基于量子點(diǎn)的電化學(xué)發(fā)光核酸分析傳感器研究進(jìn)展

張 甜， 龔金博， 楊錫東， Pier-Luc Tremblay

(1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.紹興市上虞區(qū)理工高等研究院，浙江紹興 312000；3.武漢理工大學(xué)三亞科教創(chuàng)新園，海南三亞 572024)

1 前言

人類維持正常的生命健康需要在特定的時空精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)約十萬個基因的活性[1]，這些基因以特定核苷酸序列的形式貯存于核酸(Nucleic Acid)內(nèi)，現(xiàn)代生命科學(xué)研究表明很多重大疾病都與基因突變密切相關(guān)。檢測與疾病相關(guān)的特定序列核酸對于疾病的早期診斷和治療具有十分重要的意義，核酸分析已然成為現(xiàn)代生物分析中最具潛力的領(lǐng)域之一。

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)是將電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的分析方法，既具有電化學(xué)分析可控性強(qiáng)、分析速度快等特性，又具有化學(xué)發(fā)光線性范圍寬、靈敏度高等優(yōu)勢[2]。隨著納米科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種形貌尺寸的納米材料相繼出現(xiàn)，其中量子點(diǎn)(Quantum Dots，QDs)以其良好的光穩(wěn)定性、高量子產(chǎn)率以及尺寸可控的優(yōu)良特性從眾多納米材料中脫穎而出[3]。自2002年發(fā)現(xiàn)Si QDs的ECL性質(zhì)以來[4]，基于QDs的ECL體系不斷被發(fā)掘，如石墨烯量子點(diǎn)(G QDs)、Si QDs、CdS QDs以及類石墨相氮化碳量子點(diǎn)(g-C3N4QDs)等在ECL分析領(lǐng)域中表現(xiàn)優(yōu)良的分析性能。QDs獨(dú)特的光電特性可與ECL分析的高靈敏度特性相結(jié)合，將QDs作為發(fā)光體材料并用作核酸分析探針的載體，構(gòu)建ECL生物傳感器用于核酸分析的研究正受到人們極大關(guān)注。

近年來，基于納米材料的ECL核酸分析傳感器層出不窮，Bertoncello[5]總結(jié)了2003年至2008年納米材料(碳納米管、金屬納米顆粒、量子點(diǎn)、金屬聚合物以及無機(jī)金屬絡(luò)合物)在ECL生物傳感器中的應(yīng)用。隨后，Rizwan等[6]展示了2014年至2017年新型納米材料(包括QDs)在ECL生物傳感器分析領(lǐng)域的巨大潛力。本文介紹了QDs及其性質(zhì)并對QDs進(jìn)行分類，著重論述基于QDs的ECL生物傳感器在核酸分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

2 電化學(xué)發(fā)光

2.1 電化學(xué)發(fā)光機(jī)理

ECL分析是通過電化學(xué)的方法在電極表面產(chǎn)生一些特殊的物質(zhì)，這些物質(zhì)之間或與其他組分物質(zhì)之間通過電子傳遞形成激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)物質(zhì)回到穩(wěn)定的基態(tài)時，伴隨著產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[7]。ECL以線性范圍寬、選擇性好、檢出限低等優(yōu)勢[8]，在藥物分析[9]、環(huán)境衛(wèi)生[10]、臨床醫(yī)學(xué)[11]以及食品安全[12]等領(lǐng)域得到非常廣泛的應(yīng)用。

