• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    瓶爾小草不同溶劑提取物的體外生物活性

    2021-11-14 11:24:08曾永芳廖華珍許海棠韋貽春
    食品工業(yè)科技 2021年22期
    關(guān)鍵詞:吸光正丁醇總酚

    曾永芳,廖華珍,許海棠, ,王 聰,韋貽春

    (1.貴港市疾病預防控制中心,廣西貴港 537100;2.廣西民族大學化學化工學院,廣西南寧 530006)

    瓶爾小草(OphioglossumvulgatumL.),又名一支箭、一枝槍、矛盾草等,為蕨類植物,廣泛分布于云南、貴州、四川、廣西等地。瓶爾小草是我國民間一味重要的中藥,具有清熱涼血、解毒鎮(zhèn)痛之功效。常用于治療肺熱咳嗽、小兒高熱驚風、目赤腫痛、胃痛、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、跌打腫痛等癥[1]。目前,從瓶爾小草同屬植物中鑒別分離得到的化合物有氨基酸、有機酸、黃酮類、甾體類及多糖等[2-4]。文獻已報道其不僅具有抗病毒、抗?jié)冏饔?,還具有一定的抗腫瘤作用[5-7]。但是,關(guān)于瓶爾小草的抗氧化、抑菌和抗增殖方面的研究較少見報道。

    越來越多的證據(jù)表明許多疾病都與自由基有關(guān),自由基進入細胞破壞DNA,引起細胞損傷、死亡,并引發(fā)許多慢性疾病,例如心腦血管疾病、帕金森氏病和癌癥等[8]。因此,利用抗氧化劑有效抑制自由基的氧化反應(yīng)至關(guān)重要[9]。然而,研究表明,合成抗氧化劑具有一定的肝臟毒性和致癌作用[10-11],因此,開發(fā)和利用安全有效的天然抗氧化劑成為研究熱點。近年來,天然產(chǎn)物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到人們的關(guān)注[9,12]。多酚類化合物普遍存在天然綠色植物中,研究發(fā)現(xiàn)植物多酚可以通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和增強體內(nèi)抗氧化酶活性等方面發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]。

    為了研究瓶爾小草的抗氧化、抑菌和抗增殖活性,本實驗對瓶爾小草進行脫脂,然后分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇加以提取,獲得不同的提取物。通過測定瓶爾小草各提取物對DPPH自由基,ABTS自由基和羥自由基的清除率進行抗氧化能力的評估;并測定其對6種常見致病菌和1種真菌的最低抑菌濃度,用以評價瓶爾小草不同溶劑提取物的抑菌性;還采用MTT法考察其對3種癌細胞的增殖抑制作用,以期為瓶爾小草的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    瓶爾小草 廣西玉林中藥材市場提供,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定為瓶爾小草(Ophiolossum vulgatumL.)的干燥莖葉;二苯代苦味酰、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 Sigmaaldrich公司;金黃色葡萄球菌CMCC26003、普通變形桿菌CMCC49027、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、大腸埃希菌CMCC44102、銅綠假單胞菌CMCC 10104、乙型溶血性鏈球菌ATCC21059、白色念珠球菌ATCC10231 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供;細胞:SKOV3卵巢癌細胞 廣西醫(yī)科大學提供,U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤 南京科佰生物科技有限公司提供;細菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶EDTA消化液等 為國產(chǎn)生物制劑;所有分離測試用的試劑 均為分析純;水為自制超純水。

    全波長酶標儀 Thermo Labsystems公司;CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司;5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher scientific公司;RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SPX-500生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;CMP-TA-20L型超純水器 成都優(yōu)越科技有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 不同溶劑提取物的制備 稱取干燥的瓶爾小草100 g,剪碎,用800 mL石油醚回流2 h后,取濾渣,揮干溶劑,加入800 mL的氯仿回流提取2次,每次2 h,合并兩次濾液,得氯仿提取液。同法,取揮干石油醚的濾渣,分別加入適量乙酸乙酯、正丁醇、乙醇回流提取2次,分別收集濾液。旋蒸提取液,真空干燥后得到瓶爾小草的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇的4種極性溶劑提取物,儲存于-20 ℃待用。

