繡球菌中抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的篩選及作用機(jī)理

吳 勇，王澤玉，周 娜，趙 福，趙佳山，李耘業(yè)，王 欣，李金杰

（北京聯(lián)合大學(xué)，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

繡球菌（Sparassis crispa）屬無(wú)褶菌目繡球菌科繡球菌屬，主要分布在全球的北溫帶地區(qū)，生長(zhǎng)在針葉樹(shù)種的樹(shù)樁上，是一種名貴珍稀藥食兩用的大型真菌[1]。該菌不僅味道鮮美，且具有多種營(yíng)養(yǎng)和保健功能[2]。文獻(xiàn)報(bào)道其提取物具有抑菌、降脂[3]、抗腫瘤[4]、增強(qiáng)造血功能、降壓、降糖[5]、抗炎[6]和抗氧化等藥理活性[7-9]。我國(guó)從80年代開(kāi)始對(duì)繡球菌進(jìn)行人工栽培，2005年栽培成功，目前已有6家工廠實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)，日產(chǎn)約10萬(wàn)袋（220 g/袋）。但繡球菌目前在我國(guó)還主要用作食材，開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品僅有少量袋泡茶和保健食品[10]。我國(guó)對(duì)繡球菌中活性組分的研究和開(kāi)發(fā)不足，嚴(yán)重制約了繡球菌高附加值利用和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

隨著世界人口老齡化加劇與人們生活方式的改變，我國(guó)糖尿病成人患病者已達(dá)1.198億，預(yù)計(jì)到2045年全球糖尿病患者將達(dá)6.29億[11]。糖尿病是人體產(chǎn)生和（或）利用胰島素障礙、導(dǎo)致血糖升高的一種慢性疾病，可引起心腦疾病、失明、腎衰和下肢截肢等嚴(yán)重并發(fā)癥[12-14]；其中，Ⅱ型糖尿病占所有類型糖尿病的90%以上[15-17]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)糖尿病沒(méi)有根治的辦法，降低餐后血糖是一個(gè)主要治療措施。α-葡萄糖苷酶抑制劑是臨床降低Ⅱ型糖尿病患者餐后血糖比較安全的一線藥物之一，其主要藥理機(jī)制是抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶活性而延緩碳水化合物的轉(zhuǎn)化，從而降低餐后血糖；但長(zhǎng)期服用仍有嘔吐、惡心和肝腎損失等副作用[18-19]。因此，從無(wú)毒、易得、可大規(guī)模生產(chǎn)、具有降糖作用的可食用繡球菌中發(fā)現(xiàn)抑制α-葡萄糖苷酶的組分，將為開(kāi)發(fā)出預(yù)防或延緩Ⅱ型糖尿病的功能食品提供科學(xué)的理論依據(jù)。

截至目前，盡管有繡球菌調(diào)節(jié)血糖、預(yù)防或治療糖尿病的多項(xiàng)專利產(chǎn)品[20-23]，但降糖的基礎(chǔ)研究報(bào)道卻寥寥無(wú)幾。僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道了繡球菌提取物對(duì)高血糖大鼠的降糖功效[5]，還有一篇文獻(xiàn)報(bào)道繡球菌中的2個(gè)脂肪酸類成分具有降糖作用[24]。但是，目前關(guān)于其主要降糖作用活性組分及其干預(yù)II型糖尿病的靶點(diǎn)機(jī)制缺乏整體系統(tǒng)研究，更未見(jiàn)其關(guān)于抑制α-葡萄糖苷酶的報(bào)道。因此，本項(xiàng)目以繡球菌為研究對(duì)象，經(jīng)提取、萃取、大孔吸附樹(shù)脂分離純化分成不同極性的多個(gè)組分后，用體外抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試，明確抑制活性組分；再運(yùn)用酶促動(dòng)力學(xué)和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法探討最佳抑制活性組分的作用機(jī)制，為繡球菌的降糖功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及其后期質(zhì)量檢測(cè)提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繡球菌Sparassis crispa，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)劉靖宇教授提供；α-葡萄糖苷酶（100 U）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖 上海晶純生化科技股份有限公司；HP-20型大孔吸附樹(shù)脂 日本三菱公司；所有有機(jī)溶劑 均為分析純，北京化工廠。

TRU-SWEEP D型超聲波清洗器 美國(guó)CREST公司；Sartorius BP121s型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；Milli-Q型制水機(jī)美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 繡球菌活性組分的提取 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩組不同乙醇濃度的提取方法，一組選用95%、80%、65%這三個(gè)濃度梯度提取，這種方法能更為全面地將小極性、中等極性組分提取出來(lái)；另一組用50%恒濃度提取，主要用來(lái)提取大量的中等及大極性成分。具體方法：將干燥繡球菌用粉粹機(jī)粉碎后，過(guò)50目篩備用。稱取上述粉末500 g兩份，一份用95%、80%、65%乙醇依次超聲提取，每種濃度提取1次，每次提取時(shí)間為90 min，超聲功率為420 W，合并3次提取液，將其減壓濃縮得到繡球菌提取物1（編號(hào)為HBR-1）；另一份用50%乙醇超聲提取3次，每次提取時(shí)間為90 min，超聲功率為420 W，合并3次提取液，將其減壓濃縮得到繡球菌提取物2（編號(hào)為HBR-2）。