2.2 電化學(xué)發(fā)光核酸分析傳感器概述

眾所周知，核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，基因是DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核酸序列的總稱，人類疾病都直接或間接與基因有關(guān)[15]。其中癌癥便是嚴(yán)重危害人體健康的重大疾病之一，幾乎所有的癌癥都是原癌基因的激活或抑癌基因的缺失所導(dǎo)致。據(jù)報道，大量癌組織中存在特定DNA堿基序列的突變，或者microRNA基因的缺失、遷移和擴(kuò)增[16]。例如p53基因[17]可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，它是目前發(fā)現(xiàn)最重要的抑癌基因之一。2002年，Pekarsky等[18]首次發(fā)現(xiàn)了與癌癥相關(guān)的miRNA，即miR-15/16-1，并且觀察到慢性淋巴細(xì)胞白血病患者體內(nèi)存在miR-15/16-1的缺失。ECL核酸分析傳感器通常是以探針DNA分子作為識別元件，將探針DNA特異性識別目標(biāo)核酸過程中產(chǎn)生的電信號轉(zhuǎn)化為光信號，通過對光信號的分析實現(xiàn)對目標(biāo)核酸檢測的傳感方法。ECL核酸分析傳感器利用高特異性的探針DNA作為識別元件，具有結(jié)構(gòu)簡單、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來，ECL分析技術(shù)發(fā)展迅猛，不斷涌現(xiàn)出各種基于QDs的超高靈敏度的ECL傳感器，并在核酸分析領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。通常，與疾病相關(guān)的核酸(ctDNA和microRNA等)在人體內(nèi)含量極低，很難對其進(jìn)行檢測。因此，構(gòu)建高靈敏的ECL核酸分析傳感器，對于人類重大疾病的早期診斷與預(yù)后有著重要意義。

3 量子點(diǎn)

3.1 量子點(diǎn)分類

QDs又稱為半導(dǎo)體納米晶，是一種具有優(yōu)良性能的新型納米材料，主要由Ⅱ-Ⅵ族和Ⅲ-Ⅴ族元素構(gòu)成，其直徑一般為2～20 nm[19]。QDs以其特殊的尺寸效應(yīng)以及獨(dú)特的光電性能，廣泛應(yīng)用于光電器件和生物分析等領(lǐng)域[20]。量子限域效應(yīng)賦予了QDs獨(dú)特的光電特性[21]。

QDs按照其組成可分為四種類型:單質(zhì)QDs、二元QDs、摻雜型復(fù)合QDs和核殼型QDs。單質(zhì)QDs，主要由Ⅳ族元素組成，如碳、硅元素等組成。G QDs和Si QDs作為新型的納米材料，不僅具有優(yōu)良的發(fā)光性能和小尺寸效應(yīng)，而且相比于傳統(tǒng)QDs具有低毒性、良好的生物相容性、表面易于修飾性的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于傳感器領(lǐng)域。二元QDs主要Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族和Ⅳ-Ⅵ族元素組成，主要分為含Cd型QDs和氮基型QDs，如CdS QDs、CdSe QDs、ZnS QDs、BN QDs、CN QDs等。其中，含Cd型QDs研究最為廣泛，不僅具有高熒光產(chǎn)率，而且穩(wěn)定性也比較好。然而傳統(tǒng)的含Cd型QDs因其自身的毒性限制了它進(jìn)一步生物分析應(yīng)用，于是類似氮化碳這類生物兼容性好、無毒性或低毒性的非金屬Q(mào)Ds應(yīng)運(yùn)而生。不僅如此，CN QDs和BN QDs等非常易于進(jìn)行表面修飾，可以有效地改善其光電性能[24]。摻雜型復(fù)合QDs通過在QDs晶格內(nèi)部引入微量的過渡金屬離子或非金屬元素，形成具有新的優(yōu)異性能的摻雜型復(fù)合QDs。在摻雜元素的選擇上，通常采用摻雜N元素、C元素、S元素、Mn元素和Zn元素等方式來改善QDs的結(jié)構(gòu)，從而獲得某些獨(dú)特的光電性質(zhì)。如ZnS QDs摻雜Mn[25]和G QDs摻雜B[26]等。摻雜型復(fù)合QDs可獲得特定發(fā)光波長[27]。核殼型QDs最初研究的是只有核結(jié)構(gòu)的含Cd型QDs，這類QDs的表面通常會存在大量缺陷，這些表面缺陷會成為非輻射復(fù)合中心，嚴(yán)重影響它的量子產(chǎn)率。通?？梢酝ㄟ^在QDs核層外覆蓋一層晶格結(jié)構(gòu)相似、帶隙更大的半導(dǎo)體材料進(jìn)而大大降低其表面缺陷[28 - 30]。相比于僅有核結(jié)構(gòu)的QDs，殼層半導(dǎo)體材料可以有效減少核層QDs的表面缺陷，從而提高它的穩(wěn)定性和熒光效率。