    1.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取各提取物,加入1 mL的二甲基亞砜(DMSO),超聲波超聲助溶,抗氧化實驗需配成20 mg/mL的樣品溶液,抑菌實驗需配成250 mg/mL的樣品溶液,抗增殖實驗需配成40 mg/mL的樣品溶液,測試之前用相應(yīng)溶劑稀釋至適宜濃度。

    1.2.3 總黃酮含量的測定 蘆丁標準曲線繪制:取6個25 mL容量瓶,分別加入蘆丁對照品溶液(0.128 mg/mL)2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL,加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL,振搖,靜置6 min;再加入10%的硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,6 min后加入10.0 mL氫氧化鈉試液(1 mol/L),加60%乙醇溶液定容,搖勻,放置15 min。以不含蘆丁的上述混合溶液為空白溶液,在510 nm處測定吸光值[15]。繪制標準曲線,得方程Y=12.036X+0.0012,r=0.9999,其中,Y為吸光度值,X為濃度值,單位為mg/mL。

    樣品總黃酮含量測定:精密量取樣品溶液1.0 mL,置于50 mL量瓶中,按上述方法操作測定吸光值,并計算總黃酮含量,結(jié)果以蘆丁當量(每克提取物相當于蘆丁的毫克數(shù))表示。

    1.2.4 總酚含量的測定 沒食子酸標準曲線繪制 取一批試管,分別加入不同濃度沒食子酸標準溶液(20、40、60、80、100 μg/mL)0.1 mL,加入0.5 mL福林酚試劑和7.9 mL水,避光放置5 min,加入1.5 mL碳酸鈉溶液(10%,w/v),避光放置2 h后在765 nm波長處測定吸光值[15]。繪制標準曲線,得方程Y=0.0106X+0.174,r=0.9991,其中,Y為吸光度值,X為濃度值,單位為μg/mL。

    樣品總酚含量測定:精密量取樣品溶液各0.1 mL,置于試管中,按上述方法處理后測定吸光值,計算總酚含量,結(jié)果以沒食子酸當量(每克提取物相當于沒食子酸的毫克數(shù))表示。

    1.2.5 抗氧化活性的測定 本實驗主要是通過測定瓶爾小草各溶劑提取物對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力來評價其抗氧化活性。

    參照文獻[16]測定瓶爾小草各提取物的DPPH自由基清除能力。配制DPPH溶液(0.1 mmol/L)以及不同濃度的各提取物溶液,按文獻方法分別取兩種溶液等體積混勻,避光放置30 min,以抗壞血酸溶液為對照,在517 nm處測定吸光度。計算清除率的公式如下:

    式中,A1為 DPPH溶液+樣品溶液的吸光值;A2為樣品溶液+無水乙醇的吸光值;A0為DPPH溶液+無水乙醇的吸光值。

    測定ABTS自由基清除率,參照吳豐鵬等[17]的方法配制ABTS+工作液,精密吸取ABTS+溶液3.8 mL和樣品溶液0.2 mL混合搖勻,6 min后在734 nm波長處測定吸光值,清除率的計算公式為:

    式中,A0為空白溶液的吸光值,As為樣品溶液吸光值。

    羥自由基清除能力的測定參考夏秀芳等[18]的方法,實驗前配制好不同濃度的樣品溶液,抗壞血酸溶液以及反應(yīng)需要的各溶液:磷酸鹽緩沖液(pH=7.4),鄰菲羅啉溶液(5 mmol/L),硫酸亞鐵溶液(7.5 mmol/L)和1%雙氧水溶液。按表1依次加入各溶液分別配制損傷管,未損傷管和樣品管。將管中溶液充分混合均勻后,置于37 ℃水浴反應(yīng)1 h,在536 nm處測吸光值。樣品管、損傷管和未損傷管測得的吸光值分別記為A樣、A損、A未損,清除率計算公式為:

