耐硒芽孢桿菌的篩選及其亞硒酸鹽還原機(jī)制的探究

楊 銳，余雍和，程水源,2,3, ，王璋倩,2,3,

（1.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院武漢輕工大學(xué)國(guó)家富硒農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)國(guó)家富硒農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，湖北武漢 430023；3.武漢輕工大學(xué)硒科學(xué)與工程現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，湖北武漢 430023）

硒對(duì)生物體而言是一種必不可少的微量元素，日常中補(bǔ)充不足會(huì)增加許多慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如血漿中硒濃度較低時(shí)前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加4～5倍[1]；當(dāng)人體血硒濃度低于45 μg/L以上時(shí)，其心血管疾病的發(fā)病率和病死率會(huì)增加2～3倍[2]；Peter等[3]在元素硒防治癌癥的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，8年后隨訪試驗(yàn)組患者癌癥病死率降低了48%。硒缺乏癥在世界各地的人群中普遍存在，因此，有必要在日糧中添加富硒食品來(lái)補(bǔ)充這種微量營(yíng)養(yǎng)素的不足。在膳食補(bǔ)充中，一般添加無(wú)機(jī)硒（如亞硒酸鹽）或有機(jī)硒（如硒代半胱氨酸）。無(wú)機(jī)硒不易被人體吸收且安全劑量范圍較窄，高濃度時(shí)存在一定的毒性，有機(jī)硒吸收與安全性相對(duì)較好，但自然界中含量少，生產(chǎn)成本高，因此尋求安全性更高且經(jīng)濟(jì)效益好的補(bǔ)硒方式迫在眉睫[4]。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)納米形態(tài)的單質(zhì)硒體內(nèi)活性強(qiáng)、毒性低、吸收好[5]。如從生物功效來(lái)看，納米硒表現(xiàn)出較高的自由基清除能力和抗癌活性，納米硒在體外清除羥基自由基的效率為無(wú)機(jī)硒的5倍，為有機(jī)硒的2.5倍[6]?；诩{米硒的特殊性質(zhì)，目前對(duì)硒功能化的研究正在迅猛發(fā)展[7]。

環(huán)境中微生物在硒的生物地球化學(xué)循環(huán)中起主要作用[8]。一些水生和土壤細(xì)菌已被證明能抵抗硒氧陰離子，并將其還原為元素硒或甲基化硒形式，從而降低生物利用率和毒性，在環(huán)境修復(fù)中也具有研究意義[9]。此外，利用微生物合成納米硒，生產(chǎn)成本低，而且生物法生成的納米硒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分散性好[10]。雖然近幾年對(duì)微生物還原亞硒酸鈉生成單質(zhì)硒的研究逐漸成為熱點(diǎn)，但是關(guān)于細(xì)菌細(xì)胞還原產(chǎn)生紅色單質(zhì)硒的機(jī)理研究較少，不同的細(xì)菌，由于所含酶類及參與氧化還原反應(yīng)物質(zhì)的不同，可能存在不同的還原機(jī)理。如生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等活性硫醇基團(tuán)能夠與亞硒酸鹽反應(yīng)生成納米硒（selenium nanoparticles,SeNPs），這被認(rèn)為是一種微生物的脫毒機(jī)制[11～12]。此外，研究表明[13]，在毫摩爾濃度的亞硒酸鹽生長(zhǎng)的枯草桿菌中大量誘導(dǎo)硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶。芽孢桿菌中硒還原的機(jī)制，以bacillithiol（煙酸硫醇）的參與為先決條件[14]。有關(guān)亞硒酸鹽在微生物中的轉(zhuǎn)化機(jī)制仍在不斷探索中。研究發(fā)現(xiàn)，微生物可在胞外或胞內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)還原積累SeNPs，如表1所示，不同的細(xì)菌還原酶系不同，對(duì)應(yīng)的酶還原活性部位也有所差異。

表1 部分微生物合成納米硒顆粒的特性Table 1 Characteristics of SeNPs synthesized by some microorganisms

