小鼠模型中神經(jīng)酰胺對(duì)血小板介導(dǎo)的輸血相關(guān)急性肺損傷的作用

李應(yīng)明陳 華伍 燕

(海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院輸血科,?？?570208)

輸血相關(guān)急性肺損傷(transfusion-related acute lung injury, TRALI)定義為輸血后前6 h 內(nèi)發(fā)生的非心源性肺水腫,是嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng),也是輸血相關(guān)死亡的首要原因[1-2]。 根據(jù)2015 年美國(guó)美食品藥品監(jiān)督管理局報(bào)道,輸血引起的病毒感染顯著下降,而輸血導(dǎo)致的致死性不良反應(yīng)中位居前三位的依次是輸血相關(guān)急性肺損傷、溶血性輸血反應(yīng)和輸血相關(guān)膿毒血癥。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)血小板制品中含有的多種免疫調(diào)節(jié)因子,諸如如血小板衍生的生長(zhǎng)因子、可溶性CD40 配體、白介素-6 和白介素-8 等,在血小板存儲(chǔ)過(guò)程中不斷積累,在其活化后會(huì)參與TRALI等多種輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。

血小板在TRALI 中的具體作用機(jī)制一直存在疑問(wèn)。 目前的研究表明血小板對(duì)TRALI 的致病過(guò)程具有促進(jìn)作用。 采用用大劑量阿司匹林或血小板膜糖蛋白(GP)IIb、IIIa 抑制劑,阻斷血小板后能有效遏制肺的病理?yè)p傷和死亡。 對(duì)大鼠輸注來(lái)自老化血小板的無(wú)細(xì)胞上清后能夠誘發(fā)嚴(yán)重的TRALI[3-5]。 以上研究均說(shuō)明來(lái)自血小板分泌的可溶性介質(zhì)可能觸發(fā)和推動(dòng)了TRALI的發(fā)生。 存儲(chǔ)的血液制品中的可溶性介質(zhì)主要為具有生物活性的脂質(zhì),對(duì)存儲(chǔ)5 d 后的血小板脂質(zhì)成分分析發(fā)現(xiàn)鞘磷脂神經(jīng)酰胺含量最為豐富,神經(jīng)酰胺主要由鞘磷脂經(jīng)酸性鞘磷脂酶在體內(nèi)進(jìn)行生物合成,是造成TRALI 的關(guān)鍵性物質(zhì)[6]。 因此,本研究推測(cè),儲(chǔ)存后的血小板可能通過(guò)酸性鞘磷脂酶增加神經(jīng)酰胺的形成而誘導(dǎo)抗體非依賴性TRALI 的發(fā)生。

為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè),本研究首先LPS 預(yù)刺激小鼠后,輸注含有酸性鞘磷脂酶特異性抑制劑ARC39或酸性鞘磷脂酶特異性基因缺失的老化血小板構(gòu)建TRALI 的二次打擊模型,分析血小板中的脂質(zhì)成分和肺損傷程度,評(píng)估神經(jīng)酰胺在血小板介導(dǎo)的TRALI 發(fā)病過(guò)程中的具體作用機(jī)制,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇近交系 8 ～10 周齡/雄性,SPF 級(jí) BALB/c小鼠,共35 只[SCXK (川) 2018-0032],每只小鼠體重 22～30 g；以及 8 ～10 周齡,SPF 級(jí)酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,Asm)基因敲除小鼠,共35 只[SCXK (川) 2016-0030],每只小鼠體重 22 ～30 g。 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)[SYXK(湘)2018-0025]。實(shí)驗(yàn)前1 周所有動(dòng)物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)飼養(yǎng)間,小鼠飼料、飲水及墊料均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化消毒滅菌處理,自由飲水,12 h 晝夜節(jié)律。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容符合中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院大學(xué)動(dòng)物倫理和保護(hù)指南,實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本單位倫理審批(2018HK0342),全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容遵循3R 原則。

1.2 主要試劑

LPS(貨號(hào):L2630)購(gòu)自美國(guó) sigma 公司；巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-2 的ELISA 檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):MM200) 和 腫 瘤 壞 死 因 子-α (TNF-α) (貨 號(hào):MTA00B)購(gòu)買(mǎi)自加拿大R&D 生物公司；凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物 ELISA 檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):2013-1727)購(gòu)買(mǎi)自上海廣銳生物技術(shù)有限公司；髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):ab144077)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Abcam 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血小板的獲取和存儲(chǔ)