    表1 配制各試驗管所需溶液(mL)Table 1 Preparation of solutions for test tubes(mL)

    1.2.6 抑菌活性的測試 參照文獻[19],采用微量二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。在聚乙烯96孔板上進行:先往每個孔加入液體培養(yǎng)基100 μL,然后吸取滅菌的樣品溶液(10 mg/mL)100 μL加入第1孔中,混勻后吸取100 μL加入到第2孔中,依此類推,得到一系列濃度的樣品孔。每個樣品做3個平行試驗行。向樣品孔中加入100 μL檢驗菌液(106CFU/mL);陽性對照孔只加液體培養(yǎng)基和菌液;陰性對照孔不加菌液。實驗結(jié)束后,將各細菌試驗板置于生化培養(yǎng)箱中,設(shè)定37 ℃培養(yǎng)24 h;白色念珠球菌試驗板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,觀察結(jié)果。

    1.2.7 抗腫瘤活性測定 采用MTT法,參照文獻[20]進行測定。SKOV3卵巢癌細胞經(jīng)過活化培養(yǎng)后,將細胞懸液的密度控制在1×105個/mL,分別取100 μL接種于96孔板中,并于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后,將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸出,將含有不同終濃度(0、25、50、100、200、400 μg/mL)樣品溶液的培養(yǎng)基100 μL加入到96孔板中,并培養(yǎng)48 h。每個梯度接種5個平行孔。培養(yǎng)完全后,吸去上清液,向各孔中加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔內(nèi)的上清液,每孔再加入100 μL DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,在490 nm處測定各孔吸光度值。細胞增殖抑制率的計算公式為:

    式中,As為加藥孔的吸光值,Ac為對照孔(含有細胞,不加藥物處理)的吸光值,Ab為空白孔(只加培養(yǎng)基)的吸光值。

    本實驗中考察了正丁醇提取物對U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤癌細胞的抗增殖作用,按上述同法操作。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有實驗分別取樣重復測定3次,結(jié)果用平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS17. 0軟件處理,并采用Origin8.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總黃酮和總酚含量

    瓶爾小草4種溶劑提取物的總黃酮和總酚含量如表2所示。從表中可以看出,正丁醇提取物中的總黃酮和總酚含量都是最高的,達到了3.35和18.40 mg/g;其次是乙酸乙酯提取物,含量分別是1.63和5.98 mg/g。總黃酮含量最低的是乙醇提取物,只有0.94 mg/g;總酚含量最低的是氯仿提取物,含有2.63 mg/g。植物多酚具有多元酚的結(jié)構(gòu),極性較大,易溶于正丁醇和乙酸乙酯中[21],因此,正丁醇和乙酸乙酯提取物中的總黃酮和總酚含量較高。

    表2 總黃酮和總酚含量測定結(jié)果Table 2 Content of total flavonoids and total phenols

    2.2 DPPH自由基清除能力

    各提取物清除DPPH自由基的能力見圖1,由圖1可看出各提取物在試驗范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。當濃度從0.2增至1.0 mg/mL時,氯仿、乙醇和乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除率由17.4%、38.2%、49.8%分別上升至48.4%、91.1%、92.6%。當濃度為0.2 mg/mL時,正丁醇提取物的清除率已超過90%,遠優(yōu)于另外3個提取物,且與抗壞血酸較為接近。通過對各樣品溶液與清除率進行回歸分析,得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物清除DPPH自由基活性的IC50(清除50%的自由基所需要的樣品質(zhì)量濃度)值依次是0.965、0.243、0.114、0.326 mg/mL。顯然,對DPPH自由基清除能力最強的是正丁醇提取物,最弱的是氯仿提取物。

    圖1 瓶爾小草提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of extracts from Ophiolossum vulgatum L.

