 mg 于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制15.024 mg/mL 的供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.82 mg/mL 的人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到試管中，水浴蒸干后加入0.2 mL 的5 %香草醛冰醋酸試液和0.8 mL 高氯酸，60 ℃水浴20 min，取出加入5.0 mL 冰醋酸，混勻后取適量混合液于分光光度計(jì)中540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以人參皂苷Rb1 質(zhì)量濃度為X、吸光值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=0.003 8X+0.160 4（R2＝0.999 1），結(jié)果顯示，在27.0~135.0 μg/mL，吸光值具有良好的線性關(guān)系。

3）方法學(xué)考察。參考文獻(xiàn)［3］和［12］操作，測(cè)得精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為0.67%、3.95%、4.27%、3.16%，表明該方法及儀器均符合要求（回收率具體數(shù)據(jù)見表3）。

4）總皂苷含量測(cè)定。按照以上試驗(yàn)操作步驟同法測(cè)定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光度值，計(jì)算總皂苷含量。

1.2.5 清除DPPH·能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)［13］，分別吸取2 mL 的01 批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液（5.0~30.0 mg/mL）、1.0 mL 0.35 mg/mL 的DPPH儲(chǔ)備液加入到試管中，反應(yīng)30 min 后取適量混合液于分光光度計(jì)中517 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)m；另吸取2 mL 水和1 mL 的DPPH 儲(chǔ)備液，同法反應(yīng)后測(cè)定吸光值A(chǔ)0；另吸取牛大力葉提取物溶液2 mL 和無(wú)水乙醇1.0 mL，同法反應(yīng)后測(cè)定吸光值A(chǔ)n。根據(jù)公式計(jì)算其清除率：

1.2.6 清除ABTS+·能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)［13］，按照體積比2∶1，分別吸取7 mmol/L 的ABTS 溶液和7.35 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液適量進(jìn)行混合，避光反應(yīng)16 h，再用水稀釋，取適量混合液于分光光度計(jì)中734 nm 處測(cè)定，調(diào)節(jié)至吸光值A(chǔ)0為0.70±0.2。再分別吸取01 批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液（1.0~10.0 mg/mL）2 mL 和ABTS 稀釋液4 mL 加入試管中，超聲30 s，靜置反應(yīng)8 min 后同法測(cè)定吸光值A(chǔ)1。根據(jù)公式計(jì)算其清除率：

1.2.7 清除·OH 能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)［13］，吸取01批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液（4.0~14.0 mg/mL）、6 mmol/L 的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液各2 mL 加入到試管中，反應(yīng)10 min 后加入6 mmol/L 的水楊酸溶液2 mL，反應(yīng)30 min，取適量混合液于分光光度計(jì)中510 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)1；以水代替水楊酸溶液，同法操作后測(cè)定吸光值A(chǔ)2；另外以純水作為空白對(duì)照，同法操作后測(cè)定吸光值A(chǔ)0。根據(jù)公式計(jì)算其清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3 種不同類型成分測(cè)定方法的加樣回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1（樣品取樣量為501.30 μg，樣品中多糖量為40.60 μg，加入對(duì)照品量為41.00 μg）、表2（樣品取樣量為10 013.00 μg，樣品中黃酮量為360.98 μg，加入對(duì)照品量為343.00 μg）和表3（樣品取樣量為15 024.00 μg，樣品中皂苷量為137.79 μg，加入對(duì)照品量為123.00 μg），結(jié)果均表明所用方法的準(zhǔn)確性良好，能夠有效進(jìn)行含量測(cè)定。

表1 牛大力葉提取物總多糖加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

表2 牛大力葉提取物總黃酮加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

表3 牛大力葉提取物總皂苷回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.2 不同類型成分含量的測(cè)定

由試驗(yàn)分別測(cè)得牛大力葉提取物中總多糖、總黃酮、總皂苷的含量依次為（1.36±0.05）% 、（0.61±0.007）%、（0.15±0.013）%，其中以總多糖含量最高、總皂苷含量最低，結(jié)果見表4。

表4 牛大力葉提取物中不同類型成分的含量（n=3）（單位：%）

2.3 體外抗氧化能力評(píng)價(jià)

由試驗(yàn)分別測(cè)得牛大力葉提取物對(duì)不同自由基清除能力變化趨勢(shì)的線性回歸方程及IC50，其中IC50由小到大依次為ABTS+·、O-2·、·OH、DPPH·，結(jié)果見表5、圖1。

表5 牛大力葉提取物對(duì)不同自由基的清除能力

圖1 不同濃度牛大力葉提取物對(duì)不同自由基的清除率

3 小結(jié)

試驗(yàn)通過(guò)水提法制備牛大力葉提取物，以化學(xué)顯色法及分光光度法測(cè)定不同類型成分的含量，發(fā)現(xiàn)其含量高低排序?yàn)榭偠嗵?總黃酮>總皂苷，這與其牛大力根所測(cè)得成分含量高低趨勢(shì)基本一致［3］，說(shuō)明同株植物不同部位的成分類型及含量高低具有一定的相似性。同時(shí)，體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛大力葉提取物對(duì)ABTS+·的抗氧化能力最強(qiáng)，而對(duì)DPPH·的清除能力則最弱。與已報(bào)道的相比，與黃精多糖等效果接近而比白芷多糖、合歡皮多糖、車前子多糖等更強(qiáng)［14］。

因此，可在此牛大力葉提取物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用醇沉、柱層析、有機(jī)溶劑萃取等方法進(jìn)行純化、分離、富集，以獲得成分純度和含量更高、抗氧化活性更強(qiáng)的物質(zhì)，為牛大力葉的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)依據(jù)。有關(guān)抗氧化作用強(qiáng)弱與不同類型成分間的相關(guān)性，將在進(jìn)一步的試驗(yàn)中展開研究。