芽孢桿菌（Bacillus）對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等處，大多數(shù)對(duì)人體無(wú)害，且具有利用價(jià)值。目前對(duì)芽孢桿菌亞硒酸鈉還原機(jī)理和納米硒形成機(jī)理研究較少。本文從長(zhǎng)期施加硒肥的大豆種植基地的土壤中篩選出一株耐硒能力較高的細(xì)菌高山芽孢桿菌（Bacillus altitudinisF4），探究該菌對(duì)亞硒酸鈉的還原作用。測(cè)定該細(xì)菌對(duì)亞硒酸鹽的耐受能力并對(duì)還原過(guò)程中其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行監(jiān)控。最后結(jié)合體外還原試驗(yàn)初步探究該菌亞硒酸鹽還原和單質(zhì)硒合成的可能機(jī)制，旨在為提高利用生物法合成納米硒的產(chǎn)率、富硒微生物的開發(fā)、富硒產(chǎn)品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采樣土壤 長(zhǎng)期施加硒肥的大豆種植基地；亞硒酸鈉（Na2SeO3） Sigma；酵母提取物、胰蛋白胨

青島海博生物；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂 武漢維基生物；還原型輔酶Ⅰ（NADH）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

HNY-2012C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；電子分析天平 賽多利斯科技有限公司；UV1802G型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Eppendorf公司；DYY-7型DNA電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選、分離及鑒定

1.2.1.1 菌種篩選及分離 土壤樣品選擇距地表10 cm深處。為了篩選得到芽孢桿菌，稱取土樣置于65 ℃的烘箱中1 h，后用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋。稀釋樣品涂布于LB平板上，33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分離純化的菌株接種到含Na2SeO3的培養(yǎng)基中，于33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后觀察菌落顏色。挑選紅色菌落進(jìn)行復(fù)篩，得到純化的亞硒酸鈉還原菌命名為F4用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1.2 菌株種屬鑒定 細(xì)菌的革蘭氏染色試驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)觀察在100×油鏡下進(jìn)行；細(xì)菌的生理生化鑒定試驗(yàn)按照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)要求進(jìn)行。

以提取的基因組DNA為模板，以通用引物27-F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492-R：5’-ACGGGCGGTGTGTRC-3’進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增。擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序；得到的序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行BLAST比對(duì)。利用MAGA 7.0采用鄰近法（Neighbour-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹。

細(xì)菌的革蘭氏染色試驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)觀察在100×油鏡下進(jìn)行；細(xì)菌的生理生化鑒定試驗(yàn)按照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)要求進(jìn)行。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 取適量菌液接種到含100 mL LB培養(yǎng)液的三角燒瓶中（OD600約為0.02），在33 ℃下培養(yǎng)，測(cè)定生長(zhǎng)曲線并檢測(cè)菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。不加亞硒酸鈉作為對(duì)照。在菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)前期加硒，測(cè)定菌株在含硒培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。將不同濃度的Na2SeO3加入細(xì)菌溶液中，至終濃度分別為25、50、100 mmoL/L，并在33 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，每2 h測(cè)量一次細(xì)胞濃度（OD600），并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 耐硒濃度測(cè)定 將菌株F4接種到LB液體培養(yǎng)基中搖培并進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定。待其在LB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，調(diào)節(jié)菌液濃度后按10～106進(jìn)行一系列梯度稀釋。取100 μL上述梯度稀釋菌液涂布于含50、100、150、200、250 mmoL/L亞硒酸鈉平板上，以不加硒作為對(duì)照組。涂布均勻后于33 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72 h。待長(zhǎng)出菌落形態(tài)后進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)公式計(jì)算菌株在不同亞硒酸鈉平板上的存活情況。

1.2.4 亞硒酸鹽還原活性分析

1.2.4.1 細(xì)胞組分蛋白的提取 取對(duì)數(shù)期菌株，6000×g下離心5 min，上清過(guò)0.2 μm濾膜，-20 ℃密封儲(chǔ)存?zhèn)溆谩３恋碇貞矣诹姿猁}緩沖鹽水（PBS，pH7.2）洗滌，并超聲處理3 min后，以6000×g離心5 min以去除細(xì)胞碎片。收集沉淀備用。再將上述菌體置于預(yù)冷后的研缽中，倒入液氮充分研磨，用預(yù)冷的PBS將破碎的菌體溶解，超聲（250 W，70次，間隔5 s）10 min，得到細(xì)胞研磨液。細(xì)胞研磨液于6000×g，4 ℃，離心5 min，得到的沉淀為細(xì)胞碎片，-20 ℃密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將上清（?xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的混合物）20000×g離心60 min，上清為細(xì)胞質(zhì)，沉淀為細(xì)胞膜，-20 ℃密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?。向上步得到的?xì)胞碎片中各加入1 mL的0.1%的Triton×100，振蕩均勻（約1 min），然后再于6000 ×g，4 ℃，離心5 min，收集上清，此為細(xì)胞周質(zhì)，-20 ℃密封儲(chǔ)存，備用[17]。