3.2 量子點(diǎn)合成及表面修飾

QDs的合成方法主要有電化學(xué)沉積法[31]、液相沉積法[32]、氣相沉積法[33]、溶劑熱法[34]和膠體化學(xué)法[35]。在眾多方法中，膠體化學(xué)法是制備QDs最常用的方法，其合成QDs表面易于進(jìn)行化學(xué)修飾[36]。通?？梢詫⒍喾N有機(jī)、無機(jī)或生物材料，通過一系列反應(yīng)修飾到QDs表面。通常用于生物分析的QDs需要具備良好的水溶性和生物相容性，常采用巰基偶聯(lián)修飾法和兩親性分子修飾法[37]，使其表面偶聯(lián)大量巰基，進(jìn)而有效的改善它的水溶性。兩親性分子修飾法是將兩親性分子的親脂端與QDs表面的的三辛基氧化膦(TOPO)連接，聚乙二醇(PEG)是最常用的兩親性分子。

4 量子點(diǎn)在電化學(xué)發(fā)光核酸傳感器的應(yīng)用

4.1 單質(zhì)量子點(diǎn)

4.1.1 G QDs近年來，G QDs因具有良好的生物相容性，穩(wěn)定的發(fā)光特性和優(yōu)良的溶解度在生物傳感領(lǐng)域內(nèi)備受關(guān)注。Lu等[38]合成了15.5%的光致發(fā)光(PL)量子產(chǎn)率的G QDs，并用于監(jiān)測DNA損傷。工作中以Au納米顆粒(Au NPs)與單鏈DNA探針(cp53-ssDNA)連接形成Au NPs-ssDNA。由于G QDs 和Au NPs之間可以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(ECL-RET)，即Au NPs-ssDNA與G QDs的結(jié)合以猝滅G QDs的ECL信號。當(dāng)Au NPs-ssDNA與目標(biāo)cp53-DNA雜交形成Au NPs-dsDNA時，G QDs 和dsDNA之間的相互作用減弱，G QDs的ECL信號會恢復(fù)。從而成功構(gòu)建了基于G QDs的ECL-RET生物傳感器用于檢測DNA損傷，方法線性范圍為25～400 nmol/L，檢出限為13 nmol/L。

DNA多循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)正受到廣泛關(guān)注，并且逐漸應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器。Jie等[39]將G QDs優(yōu)良的電化學(xué)發(fā)光性能與多循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，提出了一種用于DNA擴(kuò)增電化學(xué)發(fā)光檢測的新策略，以Au NPs為猝滅劑并結(jié)合核酸內(nèi)切酶輔助的循環(huán)擴(kuò)增策略，成功構(gòu)建了一種基于DNA多循環(huán)擴(kuò)增ECL生物傳感器。另外，Lou等[40]以G QDs為ECL發(fā)光體材料，基于BamHI核酸內(nèi)切酶的特異性位點(diǎn)，制備了一種雙齒螯合新型二硫代氨基甲酸酯DNA探針(DTC-DNA)，形成的DTC-DNA通過S-Au-S鍵直接附著在Au表面。所制備的ECL生物傳感器在5 pmol/L至100 pmol/L線性范圍內(nèi)實現(xiàn)了對丙型肝炎病毒1b基因(HCV-1b cDNA)靈敏地檢測，檢出限低至0.45 fmol/L。

