懷玉山三葉青查爾酮合酶基因克隆和表達(dá)分析

洪森榮，劉佳，劉軍，劉依婷，陳榮華，蔡紅

（1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心/上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；3.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西 上饒 334700）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又名金絲吊葫蘆，葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬植物，是我國(guó)特有珍稀藥用植物，也是民間常用藥，主要分布在我國(guó)的浙、贛、湘、閩、粵、滇、桂、川等地區(qū)［1］。三葉青性寒味苦，具有祛風(fēng)化痰、活血散結(jié)、消炎止痛和清熱解毒等功效，以地下塊莖和果實(shí)的藥用效果最好［2］?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用表明，三葉青無毒、無副作用、無耐藥性，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎解熱、鎮(zhèn)痛保肝以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，被譽(yù)為“植物抗生素”［3］。

黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，不但能抗毒、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、清除活性氧、抵抗紫外輻射，還能抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、清除自由基［4］。查爾酮合酶（CHS）是黃酮類化合物生物合成過程中第一個(gè)限速酶和關(guān)鍵酶，主要催化丙二酰輔酶A和對(duì)羥基苯丙烯酰輔酶A縮合生成異黃酮、黃酮醇、黃烷酮和花青素等物質(zhì)的共同前體查爾酮，從而為合成黃酮類化合物提供基本碳鏈骨架［5］。查爾酮合酶對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的某些生理過程，如花色形成、根瘤形成、生物和非生物脅迫響應(yīng)、抵御紫外輻射傷害等，具有重要作用［6］。因此，克隆三葉青查爾酮合酶基因并進(jìn)行qRT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）分析，對(duì)研究查爾酮合酶基因在三葉青中的表達(dá)和三葉青黃酮類化合物的合成機(jī)理具有重要意義。

關(guān)于查爾酮合酶研究的報(bào)道較多，如韓穎穎等［7］對(duì)蝴蝶蘭查爾酮合酶基因cDNA進(jìn)行了克隆、鑒定和原核表達(dá)；謝修志等［8］對(duì)非洲菊查爾酮合酶基因進(jìn)行了克隆、序列分析，并在大腸桿菌中表達(dá)；譚曉風(fēng)等［9］對(duì)油茶查爾酮合酶和異構(gòu)酶基因進(jìn)行了cDNA克隆和序列分析；和鳳美和朱永平［10］構(gòu)建了東方百合“元帥”查爾酮合酶基因的表達(dá)載體；吳琦等［11］對(duì)苦蕎查爾酮合酶基因的結(jié)構(gòu)及花期不同組織表達(dá)量進(jìn)行了分析；伍翀等［12］研究了黃芩查爾酮合酶基因內(nèi)含子在轉(zhuǎn)基因煙草中對(duì)GUS活性的調(diào)控；汪結(jié)明等［13］對(duì)矮牽牛查爾酮合酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；李成磊等［14］對(duì)甜蕎查爾酮合酶基因進(jìn)行了克隆和序列分析；夏芳等［15］研究了水母雪蓮查爾酮合酶基因的克隆、表達(dá)和活性；汪孟曦等［16］克隆了白木香的查爾酮合酶基因AsCHS1，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；李星和王紅［17］對(duì)虎杖查爾酮合酶基因PcCHS1進(jìn)行了克隆與功能分析；劉姍等［18］克隆了金龍膽草查爾酮合酶基因并對(duì)其在花期不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析；王佳媛等［19］克隆了海南龍血樹查爾酮合酶基因DcCHS，并分析了其在花、根、莖、葉和果實(shí)中的表達(dá)量；齊宇和趙蘭勇［20］克隆了玫瑰查爾酮合酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；馬立功等［21］克隆了向日葵查爾酮合酶基因HaCHS，并對(duì)其逆境應(yīng)答進(jìn)行了研究；趙風(fēng)治等［22］克隆了花椰菜的查爾酮合酶基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了分析；孟衡玲等［23］克隆了鐵皮石斛查爾酮合酶基因，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了分析；孫威等［24］克隆了日本蛇根草查爾酮合酶基因，并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行了分析；潘德灼等［25］克隆了紅樹植物秋茄查爾酮合酶基因，并對(duì)其在鹽脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了分析；趙學(xué)榮等［26］克隆了苦蕎查爾酮合酶基因FtCHS1啟動(dòng)子，并對(duì)其在低溫（4℃）和光照（UV-B）處理下的表達(dá)進(jìn)行了分析；周姍等［27］克隆了烏拉爾甘草查爾酮合酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析；胡會(huì)剛［28］和徐僡［29］等分別對(duì)香蕉查爾酮合酶基因家族和金釵石斛的查爾酮合酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