1.2.2 繡球菌提取物的初步萃取分離 將上述得到的提取物HBR-1和HBR-2超聲，將其分散于水中后，每次加入500 mL乙酸乙酯，萃取3遍，每次40 min，得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯相減壓濃縮蒸干，編號(hào)分別為HBR-1-Y和HBR-2-Y；將萃取后剩余水相用大孔吸附樹(shù)脂分離純化，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和95%乙醇洗脫，每個(gè)提取物分別獲得五個(gè)組分，依次編號(hào)為HBR-1-1、HBR-1-2、HBR-1-3、HBR-1-4和HBR-1-5，HBR-2-1、HBR-2-2、HBR-2-3、HBR-2-4和HBR-2-5。

1.2.3 提取物、各組分抑制α-葡萄糖苷酶的活性測(cè)試 將1.2.1得到的兩個(gè)粗提物和1.2.2得到的12個(gè)組分各稱取5.0 mg左右，用pH7.0，200 mmol/L的PBS溶解，將總提取物HBR-1和HBR-2配成濃度為5 mg/mL，其余各組分配成0.5 mg/mL的待測(cè)液?；钚詼y(cè)試采用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷法（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG法）[25]，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，分為實(shí)驗(yàn)組、背景組、對(duì)照組和空白組。各組所加試劑見(jiàn)表1。每組都是將樣品或PBS與α-葡萄糖苷酶在37 ℃恒溫箱下培養(yǎng)15 min后，再加底物PNPG，混勻后再在37 ℃恒溫箱下培養(yǎng)20 min，每孔加Na2CO3終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定OD值（A），每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算抑制率，公式如下：

表1 α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)反應(yīng)體系（μL）Table 1 Reaction system of inhibition activity against α-glucosidase(μL)

式中：I表示抑制率，%；A對(duì)照表示對(duì)照組的吸光值；A空白表示空白組的吸光值；A實(shí)驗(yàn)表示實(shí)驗(yàn)組的吸光值；A背景表示背景組的吸光值。

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的IC50的測(cè)定將1.2.3篩選得到的活性比較好的組分（抑制率大于50%）分別稱取5.0 mg左右，稀釋5～6個(gè)濃度，按照1.2.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行IC50的測(cè)定。

1.2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的作用機(jī)制研究

將1.2.3篩選得到的活性比較好的組分（抑制率大于50%）進(jìn)行抑制作用機(jī)制研究。根據(jù)參考文獻(xiàn)[26-27]結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件做適當(dāng)調(diào)整，具體方法如下：固定PNPG濃度為2.0 mmol/L，HBR-1-4在濃度為0、0.1、0.2、0.4 mg/mL和HBR-2-4濃度為0、0.04、0.08、0.12 mg/mL的情況下，測(cè)定不同α-葡萄糖苷酶濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/mL）時(shí)的酶促反應(yīng)初速率作圖。用酶濃度（U/mL）做橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度（mmol/L·min）做縱坐標(biāo)，根據(jù)圖的特征推斷活性組分與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合方式；然后，固定α-葡萄糖苷酶濃度為0.2 U/mL，在HBR-1-4濃度為0、0.1、0.2、0.4 mg/mL和HBR-2-4濃度為0、0.04、0.08、0.12 mg/mL的情況下，測(cè)定不同PNPG 濃度（1、2、4、6、8 mmol/L）時(shí)的反應(yīng)速率。用PNPG濃度的倒數(shù)（1/S）做橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）做縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk曲線[28]，根據(jù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Vmax、Km）來(lái)推斷活性組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果取三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球菌各組分抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果

兩種不同濃度乙醇-水提取方法得到的提取物HBR-1和HBR-2及粗分得到的12個(gè)組分，進(jìn)行抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，HBR-1和HBR-2抑制α-葡萄糖苷酶的活性均大于30%，HBR-2提取物活性稍強(qiáng)于HBR-1；各組分測(cè)試結(jié)果顯示，大孔吸附樹(shù)脂60%洗脫組分即HBR-1-4和HBR-2-4具有最強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率分別是71.13%±0.05%和90.31%±0.02%，且HBR-2-4的抑制率與阿卡波糖相當(dāng)。其余組分抑制率均小于20%，活性不明顯。

表2 繡球菌不同極性組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 α-Glucosidase inhibitory activity of different polar components of S. crispa

由此推測(cè)，繡球菌中大極性成分（HBR-1-1和HBR-2-1）含量可達(dá)22%以上，不是繡球菌中抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要成分；中等偏大極性部分（HBR-1-2、HBR-1-3和HBR-2-2、HBR-2-3）和中等偏小極性部分（HBR-1-Y、HBR-1-5和HBR-2-Y、HBR-2-5）活性效果也不明顯，也不是繡球菌中的主要抑制活性組分；大孔吸附樹(shù)脂60%乙醇洗脫部分（HBE-1-4和HBR-2-4）才是其中的主要抑制活性成分，這部分含量較少，僅占0.31%～0.35%，可見(jiàn)，繡球菌中抑制α-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)是微量成分在起作用。

