西瓜種質(zhì)M08甲基磺酸乙酯誘變條件篩選

王春霞　何亞萍　李陳浩　曾郅隆　楊建強(qiáng)　馬含月　魏春華　張顯

摘? ? 要：為構(gòu)建西瓜突變體庫并創(chuàng)制優(yōu)異突變新材料，以西瓜種質(zhì)M08為試材，設(shè)置6個(gè)甲基磺酸乙酯（EMS）濃度（φ）（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）和3個(gè)誘變時(shí)間（12 h、18 h和24 h）的處理組合，根據(jù)相對(duì)成苗率來篩選最佳EMS誘變條件。結(jié)果表明，西瓜種質(zhì)M08對(duì)EMS具有較強(qiáng)耐受性;M1代出苗率和成苗率均隨著EMS濃度的升高和誘變時(shí)間的延長呈下降趨勢(shì)。為了獲得較大的突變?nèi)后w，同時(shí)保證一定的誘變率，最終采用開殼后溫湯浸種4 h，相對(duì)成苗率接近半致死劑量的1.5% EMS浸種12 h 或者1.0% EMS浸種24 h的處理組合，作為西瓜種質(zhì)M08 EMS誘變的最佳條件，研究結(jié)果為下一步構(gòu)建西瓜突變體庫和通過誘變創(chuàng)制西瓜新材料奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：西瓜;種子;EMS誘變;相對(duì)成苗率

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）10-026-06

Optimation of EMS mutation in watermelon germplasm M08

WANG Chunxia1， HE Yaping1， LI Chenhao1， ZENG Zhilong1， YANG Jianqiang1， MA Hanyue2， WEI Chunhua1， ZHANG Xian1

（1. College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Dongtai National Modern Agricultural Industrial Park， Dongtai 224200， Jiangsu， China）

Abstract： In order to construct watermelon mutant library and create new mutant materials， six EMS concentrations （0， 0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， and 2.5%） and three treatment times （12 h， 18 h and 24 h） were combined to screen the best EMS mutation condition according to the seedling relative growth rate. The results showed that the watermelon germplasm M08 had a strong tolerance to EMS， and the germination rate of all treatments were higher than 60%. Both the emergence and seedling rates of M1 generation were affected by EMS treatment， which showed similar downward trends corresponding to the increase of EMS concentration and the extension of mutation time. In order to obtain a large mutagenesis population and ensure a high mutation rate， the following condition was preferentially selected as the best EMS mutation condition for watermelon germplasm M08： After soaking for 4 h in warm water， the seeds without coats were treated with 1.5% EMS for 12 h or with 1.0% EMS for 24 h， of which the relative seedling rates were close to the median lethal dose. The present results? provide a theoretical reference for construction of watermelon mutagenesis libraryandcreate new materials by EMS treatment.

Key words： Watermelon; Seed; EMS mutation; Relative seedling growth rate

西瓜（Citrullus lanatus L.）為葫蘆科西瓜屬一年生草本蔓生植物，原產(chǎn)于非洲，經(jīng)馴化后成為了可食用的西瓜。我國是西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)的第一大國，目前收集保存的西瓜種質(zhì)資源有1500份左右[1]。自20世紀(jì)50年代以來，經(jīng)過育種工作者的不斷努力，我國的西瓜品種已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了至少5次更新?lián)Q代，極大地推動(dòng)了我國西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而，長期的人工選擇育種導(dǎo)致現(xiàn)有的西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，使得部分優(yōu)良性狀丟失（如抗性基因等），明顯影響了西瓜品種的多樣化選育進(jìn)程[2]。因此，利用誘變技術(shù)創(chuàng)制新的育種材料，可以有效地解決這一問題，同時(shí)對(duì)拓寬遺傳背景、深度挖掘重要功能基因也具有重要作用[3-4]。