    將不同提取物的總酚、總黃酮含量測定結(jié)果與不同方法測得的抗氧化能力結(jié)果作了相關(guān)性分析,結(jié)果見表3。從表3可以看出,瓶爾小草提取物清除DPPH自由基的能力與總酚、總黃酮的相關(guān)系數(shù)分別為0.669和0.583,表明酚酸和黃酮類化合物為瓶爾小草中清除DPPH自由基的主要作用成分。

    表3 抗氧化能力與總酚、總黃酮含量的相關(guān)性Table 3 Correlation analyses between antioxidant capacity with content of total flavonoids and total phenols

    2.3 ABTS自由基清除能力

    各提取物清除ABTS自由基的結(jié)果如圖2所示,正丁醇、乙酸乙酯和乙醇提取物在0.2~2 mg/mL的范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯,呈較好的線性關(guān)系。由線性方程計算出氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物清除ABTS自由基活性的IC50值分別為4.34、1.02、1.07和1.90 mg/mL。顯然,乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物清除能力較強,且很接近;氯仿提取物的清除能力明顯低于其它3種提取物。從表3可看出,ABTS自由基清除能力與樣品中總酚和總黃酮的含量具有較高的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.595和0.533,表明酚類和黃酮類化合物對ABTS自由基清除能力都有貢獻。

    圖2 瓶爾小草提取物對ABTS自由基的清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging ability of extracts from Ophiolossum vulgatum L.

    2.4 羥自由基清除能力

    各提取物清除羥自由基的結(jié)果見圖3。由圖3可知,瓶爾小草各提取物對羥自由基的清除能力與濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,增幅明顯。由擬合的線性方程得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物羥自由基清除活性的IC50值分別為1.38、2.44、1.23、2.65 mg/mL。由IC50值可以推斷對羥自由基清除能力最好的是正丁醇提取物,其次是氯仿提取物,清除作用最弱的是乙醇提取物,四者的清除能力都弱于抗壞血酸。強弱趨勢與清除DPPH和ABTS自由基的趨勢不一樣,可能與樣品對各自由基的清除原理不同有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,樣品中總酚和總黃酮的含量與羥自由基清除能力具有較高的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.509和0.602,表明瓶爾小草中黃酮類化合物對羥自由基清除能力的貢獻大于酚酸類化合物。

    圖3 瓶爾小草提取物對羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of extracts from Ophiolossum vulgatum L.

    有文獻報導了提取物中較高的酚酸和黃酮含量與抗氧化活性呈正相關(guān)[22],本實驗結(jié)果與文獻的研究結(jié)果一致。瓶爾小草各提取物對自由基的清除活性具有差異性與總酚和總黃酮含量有關(guān),總酚和總黃酮含量最高的正丁醇提取物表現(xiàn)為抗氧化能力最強。

    2.5 MIC測定結(jié)果

    瓶爾小草各提取物對各供試菌的最低抑菌濃度見表4。由表4可知,4種瓶爾小草提取物對不同試驗菌的抑制性表現(xiàn)出明顯差別。氯仿提取物對大腸埃希菌抑制效果最好(MIC為1.25 mg/mL),但是對銅綠假單胞菌抑制效果最差。乙酸乙酯提取物對乙型溶血性鏈球菌的抑制效果很好(MIC為0.313 mg/mL),但是對大腸埃希菌和肺炎克雷伯氏菌的抑制效果最差。正丁醇提取物表現(xiàn)出較好的抑菌效果,除了大腸埃希菌,對于其它6種試驗菌的MIC均為4個提取物中最低。乙醇提取物對7種試驗菌的抑制效果一般,為4個提取物中最差??偟膩碚f,瓶爾小草各提取物都具有一定的抑菌作用,正丁醇提取物對其中6種試驗菌的抑制效果最強,說明其具有較強的廣譜抑菌性,提示其在呼吸科、皮膚科、外科及婦科等疾病治療方面有良好的應(yīng)用前景。正丁醇提取物對病原微生物具有較強的殺菌活性,這可能與其功能成分如多酚、黃酮類化合物的含量較高有關(guān)[23]。前人研究結(jié)果表明,植物多酚具有較強的抗病毒和抗菌作用[24]。