4.1.2 Si QDs2002年，Bard等[4]合成了Si QDs并首次研究了其在有機(jī)相中的ECL，但由于合成方面的限制，Si納米材料并不如碳材料應(yīng)用廣泛。隨著量子點(diǎn)合成技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)了各種水相Si QDs[41]，使其在生物醫(yī)學(xué)研究方面具有廣泛的應(yīng)用前景。Dong等[42]首次研究了基于Si QDs的ECL生物傳感器，制備了具有良好水分散性Si QDs，利用Si QDs為ECL能量供體，Au NPs為能量受體，建立了ECL-RET體系，并以K2S2O8為共反應(yīng)劑，在磷酸鹽緩沖液中獲得穩(wěn)定且強(qiáng)烈的陰極ECL信號。Au NPs連接在發(fā)夾DNA的末端以形成信號探針，起初Au NPs與Si QDs之間的距離較近會產(chǎn)生ECL-RET現(xiàn)象，從而導(dǎo)致ECL信號明顯降低。當(dāng)目標(biāo)DNA與發(fā)夾DNA特異性結(jié)合時，使得Au NPs與Si QDs之間的距離大幅增加，此時阻止了ECL-RET過程，Si QDs得以恢復(fù)ECL信號。實驗結(jié)果表明，目標(biāo)DNA濃度在0.1 fmol/L至1.0 pmol/L范圍內(nèi)，ECL信號呈現(xiàn)線性變化，檢測限達(dá)到0.016 fmol/L。

4.2 含鎘型量子點(diǎn)

4.2.1 CdS QDsCdS是一種典型的Ⅱ-Ⅳ族半導(dǎo)體化合物，具有優(yōu)異的光電轉(zhuǎn)換特性和發(fā)光性能，因而廣泛應(yīng)用于電化學(xué)分析領(lǐng)域。Zhang等[43]提出了一種新穎的雙電位ECL比率型量度傳感方法，該方法以CdS QDs和魯米諾作為兩種不同ECL發(fā)光體材料，Pt NPs作為猝滅劑，通過將mp53癌基因互補(bǔ)的包含20個堿基的分子信標(biāo)(MB)固定在CdS QDs/GCE上。然后利用Pt NPs上標(biāo)記的MB和mp53致癌基因之間的DNA雜交過程將Pt NPs固定在CdS QDs表面上。在電勢掃描中CdS QDs的ECL信號會降低，同時魯米諾的ECL信號會增強(qiáng)，從而構(gòu)建了一種新的雙電勢ECL比率型傳感器用于檢測mp53癌基因。該生物傳感器可以在5.0 fmol/L至1 000.0 fmol/L范圍內(nèi)靈敏地檢測mp53-DNA，檢出限為1.7 fmol/L。

microRNA[44]是近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，參與調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡等重要生物過程，研究發(fā)現(xiàn)microRNA-21在腫瘤的發(fā)展過程中均出現(xiàn)明顯上升趨勢。Li等[45]基于局部表面等離振子共振(LSPR)增強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光機(jī)制，以CdS QDs作為ECL發(fā)光體材料，并利用直徑為15 nm的Au納米二聚體(GNP)誘導(dǎo)CdS QDs發(fā)生猝滅，同時在等離子體耦合誘導(dǎo)和大電磁場影響下，CdS QDs的ECL強(qiáng)度增強(qiáng)約6.3倍。在最佳實驗條件下，制備了一種LSPR-ECL傳感器用于microRNA-21的檢測，方法線性范圍從10 fmol/L到20 fmol/L，檢出限為3.6 fmol/L。