1.2.4.2 上清液的提取 將培養(yǎng)液4 ℃下12000×g，離心30 min，收集上清，過(guò)0.22 μm濾膜，備用。

1.2.4.3 胞外多糖（EPS）的提取 培養(yǎng)菌液于4 ℃下12000×g，離心30 min，收集上清，過(guò)0.22 μm濾膜，并用等體積預(yù)冷乙醇混合，-20 ℃下預(yù)冷沉淀。4 ℃下12000×g，離心30 min，收集沉淀即胞外多糖（EPS），用無(wú)菌ddH2O溶解。

1.2.4.4 硒還原活性檢測(cè) 使用以下反應(yīng)混合物測(cè)定亞硒酸鹽還原酶的活性：培養(yǎng)上清液，細(xì)胞質(zhì)和膜級(jí)分；亞硒酸鈉（終濃度為0.2 mmoL/L）；NADPH或NADH（終濃度為0.2 mmoL/L）。將反應(yīng)混合物在28 ℃下孵育36 h。分別以不添加培養(yǎng)上清液，細(xì)胞質(zhì)或膜級(jí)分的反應(yīng)混合物作為對(duì)照[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)。MAGA 7.0采用鄰近法（Neighbour-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)置為1000次。GraphPad Prism 8.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學(xué)和生理生化特征 在電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)是短桿狀的結(jié)構(gòu)見圖1。F4菌株在33 ℃下培養(yǎng)24 h后菌落形態(tài)為不透明，呈乳白色，表面有褶皺，邊緣完整，不粘稠。革蘭氏染色為陽(yáng)性。

圖1 F4菌株在LB平板上的菌落形態(tài)（a）和100倍電子顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology of F4 strain on LB plate (a) and 100-fold electron microscopic cell morphology (b)

菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表2。結(jié)果表明，菌株F4能分解利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖和阿拉伯糖，在明膠培養(yǎng)基中能分解明膠，氧化酶試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用、V-P試驗(yàn)和接觸酶實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。對(duì)照伯杰氏手冊(cè)符合芽孢桿菌屬的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 細(xì)菌F4生理生化特征Table 2 Biochemical and physiological characteristics of the bacterial isolate F4

2.1.2 菌種鑒定 通過(guò)16S rRNA測(cè)序鑒定，獲得的細(xì)菌16S rRNA序列在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與模式菌Bacillus altitudinis16S相似度為99.2%?；贜eighbour-Joining的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖2，菌株與高山芽孢桿菌Bacillus altitudinis聚在同一分支中，自檢支持率達(dá)96%，表明該菌株與Bacillus altitudinis有較高的同源性。綜上將該菌株命名為Bacillus altitudinisF4。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis

2.2 不同亞硒酸鈉濃度下菌株F4生長(zhǎng)曲線

通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線得知，菌株在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)過(guò)4 h的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)期。有研究表明加硒時(shí)間越早，對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)[23]。前期測(cè)定了F4的生長(zhǎng)曲線，分析得該菌株在4 h開始從延滯期過(guò)渡，在6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期（圖3中對(duì)照組（CK）即為不加硒時(shí)菌株生長(zhǎng)曲線）。本試驗(yàn)確定在菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)前期即6 h時(shí)添加亞硒酸鈉，此時(shí)菌株生長(zhǎng)相對(duì)較快且菌體密度可到最大。如圖3，試驗(yàn)觀察到添加亞硒酸鹽后8 h內(nèi)即菌株總培養(yǎng)14 h時(shí)，菌株的生長(zhǎng)與不加硒相比較緩慢，濃度到達(dá)100 mmoL/L時(shí)幾乎停滯生長(zhǎng)，過(guò)了該時(shí)期后菌株生長(zhǎng)16～48 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，50 h后到達(dá)穩(wěn)定期。如圖4，在前10 h時(shí)間內(nèi)，在其生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液首先變渾濁，然后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，從14 h后開始顏色慢慢由淡黃色變?yōu)樯罴t色，且添加亞硒酸鈉濃度越高，溶液顏色越淺。但到對(duì)數(shù)后期和穩(wěn)定期可以觀察到培養(yǎng)基中均會(huì)產(chǎn)生紅色沉淀，表明該菌株在含亞硒酸鹽的液體中會(huì)先生長(zhǎng)后發(fā)生還原反應(yīng)，且在生長(zhǎng)后會(huì)恢復(fù)原狀。在相對(duì)低濃度25和50 mmoL/L，其對(duì)數(shù)后期及穩(wěn)定期含Na2SeO3的吸光度值要高于不含Na2SeO3的LB培養(yǎng)液。在Avenda?o等[24]和袁永強(qiáng)等[25]的研究中也觀察到了同樣的現(xiàn)象，可能原因是Na2SeO3抑制細(xì)胞分裂而使細(xì)胞體積增大，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)后，細(xì)胞密度要大于對(duì)照，因而表現(xiàn)吸光度增加現(xiàn)象。Wang等[15]對(duì)Proteus mirabilisYC801的研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鹽的還原發(fā)生在指數(shù)生長(zhǎng)期后期直到穩(wěn)定期，而且與高濃度的亞硒酸鹽相比，該菌對(duì)低濃度的還原更快。但是Fernández-Llamosas等[26]發(fā)現(xiàn)固氮弧菌屬（Azoarcus）僅在穩(wěn)定期開始消耗亞硒酸鹽和形成納米硒。