    2.6 抗增殖測定結(jié)果

    瓶爾小草各提取物對SKOV3卵巢癌細胞增殖的抑制活性結(jié)果見圖4。研究結(jié)果表明,提取物濃度在25~400 μg/mL濃度下與癌細胞共培養(yǎng)48 h,SKOV3細胞的增殖受到抑制,并呈劑量依賴關(guān)系。正丁醇提取物對SKOV3細胞的抑制活性最強,當樣品濃度為200、400 μg/mL時,正丁醇提取物的抑制率分別為82.5%和95.9%;其次是乙酸乙酯提取物,當樣品濃度為400 μg/mL時,其抑制率為52.3%。

    圖4 瓶爾小草提取物對SKOV3細胞增殖的抑制作用Fig.4 Proliferation inhibition of SKOV3 cells of extracts from Ophiolossum vulgatum L.

    進一步研究正丁醇提取物對U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤細胞的抑制作用,并與它對SKOV3卵巢癌細胞的作用結(jié)果相比較,見圖5。從圖中可看出,瓶爾小草正丁醇提取物對3種癌細胞都比較敏感,對SKOV3卵巢癌細胞的抑制作用最強,其次是對U251腦膠質(zhì)瘤細胞,最后是A375黑色素瘤細胞。通過軟件數(shù)據(jù)分析,得到IC50依次是114.5、160.5、196.9 μg/mL。本實驗中,瓶爾小草正丁醇提取物的總酚和總黃酮含量都是4種提取物中最高的,其較強的細胞增殖抑制作用,可能是由于其酚類和黃酮類等活性化合物的存在所致。這與以前的研究吻合,植物來源的酚類化合物已被證明能抑制或延緩癌細胞的增殖[25-26]。

    圖5 瓶爾小草正丁醇提取物對不同腫瘤細胞生長的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of the n-butanol extract from Ophiolossum vulgatum L. on the growth of different tumor cells

    3 結(jié)論

    本研究通過對DPPH·、ABTS+、羥自由基的清除能力的測定來評價瓶爾小草提取物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)瓶爾小草的不同溶劑提取物都具有一定的抗氧化活性,其中正丁醇提取物的抗氧化活性較強。此外,在抑菌活性測試實驗中,各提取物在一定程度上可以抑制7種試驗菌的生長,其中正丁醇提取物表現(xiàn)出較強的廣譜抑菌性。在癌細胞抗增殖試驗中,正丁醇提取物對SKOV3卵巢癌細胞、U251腦膠質(zhì)瘤和A375黑色素瘤的細胞增殖均具有一定的抑制作用。相關(guān)性分析表明,瓶爾小草提取物的抗氧化能力與總酚、總黃酮含量正相關(guān)。正丁醇提取物的總酚、總黃酮含量在4種瓶爾小草提取物中最高,其對DPPH自由基的清除效果最佳,IC50為0.114 mg/mL;對乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠球菌的MIC最低,為0.313 mg/mL;對SKOV3卵巢癌細胞的抑制作用最強,IC50為114.5 μg/mL。因此,可將瓶爾小草正丁醇提取物作為下一步研究重點,分離有效活性成分,確定其化學組成和結(jié)構(gòu),開發(fā)出安全有效的抗氧化劑、抑菌劑和抗癌藥,以用于食品與醫(yī)藥領(lǐng)域。

