黑點(diǎn)根腐病菌和鐮孢菌復(fù)合侵染引起的甜瓜根腐病的鑒定

吳會杰　嚴(yán)蕾艷　郭珍　彭斌　康保珊　劉莉銘　古勤生

摘 要：為明確甘肅皋蘭地區(qū)甜瓜根腐病的病菌，通過病菌分離、致病性測定，采用真菌形態(tài)學(xué)結(jié)合基因序列分析對該病菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，引起甜瓜根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌甜瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. melonis，F(xiàn)OM）及引起黑點(diǎn)根腐病的子囊真菌（Monosporascus cannonballus）。致病性分析表明，尖孢鐮孢菌甜瓜?；图癕. cannonballus均可引起甜瓜胚根的壞死、腐爛，側(cè)根不能生長;其中M. cannonballus使瓜類砧木-南瓜品種思壯12的胚根變褐，但不影響主根和側(cè)根的生長。明確了甘肅皋蘭地區(qū)甜瓜根腐病的主要致病菌，為防控該病害提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甜瓜;根腐病;病原鑒定;致病性分析

中圖分類號：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）10-015-05

Identification of melon root rot pathogen of Monosporascus cannonballus and Fusarium oxysporum f. sp. melonis

WU Huijie1， YAN Leiyan2， GUO Zhen1， PENG Bin1， KANG Baoshan1， LIU Liming1， GU Qinsheng1

（1. Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， 450009， Henan， China; 2. Institute of Vegetables， Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China）

Abstract： In order to clarify the pathogens of melon root rot in Gansu province of Chian， the isolation， identification and pathogenicity of the pathogens were conducted. The results showed that the main pathogens causing melon root rot were Fusarium oxysporum f.sp. melonis （FOM） and Monosporascus cannonballus. The pathogenicity test showed that the two pathogens cause necrosis and rot of melon radicle. The lateral roots could not grow in infected plant， and the main roots were damaged. Moreover， M. cannonballus can also cause the radicle of the pumpkin variety Sizhuang 12 to appear brown， but the growth of the main root and lateral roots were not affected. This result laid the foundation for the prevention and control of melon root rot.

Key words： Melon;Root rot;Pathogen identification;Pathogenicity test

甜瓜是非常典型的連作障礙極為嚴(yán)重的作物，甜瓜連作會導(dǎo)致植株生長發(fā)育緩慢，病蟲害發(fā)生加重，產(chǎn)量及品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致作物絕產(chǎn)[1]，甜瓜根腐病是甜瓜連作時(shí)發(fā)生嚴(yán)重且較為普遍的病害。甜瓜根腐病大多是多種病原菌復(fù)合侵染的病害，在我國常見的病原菌為尖孢鐮孢菌甜瓜專化型（ Fusarium oxysporum f. sp. melonis，F(xiàn)OM）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）[2]、瓜類腐皮鐮孢菌（Fusarium solani （Mart.） App. et Wollenw）[3]及引起甜瓜黑點(diǎn)根腐病的子囊真菌（Monosporascus cannonballus）[4]等。其中甜瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌甜瓜專化型引起的真菌病害，是世界類土傳維管束病害[5]。M. cannonballus是Pollack 和 Uecker在1974年將從洋香瓜的病株根部分離的病原菌定名為子囊菌屬的新種，命名為 M. cannonballus[6]。M. cannonballus是土傳真菌，引起甜瓜根部腐爛，主要危害瓜類根系和莖基部。植株發(fā)病初期病部呈水漬狀，隨后至深褐色腐爛，病部不縊縮，維管束變褐色，侵染后期根部變糟，表皮脫落，僅有絲狀維管，果實(shí)成熟過程中，藤蔓逐漸萎蔫直至萎凋死亡[7]。該病菌在我國甘肅首次發(fā)現(xiàn)（2005年）[4]，隨后在甘肅武威（2009年）及酒泉市金塔縣（2018年）發(fā)現(xiàn)該病菌侵染甜瓜[8]，2020年7月在甘肅皋蘭發(fā)現(xiàn)甜瓜受害嚴(yán)重，病程發(fā)展非常迅速，從最初的冠頂葉子出現(xiàn)癥狀到最后植株死亡的歷程為5～10 d。該病害可造成30%～50%的經(jīng)濟(jì)損失[4，9]，嚴(yán)重時(shí)甚至達(dá)100%[7]。

甜瓜根腐病害是設(shè)施甜瓜栽培發(fā)生普遍且難以防治的病害，鑒別病菌是防控該病的前提條件，筆者旨在明確甘肅省皋蘭縣甜瓜大面積萎蔫、死亡的主要病因，為防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及樣本采集