圖3 不同亞硒酸鈉濃度下B. altitudinis F4生長(zhǎng)動(dòng)力曲線Fig.3 Growth curve of B. altitudinis F4 under different sodium selenite concentrations

圖4 在含亞硒酸鈉培養(yǎng)基中菌株分別在不同時(shí)間的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of strains in a medium containing sodium selenite at different time

2.3 菌株F4耐硒能力

如圖5可觀察到，在37 ℃下培養(yǎng)72 h后，與不加硒的LB平板（圖5a）相比，菌株在100 mmoL/L的含亞硒酸鈉平板（圖5b）中，形成的紅色菌落菌落大小明顯變小。

在較低濃度50 mmoL/L亞硒酸鈉平板中，菌株菌落生長(zhǎng)較好，存活率為37.08%（圖6）。在高濃度250 mmoL/L亞硒酸鈉平板中，觀察到3～6個(gè)單菌落，存活率較小。因此判斷B. altitudinisF4最高可耐250 mmoL/L亞硒酸鈉。濃度越高，對(duì)菌株抑制作用越強(qiáng)。菌落大小會(huì)隨著亞硒酸鈉濃度的升高而變小，這也表明了較高亞硒酸鈉對(duì)細(xì)菌具有毒害作用。已報(bào)道的微生物的耐硒濃度普遍在1～100 mmoL/L。沼澤紅假單胞菌N（Rhodopseudomonas palustrisN）耐硒濃度為8 mmoL/L[21]，鏈霉菌ES2-5（Streptomycessp.ES2-5）為80 mmoL/L[22]，奇異假單胞菌YC801（Proteus mirabilisYC801）最高耐硒濃度達(dá)100 mmoL/L[15]。B. altitudinisF4耐硒濃度可達(dá)250 mmoL/L，耐硒能力為較高水平。

圖6 在不同濃度亞硒酸鈉平板中B. altitudinis F4存活率Fig.6 Survival rate of B. altitudinis F4 in different concentrations of sodium selenite

2.4 納米硒合成部位的亞細(xì)胞定位

利用體外還原試驗(yàn)對(duì)亞硒酸鹽還原反應(yīng)在細(xì)菌培養(yǎng)中的定位進(jìn)行了研究，如圖7，分離得到的上清液組分中發(fā)現(xiàn)顏色變化明顯，有紅色沉淀生成，表明亞硒酸鹽的還原活性主要存在于上清液中，可能是含有某種生物活性分子。同時(shí)也觀察到在NADH存在的條件下，細(xì)胞質(zhì)中也有略微的還原活性，推測(cè)此反應(yīng)為酶促過(guò)程，因此需要電子供體。Lampis等[16]研究Bacillus mycoidesSeITE01還原活性機(jī)理發(fā)現(xiàn)在依賴于NADH亞硒酸鹽還原主要存在于膜組分，且在上清液中也有略微還原活性。因此，根據(jù)B.altitudinisF4還原亞硒酸鹽試驗(yàn)，推測(cè)該菌還原可能是由于細(xì)菌細(xì)胞釋放或在質(zhì)膜被激活的蛋白質(zhì)的作用，且在還原合成過(guò)程中起到一種還原酶的性質(zhì)。楊穎等[27]研究屬于β變形菌門的貪銅桿菌（Cupriavidussp. SHE）細(xì)胞組分合成納米硒能力的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清液具有更強(qiáng)的合成納米硒的能力，推測(cè)可能是貪銅桿菌能分泌某些生物活性分子，例如谷胱甘肽（glutathione，GSH）等，能在胞外作為還原劑還原亞硒酸鈉為單質(zhì)納米硒顆粒。有研究發(fā)現(xiàn)多種芽孢桿菌如Bacillus megaterium[11]、Bacillus selenitireducens[20]、Bacillus subtilis[13]與亞硒酸鹽作用之后能夠誘導(dǎo)硫氧還蛋白與硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)。在B.altitudinisF4還原過(guò)程中硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶或其他酶系在還原過(guò)程中起作用需在未來(lái)試驗(yàn)中進(jìn)一步考察研究。