甲基磺酸乙酯（EMS）因其具有誘變突變率高、誘變效果好、成本低、易操作、突變范圍廣、不易產(chǎn)生染色體畸變等特點(diǎn)而成為應(yīng)用最廣泛的化學(xué)誘變劑[5-11]。目前，已有多種作物通過EMS實(shí)現(xiàn)了種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育，如大麥[12]、大豆[13-14]、花生[15-17]、綠豆[18]以及番茄[19-20]等。最近10年，才有關(guān)于葫蘆科作物利用EMS構(gòu)建突變體庫的研究報(bào)道，甜瓜[21]是最早利用EMS創(chuàng)建突變體庫的，篩選出的突變體不僅能夠創(chuàng)制新的育種材料，還可為基因功能解析提供珍貴資源，加速其分子研究進(jìn)程，如Galpaz等[22]利用EMS誘變技術(shù)成功獲得甜瓜橙黃色瓜瓤突變體，并克隆類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因yofI。種子是EMS誘變處理最常用的材料，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、便于大量處理，而且無需設(shè)備儀器便可以在短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建大量的突變?nèi)后w。劉忠松等[23]通過對(duì)多種作物種子的EMS誘變條件進(jìn)行探索分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)作物種子的適宜EMS誘變濃度在0.3%～1.5%之間，誘變時(shí)間以不超過24 h為宜。如在葫蘆科作物中，王學(xué)征等[24]認(rèn)為1.0%濃度的EMS浸泡9 h為西瓜W1-17的最佳誘變條件，然后對(duì)M1和M2代群體進(jìn)行表型觀察，成功地構(gòu)建了西瓜突變體庫?？祵毶旱萚25]研究發(fā)現(xiàn)瓠瓜種子開殼后有助于提高種子對(duì)EMS的敏感性，最終采用開殼浸種4 h，1.5%濃度的EMS處理8 h為瓠瓜種子誘變的最適宜條件。弭寶彬等[26]研究了處理濃度和處理時(shí)間對(duì)冬瓜種子萌發(fā)和生長的影響，表明冬瓜種子最佳誘變條件為1.2%EMS誘變處理12 h，依此成功構(gòu)建了冬瓜突變體庫。Chen等[27]認(rèn)為黃瓜品系406的最佳誘變條件為1.5%的EMS，處理12 h。程蛟文等[28]首次以苦瓜干種子為材料，明確了清水浸種8 h后，用1.5% 或者1.2%的EMS溶液處理2 h是苦瓜EMS誘變的適宜條件。

本研究以西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜課題組的核心種質(zhì)M08為試驗(yàn)材料，該種質(zhì)具有優(yōu)異的農(nóng)藝性狀和良好的抗逆性，如高抗枯萎病、兼抗炭疽病，以及良好的抗旱性等[29-31];現(xiàn)已應(yīng)用于課題組多個(gè)品種的選育，如西農(nóng)8號(hào)、農(nóng)科大6號(hào)和農(nóng)科大11號(hào)等[32-33]。EMS處理種子后可誘變產(chǎn)生高密度的點(diǎn)突變，無外源基因滲入，其優(yōu)異突變材料可直接用于遺傳育種中。通過設(shè)置不同的EMS溶液濃度和不同誘變時(shí)間的處理組合，統(tǒng)計(jì)和分析各處理組合對(duì)種子發(fā)芽率、相對(duì)出苗率、相對(duì)成苗率的影響，同時(shí)對(duì)處理獲得的西瓜幼苗進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀觀察，確定西瓜種質(zhì)M08 的EMS誘變適宜條件，旨在為下一步構(gòu)建西瓜突變體庫以及創(chuàng)制西瓜新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西瓜種質(zhì)M08由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜課題組提供，該種質(zhì)果肉質(zhì)地脆細(xì)、瓤色深紅，口感極佳，且具高產(chǎn)潛力。EMS（甲基磺酸乙酯）原液購自Sigma-Aldrich公司（貨號(hào)：M0880），為無色溶液，用0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.0）為溶劑，按照體積分?jǐn)?shù)配制不同濃度的EMS溶液[24]。EMS誘變?cè)囼?yàn)于2020年5月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院蛋白分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，誘變材料篩選在楊凌揉谷鎮(zhèn)權(quán)家寨西甜瓜試驗(yàn)基地進(jìn)行，于2020年11月結(jié)束。