4.2.2 CdTe QDsCdTe QDs具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和表面易修飾性，已被廣泛用作電化學(xué)發(fā)光分析。Chen等[46]基于CdTe QDs和Au NPs之間ECL-RET效應(yīng)，制備了一種ECL生物傳感器用于檢測乳腺癌生物標(biāo)志物20-mer microRNA。該傳感器在microRNA濃度為0.1 fmol/L至0.2 pmol/L具有線性響應(yīng)，檢出限低至33 amol/L。另外，Liu等[47]基于多色CdTe QDs和Au NPs構(gòu)建新型多重ECL的DNA傳感器，用于檢測乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。分別將HBV固定到CdTe QDs(551)，HCV固定到CdTe QDs(607)。然后引入不同濃度的目標(biāo)DNA-HBV和DNA-HCV與互補(bǔ)的CdTe QDs-capture DNA雜交。再將Au NPs-probe DNA-HBV和Au NPs-probe DNA-HCV修飾到玻碳電極上。通過觀察Au NPs-probe DNA/target DNA/CdTe QDs-capture DNA/GNs/GCE復(fù)合膜的ECL信號強(qiáng)度，可以實現(xiàn)目標(biāo)DNA-HBV和DNA-HCV的測定。在最佳條件下，CdTe QDs(551)和CdTe QDs(607)的ECL強(qiáng)度與目標(biāo)DNA(HBV)和DNA(HCV)的濃度在0.0005 nmol/L至0.5000 nmol/L，以及0.001 nmol/L至1.000 nmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限分別為0.082 pmol/L和0.340 pmol/L。該ECL的DNA傳感器用于測定人血清樣品中的目標(biāo)DNA(HBV)和DNA(HCV)，其結(jié)果表現(xiàn)較為滿意。

4.2.3 CdSe QDsCdSe QDs的可調(diào)節(jié)發(fā)射波長和寬吸收光譜使其成為ECL-RET的優(yōu)異活性供體或受體材料。最近，Jie等[48]首次報道了以CdSe QDs為ECL發(fā)光體材料，葉酸為猝滅劑，并結(jié)合循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，制備了ECL-RET生物傳感器用于目標(biāo)DNA檢測。實驗顯示，該傳感器ECL信號變化與目標(biāo)DNA濃度在0.05 nmol/L至1 000.00 nmol/L范圍呈線性關(guān)系，檢出限為0.05 nmol/L。另外，超歧化的三維聚酰胺基(PAMAM)樹狀聚合物由于末端基團(tuán)眾多，并且具有高度化的對稱結(jié)構(gòu)以及三維納米尺寸使其具備特殊的物理化學(xué)性質(zhì)。因此，PAMAM被廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物領(lǐng)域。Tan等[49]設(shè)計了一種獨(dú)特的酶輔助多重擴(kuò)增式ECL生物傳感器，利用CdSe QDs作為ECL信號探針，合成了具有良好生物相容性和導(dǎo)電性的新型聚合物Au NPs-PAMAM材料用于負(fù)載大量CdSe QDs。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時，可以激活酶輔助的聚合鏈置換循環(huán)反應(yīng)，同時打開大量的發(fā)夾(HP)DNA模板。隨后，被打開的HP-DNA莖部進(jìn)一步與電極上的capture-HP-DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，并且Au NPs-PAMAM-CdSe QDs與HP-DNA的莖部雜交，以觸發(fā)第二個聚合反應(yīng)。因此，大量的CdSe QDs可以組裝到電極上，產(chǎn)生擴(kuò)增ECL信號，用于檢測目標(biāo)DNA。ECL信號隨著目標(biāo)DNA濃度增加而逐漸增加，線性范圍為10.0 pmol/L至1 000.0 nmol/L，檢出限為3.5 pmol/L。

4.3 氮基型量子點(diǎn)

