曾永芳,廖華珍,許海棠, ,王 聰,韋貽春
(1.貴港市疾病預防控制中心,廣西貴港 537100;2.廣西民族大學化學化工學院,廣西南寧 530006)
瓶爾小草(OphioglossumvulgatumL.),又名一支箭、一枝槍、矛盾草等,為蕨類植物,廣泛分布于云南、貴州、四川、廣西等地。瓶爾小草是我國民間一味重要的中藥,具有清熱涼血、解毒鎮(zhèn)痛之功效。常用于治療肺熱咳嗽、小兒高熱驚風、目赤腫痛、胃痛、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、跌打腫痛等癥[1]。目前,從瓶爾小草同屬植物中鑒別分離得到的化合物有氨基酸、有機酸、黃酮類、甾體類及多糖等[2-4]。文獻已報道其不僅具有抗病毒、抗?jié)冏饔?,還具有一定的抗腫瘤作用[5-7]。但是,關(guān)于瓶爾小草的抗氧化、抑菌和抗增殖方面的研究較少見報道。
越來越多的證據(jù)表明許多疾病都與自由基有關(guān),自由基進入細胞破壞DNA,引起細胞損傷、死亡,并引發(fā)許多慢性疾病,例如心腦血管疾病、帕金森氏病和癌癥等[8]。因此,利用抗氧化劑有效抑制自由基的氧化反應(yīng)至關(guān)重要[9]。然而,研究表明,合成抗氧化劑具有一定的肝臟毒性和致癌作用[10-11],因此,開發(fā)和利用安全有效的天然抗氧化劑成為研究熱點。近年來,天然產(chǎn)物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到人們的關(guān)注[9,12]。多酚類化合物普遍存在天然綠色植物中,研究發(fā)現(xiàn)植物多酚可以通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和增強體內(nèi)抗氧化酶活性等方面發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]。
為了研究瓶爾小草的抗氧化、抑菌和抗增殖活性,本實驗對瓶爾小草進行脫脂,然后分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇加以提取,獲得不同的提取物。通過測定瓶爾小草各提取物對DPPH自由基,ABTS自由基和羥自由基的清除率進行抗氧化能力的評估;并測定其對6種常見致病菌和1種真菌的最低抑菌濃度,用以評價瓶爾小草不同溶劑提取物的抑菌性;還采用MTT法考察其對3種癌細胞的增殖抑制作用,以期為瓶爾小草的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
瓶爾小草 廣西玉林中藥材市場提供,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定為瓶爾小草(Ophiolossum vulgatumL.)的干燥莖葉;二苯代苦味酰、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 Sigmaaldrich公司;金黃色葡萄球菌CMCC26003、普通變形桿菌CMCC49027、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、大腸埃希菌CMCC44102、銅綠假單胞菌CMCC 10104、乙型溶血性鏈球菌ATCC21059、白色念珠球菌ATCC10231 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供;細胞:SKOV3卵巢癌細胞 廣西醫(yī)科大學提供,U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤 南京科佰生物科技有限公司提供;細菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶EDTA消化液等 為國產(chǎn)生物制劑;所有分離測試用的試劑 均為分析純;水為自制超純水。
全波長酶標儀 Thermo Labsystems公司;CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司;5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher scientific公司;RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SPX-500生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;CMP-TA-20L型超純水器 成都優(yōu)越科技有限公司。
1.2.1 不同溶劑提取物的制備 稱取干燥的瓶爾小草100 g,剪碎,用800 mL石油醚回流2 h后,取濾渣,揮干溶劑,加入800 mL的氯仿回流提取2次,每次2 h,合并兩次濾液,得氯仿提取液。同法,取揮干石油醚的濾渣,分別加入適量乙酸乙酯、正丁醇、乙醇回流提取2次,分別收集濾液。旋蒸提取液,真空干燥后得到瓶爾小草的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇的4種極性溶劑提取物,儲存于-20 ℃待用。
1.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取各提取物,加入1 mL的二甲基亞砜(DMSO),超聲波超聲助溶,抗氧化實驗需配成20 mg/mL的樣品溶液,抑菌實驗需配成250 mg/mL的樣品溶液,抗增殖實驗需配成40 mg/mL的樣品溶液,測試之前用相應(yīng)溶劑稀釋至適宜濃度。