5 只雄性8 周齡BALB/c 小鼠及相同數(shù)量、性別、年齡的Asm基因缺失小鼠經(jīng)麻醉后通過(guò)心臟穿刺收集全血標(biāo)本,全血在室溫下1200 r/min 離心15 min 三次后富集獲得富含血小板血漿并對(duì)其中的血小板進(jìn)行計(jì)數(shù),再以無(wú)菌PBS 溶液將血小板濃度標(biāo)化為終濃度每毫升1×109個(gè),血小板存儲(chǔ)液為10%檸檬酸-磷酸-葡萄糖-腺嘌呤混合而成的CPDA 緩沖液,其中一部分添加ASM 抑制劑ARC39(10 mol/L)后在無(wú)菌生物安全柜中存儲(chǔ)。

1.3.2 小鼠TRALI 的二次打擊模型構(gòu)建及血小板輸注

BALB/c 小鼠經(jīng)腹腔注射2 mg/kg LPS 或等效體積的生理鹽水,2 h 后經(jīng)尾靜脈緩慢注射10 mL/kg 劑量、濃度為每毫升 1×109個(gè),存儲(chǔ) 1 ～5 d 的BALB/c 小鼠血小板,或添加ASM 抑制劑ARC39 的BALB/c 小鼠血小板,或Asm基因缺失小鼠血小板,對(duì)照組輸注相同體積生理鹽水。 小鼠于室溫下在籠子中觀察6 h。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法檢測(cè)肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)表達(dá)水平。

處死小鼠后,進(jìn)行氣管插管,肺內(nèi)注射1 mL 無(wú)菌 PBS 溶液后回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage, BALF),2000 r/min 離心 5 min 去除細(xì)胞獲取上清得到 BALF,檢測(cè) BALF 中TNF-α、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物角和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(macrophage-inflammatory protein 2, MIP-2)水平,大致步驟如下:每孔加入50 μL 樣品稀釋液,然后分別加入相應(yīng)的50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品及各組小鼠樣品,輕輕搖勻,封上膜后室溫孵育2 h；配置好洗液并洗板5 次,將孔中的液體拍打干凈之后,每孔加100 μL 生物素耦聯(lián)抗體,再封上新膜后室溫孵育2 h,洗板5 次,每孔加入100 μL 顯色底物,室溫避光孵育30 min 顯色,每孔加入 100 μL 反應(yīng)終止液,讀取450 nm 和540 nm 的吸光度值。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD 值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出方程,并計(jì)算得到相應(yīng)的指標(biāo)濃度。

1.3.4 肺組織MPO 活性定量檢測(cè)

分別取各組小鼠的肺組織,在冰上使用勻漿器充分勻漿組織后10000 r/min 離心10 min,收集離心后上清,即為肺組織勻漿液。 依照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟測(cè)定組織勻漿液在480 nm 處的吸光度值,根據(jù)吸光度值計(jì)算不同肺組織的MPO 活性。

1.3.5 肺組織MPO 活性定量檢測(cè)

輸注血小板觀察6 h 后頸椎脫臼法處死各組小鼠,取小鼠左肺組織進(jìn)行濕/干重比值測(cè)定:將肺組織置于電子天平上稱(chēng)量總質(zhì)量W1,隨后置于70℃恒溫烘干箱烘干72 h 使其水分完全蒸發(fā)。 再次稱(chēng)量干燥后的組織記錄為W2。 計(jì)算時(shí)采用公式“(濕重)/(干重)×100%=(W1)/(W2)×100%”計(jì)算出數(shù)值。 取右肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后,用樹(shù)膠封固,放在溫箱中烤干后,在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)肺泡或間質(zhì)中性粒細(xì)胞、透明膜、空隙碎片和肺泡間隔增厚等指標(biāo),使用組織學(xué)肺損傷評(píng)分對(duì)肺損傷進(jìn)行分級(jí)。

1.3.6 血小板脂質(zhì)譜成分分析

從儲(chǔ)存后的血小板上清液中提取神經(jīng)酰胺并采用液相色譜法進(jìn)行定量測(cè)定,主要步驟如下:將冷凍后的血小板解凍并以3000 r/min 離心15 min,以四氯甲醇萃取收集脂質(zhì)。 采用Q-TOF 6530 質(zhì)譜儀(Agilent Technologies,Waldbron,德國(guó))及串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)鞘磷脂成分進(jìn)行分析,使用Mass Hunter 軟件(Agilent Technologies)進(jìn)行量化處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 及Prism 7.01 (美國(guó)Graph Pad Software 公司)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()”,多組間比較采用單因素方差分析,以Dunnett 檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較,P＜0.05 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 伴隨血小板存儲(chǔ)時(shí)間的增加TRALI 肺損傷加劇