    猜你喜歡
    吸光正丁醇總酚
    正丁醇和松節(jié)油混合物對組織脫水不良的補救應(yīng)用
    凌云白毫總酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性
    金色的吸管
    大風子正丁醇部位化學成分的研究
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:48
    三葉青藤正丁醇部位化學成分的研究
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:08
    中華抱莖蓼正丁醇部位化學成分的研究
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:25
    你把空氣全部吸光
    初中生(2016年1期)2016-04-14 20:13:15
    半菁染料作為染料敏化太陽能電池吸光材料的理論研究
    丹參彌羅松酚的提取及總酚含量測定
    軟棗獼猴桃總酚的可見-近紅外漫反射光譜無損檢測
    食品科學(2013年8期)2013-03-11 18:21:26
    久久人妻av系列| 免费av不卡在线播放| 久久热精品热| 麻豆国产97在线/欧美| 观看美女的网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 高清在线国产一区| 国产黄片美女视频| 精品一区二区免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本在线视频免费播放| 激情在线观看视频在线高清| av国产免费在线观看| 午夜福利免费观看在线| 成人性生交大片免费视频hd| 99久久精品一区二区三区| av福利片在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久亚洲真实| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 有码 亚洲区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中文亚洲av片在线观看爽| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久久久久久大av| 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆av噜噜一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 最近在线观看免费完整版| av黄色大香蕉| 日本黄色视频三级网站网址| 精品乱码久久久久久99久播| 禁无遮挡网站| 亚洲三级黄色毛片| 日韩人妻高清精品专区| 乱人视频在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 午夜视频国产福利| 神马国产精品三级电影在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 桃色一区二区三区在线观看| 特级一级黄色大片| 久久精品国产自在天天线| 天美传媒精品一区二区| 亚洲久久久久久中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲片人在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 日本在线视频免费播放| 动漫黄色视频在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 桃红色精品国产亚洲av| 很黄的视频免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日本免费a在线| 18禁在线播放成人免费| 丰满乱子伦码专区| 午夜激情欧美在线| 欧美乱色亚洲激情| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 一区二区三区四区激情视频 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 91九色精品人成在线观看| 久久久久久久久中文| 欧美最黄视频在线播放免费| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美+日韩+精品| av国产免费在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成熟少妇高潮喷水视频| 熟女电影av网| 有码 亚洲区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成人一区二区视频在线观看| 久久人妻av系列| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩欧美在线二视频| 99热精品在线国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产一区二区激情短视频| 能在线免费观看的黄片| 日韩欧美在线乱码| 少妇丰满av| 亚洲av熟女| 中文字幕免费在线视频6| 国语自产精品视频在线第100页| 久久久久久久久大av| 毛片女人毛片| 麻豆一二三区av精品| 嫩草影视91久久| 国产精品精品国产色婷婷| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品99久久久久久久久| 日韩免费av在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 村上凉子中文字幕在线| 日本与韩国留学比较| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 能在线免费观看的黄片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99久久精品热视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产亚洲精品av在线| 嫩草影视91久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费看日本二区| 激情在线观看视频在线高清| АⅤ资源中文在线天堂| 国产亚洲欧美98| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲av.av天堂| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品不卡视频一区二区 | 亚洲第一电影网av| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品日韩av在线免费观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 一a级毛片在线观看| 午夜免费激情av| av在线老鸭窝| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲电影在线观看av| 91字幕亚洲| 国产精品影院久久| 露出奶头的视频| 国产69精品久久久久777片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 久久草成人影院| 亚洲av二区三区四区| 美女cb高潮喷水在线观看| 看免费av毛片| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜福利免费观看在线| 观看美女的网站| av视频在线观看入口| 久久久久久久午夜电影| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 桃色一区二区三区在线观看| 日本成人三级电影网站| 变态另类丝袜制服| 欧美极品一区二区三区四区| 1000部很黄的大片| 听说在线观看完整版免费高清| 中出人妻视频一区二区| 永久网站在线| av在线天堂中文字幕| 色av中文字幕| ponron亚洲| 欧美日韩乱码在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人三级黄色视频| 久久午夜亚洲精品久久| 国产毛片a区久久久久| 在线免费观看的www视频| 国产成人aa在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 99精品在免费线老司机午夜| 国内精品美女久久久久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 深夜精品福利| 舔av片在线| 在线观看午夜福利视频| 99热精品在线国产| 久久这里只有精品中国| 美女 人体艺术 gogo| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 黄色女人牲交| 久99久视频精品免费| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 91九色精品人成在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲最大成人手机在线| 中文资源天堂在线| 欧美精品国产亚洲| 成年免费大片在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品永久免费网站| 免费黄网站久久成人精品 | 欧美一区二区亚洲| 欧美乱妇无乱码| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产午夜精品论理片| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲,欧美精品.