目前，對(duì)三葉青的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理臨床、種植栽培、組織培養(yǎng)等方面［1，3］，關(guān)于三葉青查爾酮合酶方面的研究尚未見報(bào)道。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了懷玉山三葉青查爾酮合酶基因，并采用生物信息學(xué)方法和qRTPCR進(jìn)行序列分析和組織表達(dá)分析，可為揭示懷玉山三葉青查爾酮合酶的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平調(diào)控懷玉山三葉青黃酮醇成分代謝及體外催化合成黃酮醇提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

懷玉山三葉青2個(gè)栽培種‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑提取懷玉山三葉青‘懷玉2號(hào)’試管苗的總RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo（dT）18 Primer（5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3′），具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.2 查爾酮合酶基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN16981_c0_g3），運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（F：5′-ATGGCGGCCACCATGACCG-3′；R：5′-TCATGCGGTTGCCCCGGCGGT-3′）。PCR擴(kuò)增條件：95℃2 min；95℃30 s，62.8℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 查爾酮合酶基因的生物信息學(xué)分析 使用BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用ProtParam預(yù)測(cè)酶的理化性質(zhì)，用ProtScale預(yù)測(cè)酶的疏/親水性。使用GOR I軟件在線預(yù)測(cè)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用WoLFPsort在線預(yù)測(cè)基因的表達(dá)部位。通過軟件DNAMAN和Bioedit進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 查爾酮合酶基因的組織表達(dá)分析 分別取懷玉山三葉青2個(gè)栽培種‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR（SYBR Green I）檢測(cè)內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。設(shè)計(jì)引物F為5′-CACGAGTCCCACCTCGACTC-3′，R為5′-AGGGGACGCTCCACGGACA-3′，大小為104 bp，Tm為59.2。qRT-PCR檢測(cè)采用16μL反應(yīng)體系（SYBR Green Mix 7μL，Primer-F 0.5μL，Primer-R 0.5 μL，cDNA 8μL），PCR反應(yīng)程序：95℃10 min；95℃10 s，60℃34 s，95℃15 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)查爾酮合酶基因組織表達(dá)的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因cDNA序列

懷玉山三葉青查爾酮合酶基因cDNA總長(zhǎng)度為1 143 bp（圖1、圖2），G+C和A+T含量分別為65.27%和34.73%（圖3）。

圖1 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因PCR擴(kuò)增

圖2 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因堿基組成

圖3 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因各堿基的比例

2.2 懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列

懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列見圖4。懷玉山三葉青查爾酮合酶由380個(gè)氨基酸組成，分子量41 809.23 Da，等電點(diǎn)6.19，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例為Ala（A）37、9.7%，Arg（R）20、5.3%，Asn（N）9、2.4%，Asp（D）23、6.1%，Cys（C）7、1.8%、Gln（Q）12、3.2%，Glu（E）24、6.3%，Gly（G）30、7.9%，His（H）12、3.2%，Ile（I）18、4.7%，Leu（L）34、8.9%，Lys（K）22、5.8%，Met（M）17、4.5%，Phe（F）13、3.4%，Pro（P）17、4.5%，Ser（S）20、5.3%，Thr（T）20、5.3%，Trp（W）4、1.1%，Tyr（Y）9、2.4%，Val（V）32、8.4%。帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為47，帶正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為42。估計(jì)半衰期為30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外），＞20 h（酵母，體內(nèi)），＞10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）。失穩(wěn)指數(shù)（II）為40.92，因此將該蛋白分類為不穩(wěn)定蛋白。

圖4 懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列

2.3 懷玉山三葉青查爾酮合酶親疏水性分析

在圖5中，峰值（正值）區(qū)域表示疏水區(qū)域，而低谷區(qū)域（負(fù)值）是親水區(qū)域?？梢?，最大疏水值在2.25左右，說明該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰值最大為-2.50左右。該蛋白整體表現(xiàn)出高度的親水性，為親水蛋白。

圖5 懷玉山三葉青查爾酮合酶親疏水值分布

2.4 懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（Hh，37.37%）、β-片層（Ee，19.47%）、無規(guī)則卷曲（Cc，43.16%）構(gòu)成，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個(gè)蛋白中（圖7）。

圖6 懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖7 懷玉山三葉青查爾酮合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)各部分的分布

三級(jí)結(jié)構(gòu)是多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元素在三維空間排列形成的，SWISS-MODEL預(yù)測(cè)顯示懷玉山三葉青查爾酮合酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)為二聚體（圖8）。