2.2 活性組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50

根據(jù)2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)其中有抑制活性的組分進(jìn)行IC50的測(cè)定，即HBR-1-4和HBR-2-4。通過(guò)Graphpad軟件擬合抑制曲線（見(jiàn)圖1～圖3），可以得出HBR-1-4、HBR-2-4和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50，結(jié)果如表3所示。由表3可知，用50%乙醇提取，大孔吸附樹(shù)脂60%乙醇洗脫組分，即HBR-2-4抑制α-葡萄糖苷酶的活性最強(qiáng)，其IC50為0.0927±0.0600 mg/mL，與阿卡波糖（0.0795±0.0200 mg/mL）活性相當(dāng)。

表3 繡球菌活性組分及阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50Table 3 IC50 of inhibition activity against α-glucosidase of active fractions and acarbose

圖1 HBR-1-4的抑制曲線Fig.1 Inhibition curve of HBR-1-4

圖3 阿卡波糖的抑制曲線Fig.3 Inhibition curve of acarbose

圖2 HBR-2-4的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve of HBR-2-4

2.3 活性組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用機(jī)制

酶促動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，組分HBR-1-4（濃度為0、0.1、0.2和0.4 mg/mL）和HBR-2-4（濃度為0、0.04、0.08和0.12 mg/mL）的酶濃度-反應(yīng)初速率圖是一組近似通過(guò)原點(diǎn)的直線，并且加入樣品的直線斜率全部小于未加樣品的直線斜率，由此推斷HBR-1-4和HBR-2-4與α-葡萄糖苷酶和（或）酶底物復(fù)合物是可逆性結(jié)合（見(jiàn)圖4和圖5）。

圖4 HBR-1-4的酶濃度-反應(yīng)初速率圖Fig.4 Picture of enzyme concentration-initial velocity of HBR-1-4

圖5 HBR-2-4的酶濃度-反應(yīng)初速率圖Fig.5 Picture of enzyme concentration-initial velocity of HBR-2-4

根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖結(jié)果顯示，組分HBR-1-4和HBR-2-4在不同濃度下，所有直線都與空白組相交于第二象限（見(jiàn)圖6和圖7）。通過(guò)圖6和圖7發(fā)現(xiàn)，隨著各組分樣品濃度的增加，米氏常數(shù)Km逐漸升高，而最大反應(yīng)速率Vmax逐漸降低，具體抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4，這種現(xiàn)象根據(jù)文獻(xiàn)[29-30]判斷是競(jìng)爭(zhēng)與非競(jìng)爭(zhēng)的混合型抑制類型。因此，HBR-1-4和HBR-2-4對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用屬于競(jìng)爭(zhēng)與非競(jìng)爭(zhēng)的混合型抑制類型。

表4 HBR-1-4和HBR-2-4對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of inhibition of α-glucosidase of HBR-1-4 and HBR-2-4

圖6 HBR-1-4對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk curve of HBR-1-4 for inhibiting α-glucosidase

圖7 HBR-2-4對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curve of HBR-2-4 for inhibiting α-glucosidase

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了繡球菌不同極性組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及機(jī)制。體外酶活抑制實(shí)驗(yàn)表明，50%乙醇恒濃度超聲提取3次比95%、80%、65%乙醇依次超聲提取3次所得提取物的抑制活性稍強(qiáng)，但兩種不同乙醇提取濃度得到的大孔吸附樹(shù)脂60%乙醇洗脫組分HBR-1-4（IC50值0.2666±0.0500 mg/mL）和HBR-2-4（IC50值0.0927±0.0600 mg/mL）的抑制活性差別比較大，HBR-2-4活性接近于阿卡波糖（IC50值0.0795±0.0200 mg/mL）；同時(shí)，酶促動(dòng)力學(xué)和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活性組分的機(jī)制都是競(jìng)爭(zhēng)與非競(jìng)爭(zhēng)的混合型抑制類型。

綜上所述，HBR-2-4抑制α-葡萄糖苷酶的活性結(jié)果提示，用50%乙醇恒濃度超聲提取3次的提取方法比用3次不同濃度梯度提取的方法好；用上述提取和純化方法得到的活性組分，具有開(kāi)發(fā)成輔助降血糖的保健食品或藥品的潛力。但這個(gè)組分成分復(fù)雜，發(fā)揮抑制作用的主要活性單體成分還未明確，因此，后期應(yīng)重點(diǎn)對(duì)抑制組分的常量成分進(jìn)行分離純化、微/痕量亞組分進(jìn)行液質(zhì)分析，明確其活性組分的降糖物質(zhì)基礎(chǔ)；為繡球菌的開(kāi)發(fā)利用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。