| 18美女黄网站色大片免费观看| 极品教师在线视频| 国产精品人妻久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 69av精品久久久久久| 欧美中文日本在线观看视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本a在线网址| 国产高清三级在线| 热99在线观看视频| 99久久精品国产亚洲精品| .国产精品久久| 国产三级黄色录像| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 观看美女的网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产中年淑女户外野战色| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 12—13女人毛片做爰片一| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美日本视频| 十八禁网站免费在线| 一级av片app| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 简卡轻食公司| 在线a可以看的网站| 欧美性感艳星| av专区在线播放| 一a级毛片在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 国产乱人伦免费视频| 九九热线精品视视频播放| 又爽又黄a免费视频| 亚洲美女黄片视频| 国产麻豆成人av免费视频| 麻豆成人av在线观看| 免费大片18禁| 成人精品一区二区免费| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲午夜理论影院| www.999成人在线观看| 极品教师在线视频| 男人舔奶头视频| 日本一二三区视频观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 色综合站精品国产| 亚洲在线观看片| eeuss影院久久| 一进一出抽搐动态| 成年女人看的毛片在线观看| 成人午夜高清在线视频| 国产精品不卡视频一区二区 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 天堂动漫精品| 国产精品永久免费网站| eeuss影院久久| 午夜激情福利司机影院| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 午夜福利视频1000在线观看| av天堂中文字幕网| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩欧美在线乱码| 国产精品三级大全| 久久伊人香网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲片人在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 天天躁日日操中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 日韩欧美国产在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲美女黄片视频| 久久久久久久久大av| 性色avwww在线观看| 欧美日本视频| 久久久久久大精品| av专区在线播放| 黄片小视频在线播放| 成人亚洲精品av一区二区| 此物有八面人人有两片| 听说在线观看完整版免费高清| 成人av在线播放网站| 亚洲在线自拍视频| 一个人看视频在线观看www免费| 免费看a级黄色片| av在线天堂中文字幕| 性欧美人与动物交配| 伊人久久精品亚洲午夜| 黄色女人牲交| 亚洲国产色片| 国产免费男女视频| 我的女老师完整版在线观看| 中国美女看黄片| 老女人水多毛片| 国语自产精品视频在线第100页| 十八禁网站免费在线| 久久午夜亚洲精品久久| 国产综合懂色| 成人特级黄色片久久久久久久| 综合色av麻豆| 中出人妻视频一区二区| 久久精品91蜜桃| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 搞女人的毛片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产精品久久视频播放| 成年免费大片在线观看| 18+在线观看网站| 亚洲电影在线观看av| 99久久精品热视频| www.www免费av| 精品一区二区三区av网在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品伦人一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品一区二区三区四区久久| 一本久久中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 2021天堂中文幕一二区在线观| 搡老妇女老女人老熟妇| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美三级亚洲精品| 波多野结衣高清作品| 久久伊人香网站| 丁香欧美五月| 老司机福利观看| 日本与韩国留学比较| 一进一出抽搐动态| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产三级中文精品| 国产日本99.免费观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 51国产日韩欧美| 动漫黄色视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av天堂中文字幕网| 亚州av有码| 一级作爱视频免费观看| av专区在线播放| 三级国产精品欧美在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 天天一区二区日本电影三级| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产探花极品一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜a级毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 中文字幕av成人在线电影| 可以在线观看的亚洲视频| 国内精品美女久久久久久| 午夜精品在线福利| ponron亚洲| 国产人妻一区二区三区在| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99在线视频只有这里精品首页| 身体一侧抽搐| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产乱人视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 热99re8久久精品国产| 日韩精品青青久久久久久| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品在线观看二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 午夜a级毛片| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲av.av天堂| 国产 一区 欧美 日韩| 香蕉av资源在线| 观看免费一级毛片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产av不卡久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线国产一区二区在线| 18禁在线播放成人免费| 亚洲国产精品合色在线| 最近最新免费中文字幕在线| 成年女人看的毛片在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 国产三级在线视频| 极品教师在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 精品久久久久久久久久久久久| 香蕉av资源在线| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲av免费在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产高清视频在线观看网站| 