1.2 方法

設(shè)置6個(gè)EMS濃度梯度（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）和3個(gè)誘變時(shí)間（12 h、18 h、24 h），共18個(gè)處理組合，并以磷酸緩沖液為對(duì)照。每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次。具體操作流程為：選取西瓜種質(zhì)M08的飽滿種子，嗑開其種臍部位，溫湯浸種4 h，用吸水紙將種子表面水分吸干后，置于50 mL離心管內(nèi)，在通風(fēng)櫥中加入20 mL EMS溶液，在搖床上分別震蕩處理12 h、18 h和24 h，全程用黑色塑料袋遮光（EMS見光易分解）;處理結(jié)束后，采用硫代硫酸鈉溶液作為反應(yīng)終止劑，使用1 mol·L-1硫代硫酸鈉（Na2S2O3）洗1次后，再使用100 mmol· L-1硫代硫酸鈉（Na2S2O3）洗2次，每次洗5 min;將各處理的種子做好標(biāo)記后裝于紗網(wǎng)袋中，流水沖洗5～6 h，瀝干水分后，用濕毛巾包裹裝于塑封袋內(nèi)，置于28 ℃暗培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。每隔24 h觀察并記錄種子發(fā)芽情況，以對(duì)照組全部發(fā)芽的當(dāng)天（第3天）作為最終統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率的時(shí)間。

隨后將發(fā)芽種子播于科研溫室的50孔穴盤中，待種子萌發(fā)后，統(tǒng)計(jì)各處理的出苗數(shù)，播種后第20 天計(jì)算各處理的相對(duì)出苗率，第40 天統(tǒng)計(jì)各處理的成苗情況并計(jì)算成苗率以及相對(duì)成苗率，成苗的標(biāo)準(zhǔn)是植株具有生長點(diǎn)及2片以上真葉。相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率/%=（發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)）×100;

出苗率/%=（出苗總數(shù)/供試種子數(shù)）×100;

相對(duì)出苗率/%=（出苗率/對(duì)照出苗率）×100;

成苗率/%=（成苗總數(shù)/供試種子數(shù)）×100;

相對(duì)成苗率/%=（成苗率/對(duì)照成苗率）×100。

于2020年8月16日，將誘變處理獲得的全部幼苗在3葉1心時(shí)定植于楊凌區(qū)揉谷鎮(zhèn)權(quán)家寨西甜瓜試驗(yàn)基地的日光溫室中，采用寬壟種植，膜下滴灌及吊蔓栽培的形式，種植壟寬70 cm，植株雙行定植于種植壟上，壟溝寬50 cm，溝深15 cm，株行距均為50 cm，每壟40株;定期觀察植株的田間表型，篩選變異植株。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，并采用Duncan檢驗(yàn)確定各處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組合對(duì)種子發(fā)芽率的影響

由表1可知，在相同的誘變時(shí)間內(nèi)，種子的發(fā)芽率隨著濃度的升高而逐漸降低。EMS浸種處理12 h，僅在濃度為2.5%時(shí)發(fā)芽率才顯著低于對(duì)照，其余處理間無顯著差異，且發(fā)芽率仍在90%以上，表明EMS浸種處理12 h對(duì)種子發(fā)芽率抑制作用弱。當(dāng)EMS濃度大于1.0%、浸種時(shí)間為18 h和24 h時(shí)，抑制作用變得顯著;如浸種處理18 h時(shí)，與對(duì)照相比，濃度為1.5%、2.0%和2.5% 的發(fā)芽率分別降低了18.00%、20.00%和24.67%。

在相同的EMS濃度處理?xiàng)l件下，種子的發(fā)芽率隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%時(shí)，浸種處理24 h的發(fā)芽率比浸種處理12 h的發(fā)芽率分別下降了8.85%、19.17%、23.45%;濃度為2.5%、浸種處理24 h時(shí)，發(fā)芽率僅為60.00%，相比于處理12 h、18 h分別降低了35.71%、20.35%。濃度由1.0%升到1.5%，浸種處理18 h和24 h的發(fā)芽率均出現(xiàn)大幅降低的現(xiàn)象，這表明M08種質(zhì)對(duì)EMS具有一定耐受性，經(jīng)高濃度的EMS處理才會(huì)對(duì)其發(fā)芽率產(chǎn)生較為明顯的抑制作用。