4.3.1 類石墨相氮化碳量子點(diǎn)類石墨相氮化碳量子點(diǎn)(g-C3N4QDs)是一種新型半導(dǎo)體材料，由C和N組成，它與石墨烯具有類似的結(jié)構(gòu)，但性質(zhì)卻大不相同。最近，基于C基的的QDs已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域[50]，但是由于C和G QDs的量子產(chǎn)率較低，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。g-C3N4QDs由于其特殊的晶體結(jié)構(gòu)，具有良好的水分散性、高的熒光量子產(chǎn)率和強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光活性[51]。不僅如此，相比于傳統(tǒng)的含Cd型量子點(diǎn)，g-C3N4QDs的生物毒性低并且更加綠色環(huán)保。Wang等[52]以g-C3N4為發(fā)光體材料，K2S2O8為共反應(yīng)劑，制備了一種高靈敏度的ECL生物傳感器用于目標(biāo)DNA(T-DNA)的檢測。該傳感器的ECL強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度的對數(shù)在0.04 fmol/L至50 pmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限低至0.018 fmol/L。隨后，Liu等[53]使用K2S2O8為共反應(yīng)劑，在磷酸鹽緩沖溶液中觀察到g-C3N4QDs發(fā)射強(qiáng)烈的ECL信號。以g-C3N4QDs為供體，Au NPs為受體建立了ECL-RET體系。Au NPs 與發(fā)夾DNA(Hai-DNA)形成信號探針，再將信號探針固定在g-C3N4QDs上，此時，Au NPs 會猝滅g-C3N4QDs的ECL信號。當(dāng)引入T-DNA時，T-DNA可以破壞Hai-DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并從g-C3N4QDs中分離出Au NPs。因此，阻礙了ECL-RET效應(yīng)，g-C3N4QDs能夠再次恢復(fù)ECL信號。實驗顯示。ECL信號強(qiáng)度與T-DNA濃度的對數(shù)在0.02 fmol/L至0.10 pmol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢出限達(dá)到0.01 fmol/L。該ECL生物傳感器顯示出良好的選擇性和高靈敏度。

4.3.2 BN QDsBN QDs與g-C3N4QDs結(jié)構(gòu)似，具有獨(dú)特的物理性質(zhì)，如高導(dǎo)熱性。良好光電特性和優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性[54]。目前，基于BN QDs的傳感研究報道較少，其很多ECL性質(zhì)還未得到充分利用。最近，Liu等[55]報告了一種基于BN QDs為ECL發(fā)光體材料構(gòu)建較高ECL性能的傳感器新策略。分別以H3BO3和三聚氰胺為B源和N源，同時利用硫脲和L-半胱氨酸調(diào)節(jié)BN QDs的性能，合成了兩種穩(wěn)定性良好的S-BN QDs。此外，設(shè)計了一種雙波長SPC-ECL比率型生物傳感器用于腫瘤組織中BRAF基因進(jìn)行檢測。其中，S-BN QDs535nm作為參考項，S-BN QDs620nm作為分析項，另外引入兩個發(fā)夾DNA(H1-DNA和H2-DNA)。首先，用H1-DNA捕獲BRAF基因，H1-DNA變?yōu)橹辨溄Y(jié)構(gòu)后，暴露的序列部分進(jìn)一步與H2-DNA雜交。因為直鏈結(jié)構(gòu)化的H1-H2-DNA雙鏈體比H1-DNA-BRAF更穩(wěn)定，所以BRAF基因從H1-H2-DNA雙鏈體中被替代。在下一個循環(huán)中，釋放的目標(biāo)DNA再次被H1-DNA捕獲。結(jié)果部分BRAF基因會導(dǎo)致大量H1-H2-DNA雙鏈體被固定在電極上。當(dāng)H2-DNA與Au NPs相連接時，在Au NPs 附近的S-BN QDs620nm發(fā)生ECL-RET效應(yīng)。產(chǎn)生表面等離激元耦合ECL效應(yīng)從而實現(xiàn)了ECL信號的連續(xù)放大。該SPC-ECL生物傳感器的ECL信號與BRAF濃度在1.0 pmol/L至1.5 nmol/L范圍呈線性相關(guān)，檢出限為0.3 pmol/L。

4.4 摻雜型復(fù)合量子點(diǎn)