午夜视频国产福利| 日本免费a在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 婷婷精品国产亚洲av| 中国美女看黄片| 欧美三级亚洲精品| 一进一出抽搐动态| 成人国产一区最新在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 中文字幕av在线有码专区| 日韩欧美精品v在线| 嫩草影院入口| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 可以在线观看的亚洲视频| 嫩草影视91久久| 国产69精品久久久久777片| av国产免费在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 精品一区二区免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲av一区综合| 成人国产综合亚洲| 午夜福利视频1000在线观看| 国产高潮美女av| 很黄的视频免费| 一级a爱片免费观看的视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产高清视频在线观看网站| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av一区综合| 免费无遮挡裸体视频| 十八禁人妻一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 村上凉子中文字幕在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚州av有码| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲七黄色美女视频| 久久国产精品影院| 成人性生交大片免费视频hd| 国产真实伦视频高清在线观看 | 黄色日韩在线| 最近在线观看免费完整版| 动漫黄色视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费av观看视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲av美国av| 女人被狂操c到高潮| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99久久成人亚洲精品观看| 天堂√8在线中文| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利在线在线| 校园春色视频在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 看片在线看免费视频| 亚洲 国产 在线| 国产人妻一区二区三区在| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 俺也久久电影网| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 性插视频无遮挡在线免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 天美传媒精品一区二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 制服丝袜大香蕉在线| 色5月婷婷丁香| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产 一区 欧美 日韩| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧美激情综合另类| 国产一区二区三区视频了| 久久久久九九精品影院| 永久网站在线| 国产成人av教育| ponron亚洲| 成人av在线播放网站| 九九在线视频观看精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 99久久精品一区二区三区| 天堂动漫精品| 国产精品一区二区免费欧美| 香蕉av资源在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品久久电影中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| 成熟少妇高潮喷水视频| www日本黄色视频网| 亚洲男人的天堂狠狠| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品久久电影中文字幕| 一区福利在线观看| 97热精品久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 免费看a级黄色片| 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲熟妇熟女久久| 国产在线男女| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 成人特级av手机在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产三级黄色录像| 91狼人影院| 久久亚洲真实| 国产一区二区三区视频了| 国产成人av教育| 精品人妻视频免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 香蕉av资源在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美zozozo另类| 国语自产精品视频在线第100页| 国模一区二区三区四区视频| 精品不卡国产一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产乱人伦免费视频| 十八禁人妻一区二区| ponron亚洲| 色视频www国产| 亚洲国产精品sss在线观看| 内地一区二区视频在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | avwww免费| 又爽又黄a免费视频| 国产成年人精品一区二区| 亚洲三级黄色毛片| 麻豆国产97在线/欧美| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲无线在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美精品国产亚洲| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av.av天堂| 国产在线精品亚洲第一网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 色综合站精品国产| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美3d第一页| 久久精品影院6| 白带黄色成豆腐渣| 免费在线观看成人毛片| 亚洲av美国av| 黄色配什么色好看| 日韩 亚洲 欧美在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美色视频一区免费| 久久亚洲精品不卡| 欧美日本视频| 精品欧美国产一区二区三| 在线观看一区二区三区| 日韩欧美在线乱码| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美在线黄色| 99久久精品一区二区三区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜免费成人在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美激情在线99| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久人妻av系列| 两个人视频免费观看高清| 嫩草影视91久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 嫩草影院新地址| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 高清在线国产一区| 日本免费a在线| 久久久久久九九精品二区国产| 国产久久久一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品一区二区性色av| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品精品国产色婷婷| 麻豆久久精品国产亚洲av| 直男gayav资源| 午夜亚洲福利在线播放| 久久热精品热| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久久久精品吃奶| av中文乱码字幕在线| 看免费av毛片| 成人无遮挡网站| 亚洲精品成人久久久久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 午夜免费激情av| 少妇丰满av| 91九色精品人成在线观看| 简卡轻食公司| 亚洲,欧美精品.|