綜上所述，EMS溶液濃度和誘變時(shí)間都會(huì)對(duì)西瓜種子發(fā)芽率產(chǎn)生影響，當(dāng)濃度相同時(shí)，種子的發(fā)芽率會(huì)隨著時(shí)間的延長而降低;當(dāng)浸種時(shí)間相同時(shí)，種子的發(fā)芽率會(huì)隨著濃度的升高而降低。然而，相比于已有研究文獻(xiàn)[24]，本試驗(yàn)中采用的最高濃度和時(shí)間均遠(yuǎn)高于他人試驗(yàn)中所采用的，但是發(fā)芽率仍未降至50%以下，這表明種質(zhì)M08對(duì)EMS具有較強(qiáng)的耐受性。

2.2 不同處理組合對(duì)相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率的影響

由表2可知，EMS處理對(duì)種子M08的相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率有較大影響，且相對(duì)出苗率與相對(duì)成苗率的變化趨勢(shì)一致，均隨著EMS濃度升高和誘變時(shí)間延長呈下降的趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)濃度為0.5%時(shí)，誘變處理12、18和24 h的相對(duì)出苗率與對(duì)照差異不顯著;當(dāng)EMS濃度為1.0%時(shí)，18和24 h的相對(duì)出苗率與對(duì)照差異顯著，而12 h不顯著;當(dāng)濃度大于1.0%時(shí)，3個(gè)處理時(shí)間的相對(duì)出苗率與對(duì)照均有顯著差異，且相對(duì)出苗率均大于50.00%，比如濃度為2.5%時(shí)，誘變處理12、18和24 h的相對(duì)出苗率分別為75.19%、59.72%、58.25%。試驗(yàn)結(jié)果表明誘變濃度和處理時(shí)間都會(huì)影響種子的相對(duì)出苗率，當(dāng)濃度一定時(shí)，隨誘變時(shí)間的增加，種子的相對(duì)出苗率呈逐漸降低的趨勢(shì);當(dāng)誘變時(shí)間一定時(shí)，種子的相對(duì)出苗率也會(huì)隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。

試驗(yàn)結(jié)果表明，EMS處理對(duì)M08種子的相對(duì)成苗率影響較大，各處理組合的相對(duì)成苗率均顯著低于對(duì)照。當(dāng)誘變時(shí)間為24 h時(shí)，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%濃度的EMS處理后種子的相對(duì)成苗率分別為71.31%、51.16%、40.31%、37.98%和23.25%，相比于誘變處理12 h時(shí)的相對(duì)成苗率，分別降低了20.68%、15.95%、21.65%、21.77%和37.09%;由此可以得出，EMS濃度的升高和誘變時(shí)間的延長都會(huì)導(dǎo)致種子的相對(duì)成苗率降低，且高濃度、長時(shí)間的處理組合還會(huì)對(duì)幼苗的生長造成嚴(yán)重的影響。

為獲得較大的突變?nèi)后w和保證一定的變異率，在本研究中將相對(duì)成苗率的半致死劑量作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[24]。其中，12 h、1.5%EMS處理組合的相對(duì)成苗率為51.45%，24 h、1.0%EMS處理組合的相對(duì)成苗率為51.16%，均接近半致死劑量。所以確定種子開殼后溫湯浸種4 h，然后采用1.5%的EMS浸種處理12 h或者1.0%的EMS浸種處理24 h為西瓜種質(zhì)M08較適的誘變處理?xiàng)l件。