2020年6月份調(diào)查甘肅省皋蘭縣大棚種植的甜瓜品種甘甜3號表現(xiàn)根腐癥狀的甜瓜，隨機(jī)采集10株。甘甜3號是薄皮甜瓜，瓜闊梨形，果皮綠色，果肉翠綠，是甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的品種。

1.2 培養(yǎng)基制備

稱取洗凈去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1000 mL煮沸0.5 h，紗布過濾，加入瓊脂粉15 g，加熱徹底溶化后，再加入葡萄糖20 g，攪拌均勻并溶解后，加自來水至總體積為1000 mL，分裝于250 mL三角瓶，121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min，隨后倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿備用。

1.3 病原菌的分離與鑒定

1.3.1 病原菌的分離 取根和莖部發(fā)生病變的組織，采用常規(guī)組織分離法，切取甜瓜根和莖基部病健交界處5 mm×5 mm的樣本，先用75%酒精消毒15 s，無菌水沖洗3遍，隨后再用2%次氯酸鈉消毒2 min，無菌水沖洗3遍，放置于滅過菌的濾紙上，干燥，最后把組織放置于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，3 d后挑取菌絲，純化、培養(yǎng)。2020年8月將分離、純化的菌株保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所瓜類病害課題組的-80 ℃冰箱。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離的菌株接種于PDA平板上，27 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)6 d后，觀察記錄菌落特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)。

1.3.3 分子鑒定 采用CTAB方法提取真菌DNA，用ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）[10]為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有目的片段后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用ClustalX進(jìn)行序列比對，采用MEGA X最大相似自然法（maximum likelihood method）進(jìn)化樹分析 [11]。

1.4 致病性鑒定

致病性鑒定采用胚根接種法[3]進(jìn)行。接種厚皮甜瓜品種金香玉（農(nóng)友種苗（中國）有限公司提供）和南瓜品種思壯12（市售）。挑選胚根長約5 mm的發(fā)芽種子移入直徑90 mm的含潮濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用5 mm打孔器打取新鮮培養(yǎng)的菌落周圍，取菌餅接種到胚根位置，接種后27 ℃黑暗保濕培養(yǎng)，接種24 h后開始觀察4 d。每個(gè)菌株接種10粒發(fā)芽種子，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

甜瓜根腐病早期主要表現(xiàn)為植株萎蔫，形成發(fā)病中心，隨著病害的發(fā)展，根部出現(xiàn)大量的褐色水漬，后水漬變褐腐爛、須根大量減少，主根腐爛，發(fā)病嚴(yán)重的地塊植株枯萎死亡（圖1）。

2.2 病原菌的分離

在PDA培養(yǎng)基上共獲得可分離的29個(gè)純化株系，依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察分為4種類型，其中尖孢鐮孢菌甜瓜?；陀?4個(gè)，檢出頻率為48.28%（14/29）;M. cannonballus有9個(gè)，檢出頻率為31.03%（9/29），其他的病原菌占據(jù)20.69%（6/29）。

2.3 形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 M. cannonballus在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速度快，27 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d后菌落直徑可達(dá)8 cm，氣生菌絲白色薄絨狀，不產(chǎn)生分生孢子，培養(yǎng)35 d以后才有零星的子囊殼及子囊孢子出現(xiàn)，每個(gè)子囊只含1個(gè)子囊孢子。尖孢鐮孢菌甜瓜?；统蕼\紫色，培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下可觀察到大型的分生孢子和小孢子（圖2）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 取真菌的DNA，用ITS1/ITS4擴(kuò)增獲得大約600 bp的條帶，將PCR產(chǎn)物送樣測序。其中一種是尖孢鐮孢菌甜瓜?；?，BLAST分析發(fā)現(xiàn)與Gen Bank中Fusarium oxysporum的序列一致性為99%（HE974453.1）。另外一種基因序列為608 bp，與Gen Bank中的M. cannonballus的序列一致性達(dá)99%（AM167937.1）。進(jìn)化樹分析表明，甘肅分離物與黑點(diǎn)根腐病菌為一個(gè)分支，認(rèn)定為黑點(diǎn)根腐病菌造成甘肅甜瓜根部腐爛，植株萎蔫死亡（圖3）。