1.2.3 總黃酮含量的測定 蘆丁標準曲線繪制:取6個25 mL容量瓶,分別加入蘆丁對照品溶液(0.128 mg/mL)2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL,加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL,振搖,靜置6 min;再加入10%的硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,6 min后加入10.0 mL氫氧化鈉試液(1 mol/L),加60%乙醇溶液定容,搖勻,放置15 min。以不含蘆丁的上述混合溶液為空白溶液,在510 nm處測定吸光值[15]。繪制標準曲線,得方程Y=12.036X+0.0012,r=0.9999,其中,Y為吸光度值,X為濃度值,單位為mg/mL。
樣品總黃酮含量測定:精密量取樣品溶液1.0 mL,置于50 mL量瓶中,按上述方法操作測定吸光值,并計算總黃酮含量,結(jié)果以蘆丁當量(每克提取物相當于蘆丁的毫克數(shù))表示。
1.2.4 總酚含量的測定 沒食子酸標準曲線繪制 取一批試管,分別加入不同濃度沒食子酸標準溶液(20、40、60、80、100 μg/mL)0.1 mL,加入0.5 mL福林酚試劑和7.9 mL水,避光放置5 min,加入1.5 mL碳酸鈉溶液(10%,w/v),避光放置2 h后在765 nm波長處測定吸光值[15]。繪制標準曲線,得方程Y=0.0106X+0.174,r=0.9991,其中,Y為吸光度值,X為濃度值,單位為μg/mL。
樣品總酚含量測定:精密量取樣品溶液各0.1 mL,置于試管中,按上述方法處理后測定吸光值,計算總酚含量,結(jié)果以沒食子酸當量(每克提取物相當于沒食子酸的毫克數(shù))表示。
1.2.5 抗氧化活性的測定 本實驗主要是通過測定瓶爾小草各溶劑提取物對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力來評價其抗氧化活性。
參照文獻[16]測定瓶爾小草各提取物的DPPH自由基清除能力。配制DPPH溶液(0.1 mmol/L)以及不同濃度的各提取物溶液,按文獻方法分別取兩種溶液等體積混勻,避光放置30 min,以抗壞血酸溶液為對照,在517 nm處測定吸光度。計算清除率的公式如下:
式中,A1為 DPPH溶液+樣品溶液的吸光值;A2為樣品溶液+無水乙醇的吸光值;A0為DPPH溶液+無水乙醇的吸光值。
測定ABTS自由基清除率,參照吳豐鵬等[17]的方法配制ABTS+工作液,精密吸取ABTS+溶液3.8 mL和樣品溶液0.2 mL混合搖勻,6 min后在734 nm波長處測定吸光值,清除率的計算公式為:
式中,A0為空白溶液的吸光值,As為樣品溶液吸光值。
羥自由基清除能力的測定參考夏秀芳等[18]的方法,實驗前配制好不同濃度的樣品溶液,抗壞血酸溶液以及反應(yīng)需要的各溶液:磷酸鹽緩沖液(pH=7.4),鄰菲羅啉溶液(5 mmol/L),硫酸亞鐵溶液(7.5 mmol/L)和1%雙氧水溶液。按表1依次加入各溶液分別配制損傷管,未損傷管和樣品管。將管中溶液充分混合均勻后,置于37 ℃水浴反應(yīng)1 h,在536 nm處測吸光值。樣品管、損傷管和未損傷管測得的吸光值分別記為A樣、A損、A未損,清除率計算公式為:
表1 配制各試驗管所需溶液(mL)Table 1 Preparation of solutions for test tubes(mL)
1.2.6 抑菌活性的測試 參照文獻[19],采用微量二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。在聚乙烯96孔板上進行:先往每個孔加入液體培養(yǎng)基100 μL,然后吸取滅菌的樣品溶液(10 mg/mL)100 μL加入第1孔中,混勻后吸取100 μL加入到第2孔中,依此類推,得到一系列濃度的樣品孔。每個樣品做3個平行試驗行。向樣品孔中加入100 μL檢驗菌液(106CFU/mL);陽性對照孔只加液體培養(yǎng)基和菌液;陰性對照孔不加菌液。實驗結(jié)束后,將各細菌試驗板置于生化培養(yǎng)箱中,設(shè)定37 ℃培養(yǎng)24 h;白色念珠球菌試驗板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,觀察結(jié)果。
1.2.7 抗腫瘤活性測定 采用MTT法,參照文獻[20]進行測定。SKOV3卵巢癌細胞經(jīng)過活化培養(yǎng)后,將細胞懸液的密度控制在1×105個/mL,分別取100 μL接種于96孔板中,并于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后,將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸出,將含有不同終濃度(0、25、50、100、200、400 μg/mL)樣品溶液的培養(yǎng)基100 μL加入到96孔板中,并培養(yǎng)48 h。每個梯度接種5個平行孔。培養(yǎng)完全后,吸去上清液,向各孔中加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔內(nèi)的上清液,每孔再加入100 μL DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,在490 nm處測定各孔吸光度值。細胞增殖抑制率的計算公式為:
式中,As為加藥孔的吸光值,Ac為對照孔(含有細胞,不加藥物處理)的吸光值,Ab為空白孔(只加培養(yǎng)基)的吸光值。
本實驗中考察了正丁醇提取物對U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤癌細胞的抗增殖作用,按上述同法操作。