2.3 不同誘變處理組合對(duì)M1代植株農(nóng)藝性狀的影響

苗期調(diào)查結(jié)果顯示（圖1），相比于對(duì)照，M1植株的長勢(shì)明顯較弱，主要表現(xiàn)為開花晚、植株矮小、葉片畸形等。經(jīng)EMS處理過的大部分植株在生長初期出現(xiàn)了不同程度的真葉皺縮或葉片不伸展等現(xiàn)象（圖1-F），而且這些植株在生長后期均表現(xiàn)出矮化的癥狀，這可能是與葉片面積小、光合作用弱有關(guān);此外，還出現(xiàn)了子葉連結(jié)（圖1-B）、子葉翅狀（圖1-C）、3片子葉且無生長點(diǎn)（圖1-D）等現(xiàn)象，這些幼苗在后期的生長過程中個(gè)別葉片呈現(xiàn)畸形或死亡，表明EMS會(huì)使植物發(fā)生生理性損傷;還出現(xiàn)了嵌合體葉（圖1-G），但在后期的生長發(fā)育過程中會(huì)逐漸恢復(fù);在觀察中發(fā)現(xiàn)葉形變異也較多，其中如植株整株葉片變狹長、裂刻變深（圖1-H）;莖之間出現(xiàn)粘連、并生的現(xiàn)象（圖1-I）;以及葉片的著生方式由互生變?yōu)檩喩?，連續(xù)3個(gè)節(jié)位以上每個(gè)節(jié)位上開2～3朵花（圖1-J）;變異還會(huì)表現(xiàn)在花器官上，正常的雄花和雌花的花瓣數(shù)為5（圖1-K），而變異的雄花花瓣數(shù)3～9枚不等（圖1-L～O），變異的雌花花瓣數(shù)為3枚（圖1-P）。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)EMS濃度和3個(gè)誘變時(shí)間共18個(gè)組合來處理M08種子，種子的發(fā)芽率隨著EMS濃度的升高和誘變時(shí)間的延長而顯著降低，表明EMS能夠抑制種子的萌發(fā)。此前，在西瓜種子[24]和冬瓜種子[26]的誘變處理試驗(yàn)中，均認(rèn)為EMS溶液濃度比誘變處理時(shí)間對(duì)種子的發(fā)芽率影響更大，就本試驗(yàn)的發(fā)芽率指標(biāo)來看，誘變處理時(shí)間與EMS溶液濃度都會(huì)對(duì)種子的發(fā)芽率產(chǎn)生較大的影響，浸種處理12 h時(shí)，0～2.5%濃度的發(fā)芽率仍可達(dá)90%以上，說明EMS濃度對(duì)種子發(fā)芽率有影響，但抑制作用較弱;而當(dāng)浸種時(shí)間延長至24 h時(shí)，濃度大于1.0%時(shí)，抑制作用逐漸顯著，當(dāng)溶液濃度為2.5%時(shí)，發(fā)芽率僅有60.00%，說明隨著濃度的增加，浸種時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率的抑制作用越明顯[34]。西瓜種質(zhì)M08對(duì)EMS有較強(qiáng)的耐受性，只有EMS的溶液濃度增加到1.5%以上時(shí)，才對(duì)各生理指標(biāo)的抑制效果變得顯著，發(fā)芽率、相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率均呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，都是隨著EMS濃度的升高和誘變時(shí)間的延長呈下降的趨勢(shì)，這與溫日宇等[35]、吳思遠(yuǎn)等[36]的研究結(jié)果一致。利用EMS誘變技術(shù)構(gòu)建突變體庫，是創(chuàng)制新種質(zhì)、選育新品種的重要手段，因此確定適宜的誘變條件尤為關(guān)鍵。通常認(rèn)為，誘變處理的原則是既能產(chǎn)生較多的變異，同時(shí)又不致嚴(yán)重地?fù)p傷材料。為了獲得一定量的突變?nèi)后w，通常把誘變處理后50%植株存活的劑量即半致死劑量作為選擇依據(jù)[37]。對(duì)于植株存活的定義，前人均有不同見解，葉衛(wèi)君等[18]、康寶珊等[25]和程蛟文等[28]將發(fā)芽率或相對(duì)發(fā)芽率作為半致死劑量，但這可能會(huì)使得最終獲得的突變?nèi)后w較小。而Vicente-Dólera等[38]為了收獲到較多的可育株，將花粉活力作為半致死劑量來確定最佳的誘變劑量，但此標(biāo)準(zhǔn)會(huì)遺漏一些突變體。因此，筆者在本研究中綜合考慮了后代的變異率和成活率，將幼苗具有生長點(diǎn)及2片以上真葉作為植株成苗的依據(jù)，以相對(duì)成苗率的半致死劑量來確定誘變的最佳條件。

綜上，通過研究不同EMS濃度和誘變時(shí)間組合處理對(duì)西瓜種子發(fā)芽率、相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率的影響以及對(duì)植株表型的觀察，確定了開殼后先溫湯浸種4 h，然后用1.5%的EMS浸泡12 h或1.0% EMS浸泡24 h的處理組合為西瓜種質(zhì)M08誘變處理的最適條件。研究結(jié)果為下一步利用EMS誘變技術(shù)開展西瓜誘變育種相關(guān)研究提供了重要參考。

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