為了明確血小板儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)于TRALI 的影響,本研究對(duì)BALB/c 小鼠進(jìn)行LPS 腹腔注射后,分別輸注存儲(chǔ) 0、1、3、5 d 的血小板。 6 h 后處死小鼠,觀察小鼠肺發(fā)現(xiàn),輸注血小板后小鼠肺出現(xiàn)了嚴(yán)重的特征性損傷。 肺組織病理切片出現(xiàn)了明顯的肺水腫和組織損傷。 濕/干肺重量比值在輸注儲(chǔ)存3、5 d血小板的小鼠中顯著上調(diào)(圖1A)。 BAL 蛋白含量在輸注儲(chǔ)存5 d 血小板的小鼠體內(nèi)增加明顯(圖1A)。 肺 MPO 活性在輸注儲(chǔ)存 1、3、5 d 血小板的小鼠中均顯著上調(diào)超過(guò)1 倍(圖1A)。 HE 染色顯示輸注儲(chǔ)存1、3、5 d 血小板的小鼠肺組織損傷加重(圖1B)。 以上結(jié)果表明,輸注老化的血小板會(huì)導(dǎo)致肺水腫形成、血管屏障衰竭、肺中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織病理學(xué)損傷；并且TRALI 的損傷程度與血小板儲(chǔ)存時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)。

2.2 神經(jīng)酰胺隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增加在小鼠血小板中的含量增加

為了明確是否由于血小板中神經(jīng)酰胺可以隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而積累,本研究通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜對(duì)存儲(chǔ)后的血小板樣品中神經(jīng)酰胺成分的定量分析顯示:神經(jīng)酰胺隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)在血小板中不斷增加,存儲(chǔ)第7 天的血小板中神經(jīng)酰胺的含量是第 0 天的 1.6 ～ 2.9 倍(如圖 2 所示)。 以上結(jié)果表明隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)酰胺會(huì)持續(xù)積累,從而加劇小鼠TRALI。

2.3 ASM 抑制或缺失后,老化血小板介導(dǎo)的TRALI 明顯減弱

圖1 老化的血小板輸注到LPS 預(yù)刺激后的小鼠體內(nèi)中會(huì)加劇TRALI 的組織病理?yè)p傷Note.A, Ratio of wet weight to dry weight of mice, the concentration of protein in BAL and the activity of MPO in lung tissue.B, Histopathological photos of HE staining of lung tissue after transfusion of platelets with different storage time.Compared with the normal control group, *P＜0.05.Compared with platelet storage group, #P＜0.05.Figure 1 The ratio of wet weight to dry weight, the concentration of protein in BAL and the activity of MPO in lung tissue of mice after transfusion of aged platelets into LPS pre-stimulated mice with different storage time of TRALI

圖2 不同種類(lèi)的神經(jīng)酰胺隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加在小鼠血小板中的積累Note.The contents of different kinds of ceramides in stored platelet samples were quantitatively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).Compared with the normal control group, *P＜0.05.Compared with platelet storage group, #P＜0.05.Figure 2 Accumulation of different kinds of ceramides in mouse platelets with the increase of storage time

為了進(jìn)一步探討鞘磷脂在老化血小板介導(dǎo)的TRALI 中的具體機(jī)制,本研究通過(guò)兩種不同的途徑阻斷鞘磷脂的生成:藥物抑制鞘磷脂形成(ASM 的抑制劑ARC39 預(yù)處理血小板)和輸注Asm基因缺失小鼠來(lái)源的血小板。 我們觀察到抑制或阻斷鞘磷脂的生成后,肺MPO 活性和肺組織病理學(xué)損傷顯著好轉(zhuǎn),濕/干肺重量比和 BAL 蛋白含量降低(圖3A)。 HE 染色也顯示小鼠肺在輸注Asm基因缺失血小板或ARC39 預(yù)處理后的血小板后顯著改善了肺損傷(圖3B)。

3 討論

通過(guò)本項(xiàng)研究,我們發(fā)現(xiàn)存儲(chǔ)后的血小板中累計(jì)產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺是觸發(fā)血小板介導(dǎo)的抗體非依賴性TRALI 的新機(jī)制,特異性的通過(guò)抑制ASM 活性減少神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生能夠明顯減輕TRALI 癥狀,潛在延長(zhǎng)血小板的存儲(chǔ)時(shí)間并增加輸血的安全性,為臨床血制品的存儲(chǔ)開(kāi)辟了新的前景。