所有實驗分別取樣重復測定3次,結(jié)果用平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS17. 0軟件處理,并采用Origin8.0軟件作圖。
瓶爾小草4種溶劑提取物的總黃酮和總酚含量如表2所示。從表中可以看出,正丁醇提取物中的總黃酮和總酚含量都是最高的,達到了3.35和18.40 mg/g;其次是乙酸乙酯提取物,含量分別是1.63和5.98 mg/g。總黃酮含量最低的是乙醇提取物,只有0.94 mg/g;總酚含量最低的是氯仿提取物,含有2.63 mg/g。植物多酚具有多元酚的結(jié)構(gòu),極性較大,易溶于正丁醇和乙酸乙酯中[21],因此,正丁醇和乙酸乙酯提取物中的總黃酮和總酚含量較高。
表2 總黃酮和總酚含量測定結(jié)果Table 2 Content of total flavonoids and total phenols
各提取物清除DPPH自由基的能力見圖1,由圖1可看出各提取物在試驗范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。當濃度從0.2增至1.0 mg/mL時,氯仿、乙醇和乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除率由17.4%、38.2%、49.8%分別上升至48.4%、91.1%、92.6%。當濃度為0.2 mg/mL時,正丁醇提取物的清除率已超過90%,遠優(yōu)于另外3個提取物,且與抗壞血酸較為接近。通過對各樣品溶液與清除率進行回歸分析,得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物清除DPPH自由基活性的IC50(清除50%的自由基所需要的樣品質(zhì)量濃度)值依次是0.965、0.243、0.114、0.326 mg/mL。顯然,對DPPH自由基清除能力最強的是正丁醇提取物,最弱的是氯仿提取物。
圖1 瓶爾小草提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of extracts from Ophiolossum vulgatum L.
將不同提取物的總酚、總黃酮含量測定結(jié)果與不同方法測得的抗氧化能力結(jié)果作了相關(guān)性分析,結(jié)果見表3。從表3可以看出,瓶爾小草提取物清除DPPH自由基的能力與總酚、總黃酮的相關(guān)系數(shù)分別為0.669和0.583,表明酚酸和黃酮類化合物為瓶爾小草中清除DPPH自由基的主要作用成分。
表3 抗氧化能力與總酚、總黃酮含量的相關(guān)性Table 3 Correlation analyses between antioxidant capacity with content of total flavonoids and total phenols
各提取物清除ABTS自由基的結(jié)果如圖2所示,正丁醇、乙酸乙酯和乙醇提取物在0.2~2 mg/mL的范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯,呈較好的線性關(guān)系。由線性方程計算出氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物清除ABTS自由基活性的IC50值分別為4.34、1.02、1.07和1.90 mg/mL。顯然,乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物清除能力較強,且很接近;氯仿提取物的清除能力明顯低于其它3種提取物。從表3可看出,ABTS自由基清除能力與樣品中總酚和總黃酮的含量具有較高的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.595和0.533,表明酚類和黃酮類化合物對ABTS自由基清除能力都有貢獻。
圖2 瓶爾小草提取物對ABTS自由基的清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging ability of extracts from Ophiolossum vulgatum L.
各提取物清除羥自由基的結(jié)果見圖3。由圖3可知,瓶爾小草各提取物對羥自由基的清除能力與濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,增幅明顯。由擬合的線性方程得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物羥自由基清除活性的IC50值分別為1.38、2.44、1.23、2.65 mg/mL。由IC50值可以推斷對羥自由基清除能力最好的是正丁醇提取物,其次是氯仿提取物,清除作用最弱的是乙醇提取物,四者的清除能力都弱于抗壞血酸。強弱趨勢與清除DPPH和ABTS自由基的趨勢不一樣,可能與樣品對各自由基的清除原理不同有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,樣品中總酚和總黃酮的含量與羥自由基清除能力具有較高的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.509和0.602,表明瓶爾小草中黃酮類化合物對羥自由基清除能力的貢獻大于酚酸類化合物。
圖3 瓶爾小草提取物對羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of extracts from Ophiolossum vulgatum L.