圖8 懷玉山三葉青查爾酮合酶三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.5 懷玉山三葉青查爾酮合酶的亞細(xì)胞定位

對(duì)懷玉山三葉青查爾酮合酶基因表達(dá)部位的預(yù)測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，定位于細(xì)胞核中的數(shù)量為6，定位于線粒體中的數(shù)量為5，定位于細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量為2，定位于細(xì)胞外的數(shù)量為1。表明其主要存在于細(xì)胞核和線粒體中。

圖9 懷玉山三葉青查爾酮合酶亞細(xì)胞定位

2.6 懷玉山三葉青查爾酮合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

由構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖10）可見，懷玉山三葉青查爾酮合酶與硬粒小麥（Triticum turgidumsubsp.durum）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschiisubsp.tauschill）、小麥（Triticum aestivum）的查爾酮合酶在一個(gè)大分支下，說明他們之間親緣關(guān)系較近，尤其是與硬粒小麥未命名蛋白產(chǎn)物VAH38240.1親緣關(guān)系最近。

圖10 懷玉山三葉青查爾酮合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.7 懷玉山三葉青查爾酮合酶同源蛋白的序列比對(duì)信息

保守結(jié)構(gòu)域是指在生物進(jìn)化過程中不變或者一個(gè)蛋白家族中相同的結(jié)構(gòu)域，一般具有重要的功能，不能被改變。圖11中“※”號(hào)區(qū)域即為懷玉山三葉青查爾酮合酶蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，可見其同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域較為豐富。懷玉山三葉青在15到32位點(diǎn)氨基酸缺失，在其他位點(diǎn)與硬粒小麥（Triticum turgidumsubsp.durum）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschiisubsp.tauschill）、小麥（Triticum aestivum）完全一致，說明懷玉山三葉青查爾酮合酶與硬粒小麥、節(jié)節(jié)麥、小麥的查爾酮合酶同源性較高。

圖11 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因氨基酸序列的同源性比較

2.8 懷玉山三葉青2個(gè)栽培種不同器官中查爾酮合酶基因的表達(dá)分析

由圖12可見，懷玉山三葉青查爾酮合酶基因在‘懷玉1號(hào)’和‘懷玉2號(hào)’栽培種根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量在不同器官間差異顯著，其中，根中表達(dá)量最高，葉中最低。

圖12 懷玉山三葉青2個(gè)栽培種不同器官中 查爾酮合酶基因相對(duì)表達(dá)量分析

3 討論

三葉青地下塊根中的藥用成分主要有黃酮、多糖及多酚等［1］，其中，黃酮類物質(zhì)，如山奈酚蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮苷、兒茶素、紫云英苷等均具有藥理活性［3］。合成黃酮類化合物的關(guān)鍵酶之一是查爾酮合酶［5］。查爾酮合酶基因的突變、沉默或過表達(dá)會(huì)影響三葉青黃酮類物質(zhì)的合成，對(duì)其功能和產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響。因此，研究查爾酮合酶基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式，將有助于明確三葉青黃酮合成的分子機(jī)制，提高三葉青中黃酮含量。

本研究從懷玉山三葉青中克隆到查爾酮合酶全長(zhǎng)基因，cDNA總長(zhǎng)度為1 143 bp，G+C含量為65.27%；該基因編碼的蛋白質(zhì)具有查爾酮合酶家族保守存在的功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域，由380個(gè)氨基酸組成，分子量41 809.23 Da，等電點(diǎn)6.19，是一種親水性、不穩(wěn)定蛋白，與硬粒小麥（Triticum turgidumsubsp.durum）未命名蛋白產(chǎn)物VAH38240.1的親緣關(guān)系最近。研究表明，G+C的含量越高，基因穩(wěn)定性越高［7-29］。懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的G+C含量大于50%，推測(cè)其處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，有助于該基因在進(jìn)化過程中穩(wěn)定遺傳。此外，作為黃酮類化合物代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限制酶，懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的組織表達(dá)情況可能會(huì)對(duì)黃酮合成和累積造成影響，進(jìn)而影響三葉青藥材的品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，該基因在懷玉山三葉青2個(gè)栽培種的根、莖、葉中均有表達(dá)，但器官間存在顯著差異，均以根中的表達(dá)量最高，葉中最低。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究懷玉山三葉青查爾酮合酶的功能及表達(dá)調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

懷玉山三葉青查爾酮合酶具有查爾酮合酶典型的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列及核苷酸序列與同源物種相似度高，在進(jìn)化上高度保守，且懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的表達(dá)存在組織器官差異性，根中表達(dá)量最高。