血小板是一種臨床稀缺的血液制品,因此常常需要盡可能延長(zhǎng)其存儲(chǔ)時(shí)間和最大限度的提高其臨床利用率,但是長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)的血小板會(huì)增加TRALI 的風(fēng)險(xiǎn)[7]。 我們通過(guò)構(gòu)建小鼠 TRALI 的二次打擊模型,在輸注血小板6 h 后即觸發(fā)TRALI 的特征性臨床表現(xiàn):肺水腫形成、血管屏障衰竭、肺中性粒細(xì)胞積聚和肺組織學(xué)損傷,并且發(fā)現(xiàn)TRALI 病情的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)血小板的儲(chǔ)存時(shí)間的依賴性。既往的研究已經(jīng)證明神經(jīng)酰胺是內(nèi)皮屏障失效和肺損傷的重要介質(zhì)。 在肺組織和細(xì)胞中鞘脂類(lèi)相關(guān)酶類(lèi)的表達(dá)量非常高,當(dāng)機(jī)體受到諸如腫瘤壞死因子-α 和血小板活化因子等刺激時(shí),支氣管肺泡灌洗液中酸性鞘磷脂酶的活性增高,神經(jīng)酰胺量也相應(yīng)增加。 并且ASMase 的活性與神經(jīng)酰胺量的同步增加,而應(yīng)用ASMase 抑制劑后,神經(jīng)酰胺的生成顯著減少,肺功能得到了改善[8-9]。 神經(jīng)酰胺通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活性增加肺內(nèi)皮細(xì)胞通透性,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流以及內(nèi)皮屏障破壞和肺水腫形成[10-12]。 此外,神經(jīng)酰胺可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而進(jìn)一步加重肺中的內(nèi)皮屏障破壞[13-15]。 我們通過(guò)鞘磷脂成分分析發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)的血小板中神經(jīng)酰胺的含量增加最為顯著,提示在TRALI 的致病過(guò)程中,神經(jīng)酰胺可能發(fā)揮重要作用,進(jìn)一步通過(guò)ASM 抑制劑或輸注ASM 基因缺陷小鼠來(lái)源的血小板可以明顯緩解TRALI 癥狀。因此,我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功證實(shí)神經(jīng)酰胺可能是血小板介導(dǎo)的抗體非依賴性TRALI 的重要分子,而且靶向抑制ASM 依賴的神經(jīng)酰胺的形成可以降低老化血小板介導(dǎo)ALI 的風(fēng)險(xiǎn),從而增加儲(chǔ)存血液制品的安全性。

圖3 輸注Asm 基因缺失小鼠來(lái)源的血小板或ASM 特異性抑制劑處理后的儲(chǔ)存血小板可明顯減弱減弱TRALI 損傷Note.A.Ratio of lung wet weight to dry weight, the protein concentration in BAL and the activity of MPO in lung tissue of each group of mice were marked as shown in the figure.B, HE staining tissue sections of the lungs of each group of mice。 Compared with the normal control group, *P＜0.05.Compared with platelet transfusion group, #P＜0.05.Figure 3 Transfusion of platelets derived from Asm gene deleted mice or stored platelets treated with ASM specific inhibitors could significantly attenuate TRALI damage

在早期研究中,通過(guò)輸注針對(duì)小鼠血小板的兔多克隆血清耗竭血小板或者高劑量阿司匹林可以有效遏制TRALI 的發(fā)生發(fā)展。 我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):這種高劑量的阿司匹林僅能降低TRALI 小鼠的死亡率,而在藥理學(xué)劑量(10 mg/Kg)下并沒(méi)有觀察到保護(hù)作用。 鑒于阿司匹林對(duì)COX-1 有抑制作用,這表明大劑量阿司匹林的保護(hù)作用可能源于其血小板非依賴性的抗炎和抗氧化特性,或來(lái)自代謝衍生物水楊酸鹽的特性,而不是其抗血小板活性。 此外,臨床上血小板常規(guī)的存儲(chǔ)時(shí)間為3 ～5 d,在美國(guó)基于預(yù)防細(xì)菌污染的考慮,血小板存儲(chǔ)時(shí)間限定在5 d 以內(nèi)[16]。 在本研究中,靶向抑制 ASM 活性,不僅能夠緩解輸注存儲(chǔ)5 d 的血小板之后的TRALI 癥狀,并且可成功將小鼠血小板的儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)至7 d,有助于提高臨床血小板使用率,緩解血制品的供需矛盾。