有文獻報導了提取物中較高的酚酸和黃酮含量與抗氧化活性呈正相關(guān)[22],本實驗結(jié)果與文獻的研究結(jié)果一致。瓶爾小草各提取物對自由基的清除活性具有差異性與總酚和總黃酮含量有關(guān),總酚和總黃酮含量最高的正丁醇提取物表現(xiàn)為抗氧化能力最強。
瓶爾小草各提取物對各供試菌的最低抑菌濃度見表4。由表4可知,4種瓶爾小草提取物對不同試驗菌的抑制性表現(xiàn)出明顯差別。氯仿提取物對大腸埃希菌抑制效果最好(MIC為1.25 mg/mL),但是對銅綠假單胞菌抑制效果最差。乙酸乙酯提取物對乙型溶血性鏈球菌的抑制效果很好(MIC為0.313 mg/mL),但是對大腸埃希菌和肺炎克雷伯氏菌的抑制效果最差。正丁醇提取物表現(xiàn)出較好的抑菌效果,除了大腸埃希菌,對于其它6種試驗菌的MIC均為4個提取物中最低。乙醇提取物對7種試驗菌的抑制效果一般,為4個提取物中最差??偟膩碚f,瓶爾小草各提取物都具有一定的抑菌作用,正丁醇提取物對其中6種試驗菌的抑制效果最強,說明其具有較強的廣譜抑菌性,提示其在呼吸科、皮膚科、外科及婦科等疾病治療方面有良好的應(yīng)用前景。正丁醇提取物對病原微生物具有較強的殺菌活性,這可能與其功能成分如多酚、黃酮類化合物的含量較高有關(guān)[23]。前人研究結(jié)果表明,植物多酚具有較強的抗病毒和抗菌作用[24]。
瓶爾小草各提取物對SKOV3卵巢癌細胞增殖的抑制活性結(jié)果見圖4。研究結(jié)果表明,提取物濃度在25~400 μg/mL濃度下與癌細胞共培養(yǎng)48 h,SKOV3細胞的增殖受到抑制,并呈劑量依賴關(guān)系。正丁醇提取物對SKOV3細胞的抑制活性最強,當樣品濃度為200、400 μg/mL時,正丁醇提取物的抑制率分別為82.5%和95.9%;其次是乙酸乙酯提取物,當樣品濃度為400 μg/mL時,其抑制率為52.3%。
圖4 瓶爾小草提取物對SKOV3細胞增殖的抑制作用Fig.4 Proliferation inhibition of SKOV3 cells of extracts from Ophiolossum vulgatum L.
進一步研究正丁醇提取物對U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤細胞的抑制作用,并與它對SKOV3卵巢癌細胞的作用結(jié)果相比較,見圖5。從圖中可看出,瓶爾小草正丁醇提取物對3種癌細胞都比較敏感,對SKOV3卵巢癌細胞的抑制作用最強,其次是對U251腦膠質(zhì)瘤細胞,最后是A375黑色素瘤細胞。通過軟件數(shù)據(jù)分析,得到IC50依次是114.5、160.5、196.9 μg/mL。本實驗中,瓶爾小草正丁醇提取物的總酚和總黃酮含量都是4種提取物中最高的,其較強的細胞增殖抑制作用,可能是由于其酚類和黃酮類等活性化合物的存在所致。這與以前的研究吻合,植物來源的酚類化合物已被證明能抑制或延緩癌細胞的增殖[25-26]。
圖5 瓶爾小草正丁醇提取物對不同腫瘤細胞生長的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of the n-butanol extract from Ophiolossum vulgatum L. on the growth of different tumor cells
本研究通過對DPPH·、ABTS+、羥自由基的清除能力的測定來評價瓶爾小草提取物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)瓶爾小草的不同溶劑提取物都具有一定的抗氧化活性,其中正丁醇提取物的抗氧化活性較強。此外,在抑菌活性測試實驗中,各提取物在一定程度上可以抑制7種試驗菌的生長,其中正丁醇提取物表現(xiàn)出較強的廣譜抑菌性。在癌細胞抗增殖試驗中,正丁醇提取物對SKOV3卵巢癌細胞、U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤的細胞增殖均具有一定的抑制作用。相關(guān)性分析表明,瓶爾小草提取物的抗氧化能力與總酚、總黃酮含量正相關(guān)。正丁醇提取物的總酚、總黃酮含量在4種瓶爾小草提取物中最高,其對DPPH自由基的清除效果最佳,IC50為0.114 mg/mL;對乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠球菌的MIC最低,為0.313 mg/mL;對SKOV3卵巢癌細胞的抑制作用最強,IC50為114.5 μg/mL。因此,可將瓶爾小草正丁醇提取物作為下一步研究重點,分離有效活性成分,確定其化學組成和結(jié)構(gòu),開發(fā)出安全有效的抗氧化劑、抑菌劑和抗癌藥,以用于食品與醫(yī)藥領(lǐng)域。