圖7 對(duì)具有亞硒酸鹽還原活性的不同細(xì)胞部位和培養(yǎng)液進(jìn)行酶促測(cè)定Fig.7 Enzymatic assay on different cell compartments or culture broth fractions with selenite reduction activity

3 討論

本試驗(yàn)篩選出了一株耐硒能力較強(qiáng)的高山芽孢桿菌（Bacillus altitudinisF4），確定了在平板培養(yǎng)中菌株的最高耐硒濃度，測(cè)定了菌株生長(zhǎng)動(dòng)力曲線。大多數(shù)文章在探究菌株對(duì)亞硒酸鈉的耐硒能力時(shí)，以菌株與不同濃度硒共發(fā)酵過(guò)程中的顏色變化為指標(biāo)來(lái)確定菌株最高耐硒濃度，這種方法主觀性較強(qiáng)。本試驗(yàn)在該基礎(chǔ)上，將一系列濃度梯度的菌液分別涂布在不同濃度的亞硒酸鈉平板上，根據(jù)平板菌落數(shù)計(jì)算存活率來(lái)確定最高耐硒濃度平板，B. altitudinisF4耐硒能力較強(qiáng)，這為找尋其還原的部位、還原機(jī)理提供很好的材料。圖5 菌株F4分別在LB（a）和100 mmol/L亞硒酸鈉（b）平板中菌株菌落形態(tài)

Fig.5 Morphology of bacterial F4 colonies in LB (a) and 100 mmoL/L sodium selenite plates (b)本文通過(guò)體外進(jìn)行亞硒酸鹽還原試驗(yàn)，初步判斷納米硒合成的機(jī)制。在試驗(yàn)中觀察到上清液顏色變化明顯，有紅色沉淀，表明SeNPs合成主要存在于上清液中。同時(shí)也觀察到在NADH存在的條件下，細(xì)胞質(zhì)中也有略微的還原活性。該菌合成納米硒可能是由于分泌了某種活性分子，在還原過(guò)程中起到還原酶的作用。但是關(guān)于導(dǎo)致亞硒酸鹽離子還原為元素硒形式的確切機(jī)制沒(méi)有闡明，推測(cè)可能是某些生化還原劑僅通過(guò)對(duì)前體“應(yīng)激”的反應(yīng)而被微生物排出[18]。細(xì)菌還原亞硒酸鹽的不同酶系分布在細(xì)胞不同的部位。如Burkholderia fungorum[19]存在于細(xì)胞質(zhì)中；Thauera selenatis菌的周質(zhì)中[28]；在Rhodobactersp. NKPB030619菌株的細(xì)胞外及EPS發(fā)現(xiàn)還原活性[29]。目前關(guān)于各種酶介導(dǎo)微生物還原亞硒酸鈉的可能機(jī)制主要有谷胱甘肽和谷胱甘肽還原酶途徑；硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶途徑；亞硫酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶途徑[30]，還有其他物質(zhì)或酶介導(dǎo)，如Shewanella oneidensisMR-1周質(zhì)中的富馬酸酯還原酶（Fumarate reductase）[31]。有關(guān)介導(dǎo)B. altitudinisF4合成納米硒的生物活性因子或酶系種類的確定，后期階段將繼續(xù)進(jìn)行更多的試驗(yàn)來(lái)探究亞硒酸鹽的還原過(guò)程中的機(jī)理和納米硒的合成機(jī)制。最終以期得到工業(yè)化菌株，以此能大規(guī)模利用細(xì)菌合成納米硒，應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)、藥物開發(fā)等領(lǐng)域[32-34]。