由于QDs具有突出的量子限域效應(yīng)，通過摻雜過渡金屬離子或非金屬元素可以有效地改善QDs的一些表面特性，從而產(chǎn)生新的現(xiàn)象和獨(dú)特的性質(zhì)[56]。近年來，研究者們進(jìn)行摻雜時采用最普遍的是N元素，另外S元素、B元素、Zn元素也是關(guān)注的熱點(diǎn)。

Liu等[57]以BN QDs為ECL發(fā)光體材料，并引入S元素，所制備的S-BN QDs具有良好的ECL活性，同時采用非金屬等離子體MoS2納米片用于增強(qiáng)S-BN QDs的ECL信號強(qiáng)度。所制備的ECL生物傳感器用于檢測丙型肝炎病毒(HCV)，線性范圍為0.5 pmol/L至1.0 nmol/L。檢出限為0.17 pmol/L。此外，Zhang等[26]通過在G QDs內(nèi)部摻雜B元素，形成了具有中心六角孔的準(zhǔn)平面結(jié)構(gòu)的硼簇石墨烯量子點(diǎn)(BG QDs)。通過透射電子顯微鏡(TEM)、光致發(fā)光(PL)光譜和紫外(UV)光譜表征表明，BG QDs與G QDs的平面晶格間距一致，并具有良好的發(fā)光性能。成功制備了以BG QDs作為發(fā)光材料的ECL生物傳感器用于檢測腫瘤標(biāo)志物microRNA-20a，ECL信號與microRNA-20a在0.1 pmol/L至10 000.0 pmol/L濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢出限為0.1 pmol/L。該ECL生物傳感器為腫瘤標(biāo)志物的檢測提供了一個高靈敏度且簡易的平臺。

ECL生物傳感器的高靈敏度和低檢出限一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。Wang等[58]將制備好的CdS/ZnS QDs摻入聚乙烯亞胺(PEI)，并利用水熱法合成了Au NPs修飾的MoS2用來猝滅CdS/ZnS QDs的ECL信號。該ECL-DNA傳感器在目標(biāo)DNA濃度為0.05 fmol/L至1 000.00 fmol/L范圍內(nèi)實現(xiàn)超靈敏測定，檢出限低至0.023 fmol/L。另外，Liu等[59]以摻雜大量N元素的N-C QDs作為ECL發(fā)光體材料，并結(jié)合酶Nb.BbvCl介導(dǎo)的信號放大技術(shù)(NESA)，開發(fā)了一種用于檢測microRNA的超靈敏ECL生物傳感器。首先，發(fā)夾探針1-N-C QDs與輔助探針和microRNA形成Y型連接結(jié)構(gòu)。隨后，釋放的microRNA和輔助探針可以啟動下一個回收過程。大量的N-C QDs-DNA的產(chǎn)生可以進(jìn)一步與固定在GO/Au表面的發(fā)夾探針2雜交，增強(qiáng)了ECL信號強(qiáng)度。ECL強(qiáng)度將隨著目標(biāo)microRNA濃度的增加而增加。該ECL生物傳感器設(shè)計新穎，microRNA濃度在10 amol/L至10 000 fmol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢出限達(dá)到10 amol/L。該ECL生物傳感器在臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用前景。

4.5 核殼型量子點(diǎn)