2.4 致病性鑒定

將M. cannonballus和尖孢鐮孢菌甜瓜?；徒臃N厚皮甜瓜品種金香玉的胚芽，接種72 h后，M. cannonballus接種甜瓜胚芽后接種部位表現(xiàn)為褐色壞死，須根減少，主根正常生長，接種5 d后根部腐爛。尖孢鐮孢菌甜瓜?；徒臃N甜瓜后根部表現(xiàn)褐色，主根和須根均不能正常生長，表現(xiàn)出比M. cannonballus更強(qiáng)的致病力（圖4第1行）。從2種病菌接種發(fā)病后的組織中均能再次分離到與原接種菌株一致的病原菌，空白PDA接種對照表現(xiàn)為正常，主根和須根均正常生長。該結(jié)果表明，2種菌株均可侵染甜瓜根部，是造成甜瓜根腐的致病菌。

將2種病原菌接種生產(chǎn)上常用的嫁接砧木南瓜上品種思壯12，結(jié)果表明M. cannonballus接種南瓜后，接種部位表現(xiàn)褐色狀壞死，主根和須根生長正常，從接種發(fā)病的根部組織中可分離到該病原菌;而尖孢鐮孢菌甜瓜?；徒臃N南瓜后，在接種部位沒有觀察到根部組織病變。空白PDA接種南瓜后主根和須根均正常生長。該結(jié)果說明M. cannonballus可在南瓜品種思壯12的根部定植，但南瓜主根及側(cè)根生長依舊發(fā)達(dá);而尖孢鐮孢菌甜瓜?；筒荒芤鹉瞎掀贩N思壯12發(fā)?。▓D4第2行）。

3 討論與結(jié)論

甜瓜根腐病是甜瓜重要的土傳病害，筆者分析了造成甘肅皋蘭甜瓜根部腐爛的主要病原菌并進(jìn)行了致病性鑒定，結(jié)果表明，尖孢鐮孢菌甜瓜專化型和黑點(diǎn)根腐病菌是主要致病菌。尖孢鐮孢菌甜瓜專化型在甜瓜的主栽區(qū)均有發(fā)生，而M. cannonballus主要在甘肅省發(fā)生[4，8]。M. cannonballus主要適生于干旱及半干旱的環(huán)境[12]，甘肅大部分地區(qū)氣候干燥，全年降水少，蒸發(fā)量大，有利于黑點(diǎn)根腐病菌的發(fā)生，因此M. cannonballus在甘肅的發(fā)生和發(fā)展較快。此外，2016年寧波農(nóng)業(yè)科學(xué)院從寧波種植的甜瓜上分離到該病菌;2020年筆者在鄭州也鑒定到該病菌侵染甜瓜根部。這些結(jié)果表明，該病菌的適生范圍在擴(kuò)大，對我國的中部及東部沿海地區(qū)的甜瓜均有可能造成大的危害，威脅著我國中部及東部沿海地區(qū)的甜瓜生產(chǎn)。因此，應(yīng)加強(qiáng)對該病害發(fā)生情況的調(diào)查，針對發(fā)生區(qū)的自然條件進(jìn)行合理的水肥管理，開展該病害的綜合防控，保障甜瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

近年來，設(shè)施甜瓜高效栽培模式的推廣及全年連續(xù)種植的土壤環(huán)境有利于土傳病害的繁殖、傳播。嫁接是最經(jīng)濟(jì)、高效的防控根部土傳病害的有效措施之一[13]，把感病香瓜和西瓜嫁接到南瓜屬或葫蘆屬砧木上，可降低黑點(diǎn)根腐病的發(fā)生[14]，嫁接南瓜能降低黑點(diǎn)根腐病在西瓜和甜瓜上的發(fā)病率，而土壤中黑點(diǎn)根腐病菌的孢子數(shù)量并沒有下降，但南瓜根部分離出黑點(diǎn)根腐病菌的分離頻率大大降低[15]。因而，筆者檢測了該病菌對南瓜思壯12的致病性，結(jié)果表明，M. cannonballus可在南瓜根部定殖，使南瓜根部變褐，與之前發(fā)現(xiàn)南瓜嫁接可降低黑點(diǎn)根腐病發(fā)生[14]的結(jié)果不一致，分析可能是不同的南瓜砧木對病菌的抗性不同導(dǎo)致的差異。此外，從接種南瓜和甜瓜后的癥狀比較可以看出，該病菌對南瓜的致病力弱，而對甜瓜的致病力強(qiáng)，嫁接仍是防控該病菌的一個(gè)重要手段，需要進(jìn)一步加大砧木的篩選范圍，為該病害的防控奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)結(jié)果明確了造成甘肅皋蘭甜瓜根部腐爛的主要病原菌是尖孢鐮孢菌甜瓜專化型和黑點(diǎn)根腐病菌;發(fā)現(xiàn)了M. cannonballus可使南瓜思壯12根部變褐。

致謝：感謝甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)蔬菜研究所程鴻研究員和楊永剛研究員協(xié)助實(shí)地調(diào)研和取樣！

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