通常實驗室所制備核型QDs的表面有大量的缺陷，可能發(fā)生電荷的無輻射重組現(xiàn)象，進(jìn)而嚴(yán)重影響量子產(chǎn)率。然而這是可以通過化學(xué)方式來改善QDs表面缺陷，特別是在其表面覆蓋另一層晶體結(jié)構(gòu)相似，帶隙更大的半導(dǎo)體材料，從而獲得性能更為優(yōu)異的核@殼結(jié)構(gòu)型QDs[60,61]。Zhang等[62]制備了一種具有高效ECL性能的核殼型QDs。首先，將Au NPs封裝到固體SiO2核中，形成Au NPs@SiO2型核殼結(jié)構(gòu)。其次，將g-C3N4QDs嵌入SiO2殼(mSiO(2))孔中以形成Au NPs@C3N4QDs@mSiO(2)型納米球，并以K2S2O8為共反應(yīng)劑進(jìn)行ECL反應(yīng)，對比僅使用g-C3N4QDs的ECL反應(yīng)，ECL信號強(qiáng)度增強(qiáng)了3.8倍。最后，將Au NPs@C3N4QDs@mSiO(2)連接到探針DNA上，此時Au NPs@C3N4QD@mSiO(2)@-Probe DNA的ECL信號最強(qiáng)，當(dāng)引入目標(biāo)DNA時，目標(biāo)DNA與探針DNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，Au NPs-@C3N4QDs@mSiO(2)會遠(yuǎn)離電極表面，ECL信號會大幅減弱，所制備的ECL生物傳感器用于檢測大腸桿菌(STEC)基因，實驗顯示ECL信號與STEC在0.1 pmol/L到1.0 nmol/L濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢出限為9 fmol/L。并成功應(yīng)用于人血清中STEC基因的超靈敏測定。肝細(xì)胞癌(HULC)是世界上最常見的癌癥之一，每年導(dǎo)致大量人死亡[63]，對于肝癌的早期診斷具有重要意義。Li等[64]合成了核殼型納米結(jié)構(gòu)Au@Ag，并與G QDs結(jié)合作為ECL發(fā)光體材料。所制備的Au@Ag-G QDs有效增強(qiáng)了G QDs發(fā)光強(qiáng)度，成功構(gòu)建了高靈敏度ECL生物傳感器用于檢測肝癌(HULC)。該ECL生物傳感器的ECL信號與lncRNA濃度在1 fmol/L到5 nmol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢出限為0.3 fmol/L。

本文所論述的ECL核酸分析傳感器的相關(guān)信息全部總結(jié)如表1所示。

表1 基于量子點(diǎn)的電化學(xué)核酸傳感器Table 1 Quantum dots based elcctrochemiluminescent nucleic acid sensor

5 總結(jié)與展望

惡性腫瘤是引起全球死亡率上升的主要原因之一，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康和社會發(fā)展。當(dāng)前，癌癥的診斷主要依靠觀察病人的癥狀、病史以及結(jié)合影像學(xué)技術(shù)進(jìn)行，但是由于癌癥起病隱匿并且相關(guān)癥狀并不明顯，很容易造成誤診和漏診，當(dāng)前技術(shù)對于癌癥的早期快速準(zhǔn)確診斷仍存在很大的不足。研究表明，核酸與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，大量癌組織中存在特定DNA堿基序列的突變或者microRNA基因的異常表達(dá)。通常，與之相關(guān)的ctDNA或microRNA在人體內(nèi)濃度極低，因此，有必要開發(fā)超靈敏的分析方法用于檢測人體內(nèi)微量核酸。量子點(diǎn)因其特殊的尺寸效應(yīng)和獨(dú)特的光電性質(zhì)，使其在電化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域內(nèi)有了深入的發(fā)展與應(yīng)用。但同時也面臨一些諸如量子點(diǎn)表面缺陷、生物毒性、工作電位較高等很多實際問題。

電化學(xué)發(fā)光核酸分析技術(shù)的發(fā)展離不開新發(fā)光體系的設(shè)計與制備，發(fā)掘高發(fā)光效率、高穩(wěn)定性能以及低毒性量子點(diǎn)顯得尤為重要。基于量子點(diǎn)的電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)，因具有靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，為核酸分析的發(fā)展提供了一個新平臺。目前，市面上家用血糖儀基本上都是采用電化學(xué)法進(jìn)行檢測，通過記錄試紙片上的酶與血液中葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生的電子數(shù)量，再轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度讀數(shù)。因此，研發(fā)類似便攜式的家用血糖儀以及兼?zhèn)潇`敏度高、檢出限低的電化學(xué)發(fā)光核酸分析傳感器，這對于人類重大疾病的早期診斷與預(yù)后有著無與倫比的意義。